牛樟芝共生真菌AcEF007及其分离方法与流程

牛樟芝共生真菌acef007及其分离方法
技术领域
1.本发明涉及微生物技术技术领域，具体涉及一种牛樟芝共生真菌acef007 及其分离方法。


背景技术：

2.目前从天然产物中筛选生物活性成分或药物先导化合物是研究创制新药的有效途径之一，微生物是新的天然产物的重要来源，其次生代谢产物是通过多种生物合成和代谢途径而形成。植物内生菌一类侵入植物组织内部生长，但不给宿主造成明显负效应的微生物，在长期共进化过程中，共生菌与宿主植物形成了特殊的生理代谢途径，产生出各种结构的活性化合物，可以帮助宿主增强对昆虫，疾病，干旱，植物病原菌等的抵抗能力，因此研究共生菌的次生代谢产物，对我们开发新的抗菌药物有重要的作用。
3.通过长期的自然演变，病原微生物与各物种之间建立了复杂的拮抗或共生关系，不仅能引起某些特定疾病，还可作为条件致病菌，在宿主免疫力低下、机体屏障功能被破坏时发生菌群失调或细菌移位，造成机体的严重感染。为了杀死病菌或者抑制病菌活性，人们发明了抗生素和合成抗菌药物，随着抗菌药物的广泛应用，致病细菌对抗生素产生耐药性，甚至出现了多重耐药性，致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁。基于市场和研究的需要，寻找抗菌活性强、可高效利用的新生物资源成为研究的重点。
4.已有研究表明在植物内生真菌代谢产物中常发现与其宿主植物活性成分相似或相同的活性物质，其中部分物质为抗菌类物质，在苦楝、丹参、铁皮石斛、元宝草等多种植物共生菌中发现了具有抗细菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物质。牛樟芝(antrodia cinnamomea)是台湾特有珍稀药用真菌，寄生在野生牛樟 (cinnamomum kanehirai)腐朽的树干心材内壁或倒伏的树干潮湿表面，含萜类、多糖、固醇类及脂肪酸等多种生理活性物质，其有效成分具有抗癌、消炎等作用。
5.通过研究并分离得到具体的活性菌种，有利于医药产业的进一步发展。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提供一种牛樟芝共生真菌acef007及其分离方法，通过本发明获得的牛樟芝共生真菌acef007及其培养物或加工物，具有广泛的抗菌、消炎效果，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
7.为达到以上目的，本发明提供了以下技术方案：
8.牛樟芝共生真菌acef007，所述的牛樟芝共生真菌acef007的its基因序列包括seq id no.1所示的核苷酸序列。
9.进一步地，牛樟芝共生真菌acef007(phoma.sp)的保藏编号为cctcc no:m20211093，保藏名称为茎点霉属phoma.sp；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；该培养物于2021年8月27日由该保藏中心收到，并登记入册，该培养物的存活性由保藏中心于2021年9月11日检测，且测定结果为存活。
10.进一步的，本发明提供了一种分离牛樟芝共生真菌acef007的方法，包括以下步骤：
11.(1)先用自来水冲洗牛樟芝子实体36h，然后转入无菌工作台，再用3l无菌水冲洗清子实体；
12.(2)用灭菌小刀取子实体，放入离心管中，加入超纯水，然后在细胞破碎匀浆机中震荡破碎，将破碎液按十分之一、百分之一、千分之一、万分之一进行稀释，取稀释后的子实体悬浮液涂抹在mykas抗细菌培养基上，将接好的培养基放置于26℃恒温培养箱中培养；
13.(3)待培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到my培养基上培养，持续观察10d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到牛樟芝共生真菌acef007。
14.进一步地，本发明提供了制备acef007的发酵液提取物方法，包括以下步骤：
15.(1)加入1000ul的pg液体到2ml的离心管中，并在每个离心管放3颗灭菌好的钢珠，然后将已长成型的牛樟芝共生真菌acef007菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90s，然后将破碎液分别接种500ul到每个装有pg液体培养基的锥形瓶中，置于28℃，转速为150r
·
min-1
的摇床中培养8d；
16.(2)培养物菌丝体提取，发酵培养完成后，得到牛樟芝共生真菌acef007菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中加入乙酸乙酯摇匀 6min，超声30min后静置12h，将分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，获得牛樟芝共生真菌acef007培养的发酵液提取物。
17.优选的，所述步骤(2)中，于菌液中按照体积比1:1加入乙酸乙酯。
18.优选的，所述pg液体培养基包括如下组分：马铃薯浸粉5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，七水硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，维生素b
1 0.1g/l。
19.本发明利用牛樟芝筛选技术方案，分离筛选牛樟芝的共生菌，并对其进行抗菌活性检测，获取菌丝体所产生的抗菌活性化合物，得到一株具有抗菌活性的真菌acef007。通过抗菌活性实验发现，acef007菌液体提取物对肺炎克雷伯菌、铜尿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，本发明对多种致病细菌有较好的抑制作用，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
