高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌WX4-1及应用的制作方法

高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1及应用。


背景技术：

2.四甲苯，是一种有机化合物，是带有甜气味的无色固体。其为白色单斜晶体，溶于乙醇、乙醚、苯，不溶于水。四甲苯是重要的精细化工原料，经氧化得到的苯四甲酸二酐与二胺类化合物聚合可制成耐高温、绝缘性能良好的聚酰亚胺工程塑料，它是微电子、航天及军工等高等科技工业的重要材料。四甲苯也可作为医药、染料的中间体。副产的高级芳烃溶剂油广泛应用于农药、轻工、机械等行业，萘和甲基萘的农药、医药及染料等工业的重要原料。
3.四甲苯是c10重芳烃中利用价值较高的组分，主要用于生产苯四酸二酐(pmda)。苯四甲酸二酐的主要用途有与4,4－二氨基联醚反应生产新型耐高温工程塑料与绝缘材料聚酰亚胺(pi)。聚酰亚胺以优异的电绝缘性能、耐高温性能、耐辐射性能广泛应用于宇航、原子能、机电等工业生产中。另外，pmda还是高品质增塑剂、固化剂及粉末涂料消光剂的重要原料，需求量越来越大，四甲苯的需求量也随之成倍增加。其遇明火、高温、氧化剂易燃、燃烧产生有刺激烟雾。该物质对环境有危害，进入环境会对水体和大气造成污染。
4.现有通过催化剂催化去除、芬顿氧化和微生物降解等方法去除四甲苯。其中利用催化剂催化去除占地空间小，去除效率高，但是副产物多，且成本高。芬顿氧化对环境友善、占地空间小、操作弹性大、初设成本低、氧化能力强。但是反应过程中有fe(oh)3的产生，并且cod达一定的去除率后，无法再继续去除有机物，易造成h2o2用药的消耗。在这些方法中，生物修复由于其潜在的成本效益和生态友好特性，将成为有效消除污染环境中四甲苯的有吸引力的替代方法。利用生物法处理四甲苯废水具有能耗低、反应条件温和且效率较高，更加符合国家节能减排及可持续发展的战略，但是国内外对于四甲苯降解功能菌株的研究还鲜有报道，因此本研究为四甲苯降解筛选可用菌株，进行四甲苯生物降解，具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一株高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1及应用。
6.本发明的具体技术方案为：
7.第一方面，本发明提供了一株高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌，微生物分类命名为硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1，已在2021年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学，邮政编码为430072；保藏编号为cctcc no:m 202101033，所述wx4-1的16s rrna序列如seq id no.1所示。
8.本发明的硝基还原假单胞菌wx4-1来源于平湖石化有限责任公司双氧水制作工艺废水池中的悬浮污泥中，该硝基还原假单胞菌经过分离及纯化获得，可利用四甲苯作为其生长的唯一碳源。
9.所述硝基还原假单胞菌wx4-1的特征为：菌落颜色为黄色，圆形不透明，大而平坦，表面光滑湿润，扫描电镜下观察该菌体的形态为杆状。
10.第二方面，本发明提供了一株以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液及含菌悬液的制备方法。
11.所述含菌悬液以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1经斜面培养、种子培养、发酵后制成。
12.所述含菌悬液的制备方法包括以下具体步骤：
13.(1)斜面培养：将高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1接种至斜面培养基上，在30-35℃下培养1-3d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
·
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，nh4cl 0.2g
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，mgso4·
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，cocl2·
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，四甲苯0.1g
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，琼脂20g
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，ph值7.0-8.0；
14.(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至lb培养基，在30-35℃下培养18-24h，获得种子液；所述lb培养基终浓度组成为：nacl 10g
·
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，酵母浸粉5g
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，蛋白胨10g
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，ph值7.0-8.0；
15.(3)发酵：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，在30-35℃、160-180rpm恒温摇床上振荡培养18-24h，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，h4cl 0.2g
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6h2o 0.0085g
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，四甲苯0.1g
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，ph值7.0-8.0。
16.第三方面，本发明提供了一种以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液在降解四甲苯中的应用及其具体方法。
17.具体方法为：将所述含菌悬液接种至含有终浓度为100mg
·
l-1
的四甲苯的液体选择培养基中，以四甲苯为唯一碳源，在30-40℃、160-300rpm恒温摇床上振荡培养，获得培养液；所述液体选择培养基的终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，四甲苯0.1g
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，ph值7.0-8.0。
18.本发明的有益效果为：本发明提供了一株高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1及降解四甲苯的应用，该菌株在72h内能对初始浓度为100mg
·
l-1
的四甲苯降解率达到85.5％，该降解菌的发现对工业废水中四甲苯的高效净化具有重要意义。
附图说明
19.图1为菌株wx4-1的扫描电镜图；
20.图2为菌株wx4-1的系统发育树图；
21.图3为菌株wx4-1对四甲苯的降解率曲线图；
22.图4不同初始浓度下四甲苯降解率和菌密度(od
600
)变化图；
23.图5不同温度下四甲苯降解率和菌密度(od
600
)变化图；
24.图6不同ph下四甲苯降解率和菌密度(od
600
)变化图；
25.图7不同接种量下四甲苯降解率和菌密度(od
600
)变化图。
具体实施方式
26.本发明提供了一株高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌，微生物分类命名为硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1，已在2021年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，邮政编码为430072；其保藏编号为cctcc no:m 20211033；所述wx4-1的16s rrna序列如seq id no.1所示。
27.本发明提供了一种以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液，所述含菌悬液以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1经斜面培养、种子培养、发酵后制成。
28.所述含菌悬液的制备方法包括以下具体步骤：
29.(1)斜面培养：将高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1接种至斜面培养基上，在30-35℃下培养1-3d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，nh4cl 0.2g
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，四甲苯0.1g
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，琼脂20g
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，ph值7.0-8.0；
30.(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至lb培养基，在30-35℃下培养18-24h，获得种子液；所述lb培养基终浓度组成为：nacl 10g
·
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，酵母浸粉5g
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，蛋白胨10g
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，ph值7.0-8.0；
31.(3)发酵：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，在30-35℃、160-180rpm恒温摇床上振荡培养18-24h，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，h4cl 0.2g
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，feso4·
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，znso4·
7h2o 0.003g
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，cocl2·
6h2o 0.0085g
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，四甲苯0.1g
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，ph值7.0-8.0。
32.本发明提供了一种以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液在降解四甲苯中的应用。
33.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
34.四甲苯的液体选择培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，四甲苯0.1g
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。
35.四甲苯的固体选择培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nah2po4·
2h2o 1.13g
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，nh4cl 0.2g
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，四甲苯0.1g
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，琼脂20g
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36.实施例1：硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1的分离、纯化及鉴定
37.1.硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1的分离及纯化
38.硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1是从平湖石化有限责任公司双氧水制作工艺废水池中的悬浮污泥中筛得，具体步骤如下：
39.(1)采样：从平湖石化有限责任公司双氧水制作工艺废水池中的悬浮污泥中分别多点采样，作为筛选高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1的原材料；
40.(2)菌株分离：取适量双氧水制作工艺废水池中活性污泥，静置24h后，取10ml上清液接种至含100ml无菌水的250ml培养瓶中，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养30min，停止振荡后静置2min，取10ml悬浮液接种至含100ml四甲苯的液体选择培养基中，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养3d，重复5次；用无菌水将上述菌液稀释10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
倍；将所得到的菌液用四甲苯固体选择培养基经多次平板划线分离纯化，得到单菌落，记为菌株wx4-1。
41.2.菌株wx4-1的鉴定
42.a、菌株wx4-1的生理生化特征
43.对所获得的菌株wx4-1进行形态观察和生理生化鉴定，菌落颜色为黄色，圆形不透明，大而平坦，表面光滑湿润；扫描电镜下观察该菌体的形态为杆状，如图1所示，生长最适ph值为7.0-8.0，最适温度为30-35℃。
44.b、菌株wx4-1的16s rrna序列分析
45.采用3s柱离心式环境样品dna回收试剂盒(v2.2，浙江天科生物科技有限公司)提取和纯化菌株wx4-1的dna，4℃保存；采用细菌通用引物27f(正向引物27f，5
’‑
aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3’)和1492r(反向引物1492r,5
’‑
ggt tac ctt gtt acg act t-3’)pcr扩增16s rrna。
46.pcr反应体系(50ul)包括模板dna 1.75μl，引物27f、1492r各1μl，mgcl2(25mmol
·
l-1
)3μl，taq酶(5u
·
μl-1
)0.25μl，pcr缓冲液(10
×
)5μl，dntp(2.5mmol
·
l-1
)4μl，重蒸水34μl。
47.pcr扩增程序：94℃预变性4min；4℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保持10min。
48.将pcr产物进行16s rrna序列测试(浙江天科)，菌株wx4-1的16s rrna序列如seq id no.1所示。
49.将菌株wx4-1的16s rrna序列上传到同genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于pseudomonas属，与pseudomonas nitroreducens同源性最高，达到99.78％，图2为菌株wx4-1的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定菌株wx4-1属于pseudomonas nitroreducens，因此，菌株wx4-1命名为硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：m 20211033，保藏日期2021年8月16日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编地址：430072。
50.实施例2：以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液的制备过程
51.所述含菌悬液的制备过程：
52.(1)斜面培养：将高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1接种至斜面培养基
上，在30℃下培养3d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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，nh4cl 0.2g
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，ph值7.0；
53.(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至lb培养基，在30℃下培养18h，获得种子液；所述lb培养基终浓度组成为：nacl 10g
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，酵母浸粉5g