20.本发明获得的真菌acef007在my培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，生长前期菌丝是白色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较厚，颜色微微泛红，菌落呈规则的圆形状，具有特殊的生物性状，现有的同种群菌未发现与本发明具有同样性状的，该菌具有优越的抑菌性能。
附图说明
21.图1为本发明所述的acef007菌丝生长情况图；
22.图2为本发明acef007荧光显微镜下菌丝体图；
23.图3为本发明的acef007对肺炎克雷伯菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组， d表示实验组；
24.图4为本发明的acef007对铜尿假单胞菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组， d表示实验组；
25.图5为本发明的acef007对金黄色葡萄球菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；
26.图6为本发明的acef007对大肠埃希菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d 表示实验组；
27.图7为本发明的acef007对鲍曼不动杆菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组， d表示实验组；
28.图8为本发明的acef007对溶血性葡萄球菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；
29.图9本发明基于its构建了牛樟芝共生真菌acef007的系统发育树显示图。
具体实施方式
30.下面本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，本发明中使用的化学物均为分析纯级别，均可以由市场购买。
31.应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
32.实施例1
33.本发明筛选得到一种牛樟芝共生真菌acef007(茎点霉属phoma.sp)，保藏编号为cctcc no:m 20211093，保藏名称为茎点霉属phoma.sp；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；该培养物于2021年8月27日由该保藏中心收到，并登记入册，该培养物的存活性由保藏中心于2021年9月11日检测，且测定结果为存活。
34.该菌株是从牛樟芝子实体中分离、纯化得到的，如图1、图2所示，真菌在my 培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，生长前期菌丝是白色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较厚，颜色微微泛红，菌落呈规则的圆形状，如图3-8所示，其菌株培养物的发酵液提取物对肺炎克雷伯菌、铜尿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，检测的致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
35.实施例2
36.牛樟芝共生真菌acef007菌株的分离和鉴定
37.1、牛樟芝共生菌的分离
38.先用自来水冲洗牛樟芝子实体36h，然后转入无菌工作台，再用3l无菌水冲洗清子实体。
39.用灭菌小刀取2g牛樟芝子实体放入2ml的离心管中，加入500μl的无菌水，然后在细胞破碎匀浆机中破碎，将破碎液按十分之一、百分之一、千分之一、万分之一稀释后，将200ul悬浮液涂板接种在mykas(抗细菌)培养基上，将接好的培养基放置于26℃恒温培养箱中培养；待培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到my培养基上培养，持续观察10d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到牛樟芝共生真菌acef007。
40.mykas抗细菌培养基：酵母麦芽浸粉肉汤21g/l 琼脂15g/l 氨苄青霉素 50ug/ml 卡那霉素50ug/ml；my培养基：酵母麦芽浸粉肉汤培养基21g/l 琼脂15g/l(美国，bd公司))
41.2、牛樟芝共生菌的鉴定
42.(1)形态的鉴定
43.真菌在my培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，生长前期菌丝是白色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较厚，颜色微微泛红，菌落呈规则的圆形状。
44.(2)dna提取
45.试验前先ctab水浴65℃30min以上，提前20min打开速冻离心机；取牛樟芝共生菌的分离纯化培养的菌丝体于2ml离心管中，加入3颗灭菌好的钢珠，并将离心管放到装有液氮的不锈钢罐中浸泡冷却6min，用破碎机破碎1.5min，将菌丝体打碎；离心管中加入1ml的ctab、20ulβ-巯基乙醇，摇匀(10min)，放到水浴锅水浴5h，每隔10min震荡摇匀1次；水浴结束后，放入4℃
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12000r/min 速冻离心机离心10min；取上清液1ml转移到一个新的2ml离心管中，加入 1ml(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，振摇10min，离心10min(重复两次)；取上清液1ml转移到一个新的2ml离心管中，加入1ml(氯仿：异戊醇＝24：1)，震荡摇匀10min，放入4℃
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12000r/min速冻离心机离心10min；取上清液500ul 转移到一个新的1.5ml离心管中，加入50ulnaac和1ml无水乙醇(-20℃)，摇匀做好标记后，放入-20℃冰箱沉淀12h；沉淀完放入4℃
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12000r/min速冻离心机离心10min，加入500ul 75％乙醇，轻轻摇晃5-10次，静置3min，倒掉乙醇完成洗脱(共洗脱2次)；加入500ul无水乙醇洗脱1次(静置3min后倒掉无水乙醇)，放入4℃
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12000r/min速冻离心机离心3min，倒掉无水乙醇，放置干；加入80ul洗脱缓冲剂(te buffer)，瞬时离心1min，得到真菌acef007基因组dna。
46.(3)its分析鉴定
47.用真菌通用引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)扩增真菌rdna的间隔序列(含its1 区、5.8s区、its2区)序列，所得得its测序序列如seq id no.1所示。
48.(4)构建发育树
49.如图9所示，基于its构建了牛樟芝共生真菌acef007的系统发育树，综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与茎点霉属(phoma.sp)亲缘关系最近，所以将牛樟芝共生真菌acef007鉴定为茎点霉属(phoma.sp)。
50.实施例3
51.牛樟芝共生真菌acef007活性物质的制备
52.1、液体发酵培养
53.液体发酵培养基pg：马铃薯浸粉5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，七水硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，维生素b1 0.1g/l，纯净水1l，培养基分装至100ml三角瓶。
54.加入1000ul的pg液体到2ml的离心管中，并在每个离心管放3颗灭菌好的钢珠，然后将已长成型的牛樟芝共生真菌acef007菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90s，然后将破碎液分别接种500ul到每个装有pg液体培养基的锥形瓶中，置于28℃，转速为150r
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的摇床中培养8d。
55.2、培养物菌丝体提取
56.发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液。用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中加入乙酸乙酯(1:1)摇匀6min，摇匀后静置12h，然后将分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，得到牛樟芝共生真菌acef007培养的发酵液提取物。
57.试验例1
58.牛樟芝共生真菌acef007培养物的发酵液提取物的抗菌活性检测
59.1、致病细菌活化及稀释
60.将实验室保存的致病菌缓慢芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、铜尿假单胞菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌等致病细菌分别取少量 (5～6ul)加入2ml离心管中，再加入700ul的lb液体培养基，然后将离心管放入37℃，转速为180r
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恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，取出活化好的细菌进行稀释1/10倍(若活化好的细菌置于4℃保存超过12h则不用稀释)。
61.2、阳性对照所用抗生素及配制
62.氨苄青霉素(ampicillin)(批号：0339，纯度：95％)，购于昆明硕阳科技有限公司。精密称取氨苄青霉素50mg，分别置于离心管中，加入1ml dmso溶液配置成50mg/ml的抗生素dmso溶液，备用。
63.3、滤纸片法检测抗菌活性
64.配制luria-bertani固体培养基，将灭菌后还未凝固的培养基倒入20ml 于培养皿中冷却、凝固，吸取300ul的相应供试菌悬液滴加到固体培养基上，用无菌棉拭子分别均匀涂布培养基表面，制成含菌平板，然后取适量牛樟芝共生真菌acef007发酵液提取物，称重后加入适量dmso(二甲亚砜)溶液，稀释到 50mg/ml，待含菌lb平板晾干后，将直径5mm的滤纸圆片，经高压灭菌处理后干燥，分别滴加10ul供试液作为试验样片，滴加pg纯培养基和氨苄青霉素样片为阳性对照，dmso液作为阴性对照样片，用无菌镊子将试验样片和3个对照样片贴放于每个培养皿表面，做好标记后盖好培养皿，将培养基正放置于置于 37℃恒温培养箱中培养12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。结果牛樟芝共生真菌acef007培养物的发酵液提取物(50mg/ml)的抗细菌活性如表1所示：
65.缓慢芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、铜尿假单胞菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌
66.表1牛樟芝共生真菌acef007提取物抗菌活性与阳性对照比较
67.68.通过表1、抗菌效果图3-8可以看出，本发明筛选得到一种牛樟芝共生真菌 acef007(茎点霉属phoma.sp)，其菌株培养的发酵液提取物对肺炎克雷伯菌、铜尿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
69.除了通过培养菌株进行发酵液提取，其他培养或者加工方法，如牛樟芝共生真菌acef007细胞的超声裂解上清；牛樟芝共生真菌acef007细胞的超声裂解沉淀，基于真菌acef007的抗菌效果下，其加工物或者培养物均具备相应的抗菌活性，使用本菌制备相关抗菌活性药物、菌剂等，均在本发明的保护范围内。
70.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。