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，蛋白胨10g
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，ph值7.0；
54.(3)发酵：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养24h，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：k2hpo4·
2h2o 4.25g
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2h2o 1.13g
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，h4cl 0.2g
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7h2o 0.2g
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6h2o 0.0085g
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，四甲苯0.1g
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，ph值7.0。
55.实施例3：硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1对四甲苯降解性能的检测和降解条件筛选
56.1.硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1对四甲苯降解性能的检测
57.将实施例2所制备的以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液接种至含有终浓度为100mg
·
l-1
的四甲苯的液体选择培养基中，以四甲苯为唯一碳源，使培养基的初始ph值为7.0，取100ml置于250ml三角瓶中，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养，获得培养液(作为实验组)；
58.同时以装有100ml含有终浓度为100mg
·
l-1
的四甲苯的液体选择培养基的250ml三角瓶，使培养基的初始ph值为7.0，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养作为空白对照组。
59.培养过程中，间隔12小时分别提取实验组和空白对照组的培养液，测得四甲苯的浓度并绘制四甲苯降解率图，如图3所示。检测方法如下：
60.四甲苯浓度的检测采用气相色谱法：间隔12小时取3ml培养液，加入5ml的苯进行萃取，振荡混匀后静置，取2ml上层有机相，再通过孔径为0.22μm的一次性有机针筒过滤器过滤去除剩余微生物，然后滤液用气相色谱法测出四甲苯的浓度；气相色谱法使用气相色谱仪：agilent 8890型，附带fid，美国安捷伦公司。
61.从图3中可以看出硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1对四甲苯有较好的降解效果，在72h对初始浓度为100mg
·
l-1
的四甲苯的降解率达到85.5％。
62.2.四甲苯初始浓度对硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1降解四甲苯的影响检测
63.将实施例2制备得到的以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液分别接种至含不同四甲苯终浓度(50mg
·
l-1
、100mg
·
l-1
、200mg
·
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、300mg
·
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、400mg
·
l-1
)的液体选择培养基中，以四甲苯为唯一碳源，使培养基的初始ph值为7.0，分别取100ml，分别置于5个250ml三角瓶中，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养72h后测得四甲苯的浓度和菌密度(od
600
)，测试结果如图4所示。
64.菌密度(od
600
)的检测方法如下：以岛津uv2401型紫外-可见光分光光度计，在波长600nm处测定反应液的吸光度。
65.结果如图4所示，当初始浓度大于10mg
·
l-1
时，由于刚开始时培养基中四甲苯为唯一碳源，初始浓度多少直接影响到底物降解，降解率随着初始浓度的增加而缓慢上升，当初始浓度为100mg
·
l-1
时，菌株对四甲苯的降解率达到87％，而随着初始浓度的继续增加，高浓度的污染物对菌株产生一定的毒性，因此降解率出现减小的现象。由图4可知，菌株wx4-1的最佳初始浓度为为100mg
·
l-1
左右；并且通过菌密度(od
600
)的测定值可以看出细菌生长在初始浓度为为100mg
·
l-1
时最好。
66.3.硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1对四甲苯降解的最佳温度条件筛选
67.将实施例2制备得到的以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液分别接种至含四甲苯终浓度为100mg
·
l-1
的液体选择培养基中，使培养基的初始ph值为7.0，分别取100ml置于5个250ml三角瓶中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃或40℃，160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养72h后测得四甲苯的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图5所示。
68.结果如图5所示：菌株wx4-1对高温的环境适应性相对较差，当温度为30℃时，菌株wx4-1对四甲苯的降解效果最好，达到85％；并且通过菌密度(od
600
)的测定值可以看出细菌生长在温度为30℃时最好。
69.4.硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1对四甲苯降解的最佳ph值条件筛选
70.将实施例2制备得到的以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液分别接种至含四甲苯终浓度为100mg
·
l-1
的液体选择培养基中，，分别取100ml置于5个250ml三角瓶中，分别调节培养基ph值为5.0、6.0、7.0、8.0或9.0，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养72h后测得四甲苯的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图6所示；
71.结果如图6所示：菌株wx4-1对酸碱的环境适应性相对较差，当ph值为7.0时，菌株wx4-1对四甲苯的降解效果最好，达到83％；并且通过菌密度(od
600
)的测定值可以看出细菌生长在ph 7.0时最好。
72.5.硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)wx4-1对四甲苯降解的最佳接种量的筛选
73.将实施例2步骤(3)中种子液以体积浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％的接种量接种至发酵培养基，实施例2的其他步骤不变，制备接种量为1％、2％、3％、4％、5％的以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液。
74.分别将接种量为1％、2％、3％、4％、5％的以高效降解四甲苯的硝基还原假单胞菌wx4-1为活性成分的含菌悬液接种至四甲苯终浓度为100mg
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l-1
的液体选择培养基中，分别取100ml置于5个250ml三角瓶中，使培养基的初始ph值为7.0，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养72h后测得四甲苯的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图7所示；
75.结果如图7所示：当接种量大于1％时，由于刚开始时培养基中营养物质充足，接种量多少直接影响到底物降解，降解率随着接种量的增加而缓慢上升，当接种量为3％时，降解率达到86％，而随着接种量的继续增加，在降解菌之间形成了对营养物质的竞争关系，因此降解率率出现减小的现象；菌株wx4-1的最佳接种量为3％左右，并且通过菌密度(od
600
)
的测定值可以看出细菌生长在接种量3％时最好。