基于m6a特征基因的肝癌预后风险模型及其应用
技术领域：
：1.本发明涉及生物医学领域，涉及基于m6a特征基因的肝癌预后风险模型及其应用。
背景技术：
：：2.肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因。由于起病隐匿，预后差，缺乏特异性，多数患者确诊时已到了晚期。传统的治疗手段，如手术切除、肝移植、放疗、化疗等治疗作用有限，未能使患者明显受益。只有少数患者受益于如索拉非尼的一线治疗，而又在六个月内出现了显著的耐药性。晚期肝癌的联合治疗临床试验包括imbrave150ⅲ期(阿替利珠单抗 贝伐珠单抗联合治疗)，orient-32ⅲ期(信迪利单抗 贝伐珠单抗联合治疗)和keynote-524ⅰb期研究(帕博利珠单抗 仑伐替尼联合治疗)，以上联合治疗已经将中位无进展生存期(medianprogression-freesurvival，mpfs)提高到4.6～9.3个月。3.肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)由各种免疫细胞、炎症细胞、内皮细胞、成纤维细胞和非细胞成分(包括细胞因子和趋化因子)组成。tme在抗肿瘤、免疫逃逸、肿瘤复发和转移中起着至关重要的作用。4.n6-甲基腺苷(m6a)是mrna和非编码rna中的一种常见rna修饰，可以影响rna剪接、翻译、稳定性以及某些非编码rna的表观遗传影响。m6a的形成和功能由甲基化转移酶(methyltransferase，也可称为writers)、去甲基化酶(也可称为erasers)和甲基化阅读蛋白(也可称为readers)等共同参与。其中甲基化转移酶包括mettl3/14、wtap和kiaa1429等，主要作用就是催化mrna上腺苷酸发生m6a修饰。而去甲基化酶包括fto和alkhb5等，作用是对已发生m6a修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6a修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如rna降解、mirna加工等。越来越多的证据表明，m6a修饰可调节mrna代谢、转运、稳定、降解，并进一步影响细胞生物学功能，如细胞增殖、干细胞分化、侵袭、转移和肿瘤稳态。此外，m6a修饰在调节肿瘤免疫微环境(time)中起着至关重要的作用。然而，m6a在hcc肿瘤免疫和血管生成微环境中的综合功能尚未得到充分认识。5.尽管目前fda批准的肝癌(hcc)抗血管生成药物索拉非尼(sorafenib)和仑伐替尼(lenvatinib)取得了不错疗效，但大多数患者很快就会产生耐药性。因此，亟需要一种可靠的预测指标，指导肝癌个体化治疗。技术实现要素：6.我们在tcga-lihc训练集中构建了一种基于m6a调控的可预测免疫和抗血管治疗疗效的新型肝癌预后风险模型，并在tcga-lihc验证集和gse76427中进行了验证。我们已经证明，高m6asig评分与预后不良相关。7.另外，在两个独立的免疫治疗数据集中证实了m6asig评分的预测免疫治疗疗效的效果。另外，还验证了m6asig评分在预测药物敏感性中的应用；8.m6asig评分与抗血管生成药物敏感性呈负相关，另外，还验证了vegfr和m6asig联合后预测肝癌患者预后的效果。9.第一方面，本发明提供了一种肝癌(肝细胞癌，hepatocellularcarcinoma，hcc)的预后标志物组合、包括所述预后标志物组合预后模型、以及该模型的构建方法。10.所述预后标志物组合包括：b2m、lcat、smox、tll2和dph2。11.优选地，所述预后模型根据以下公式计算风险值：12.风险值(m6asig评分)：具体为13.m6asig-score＝0.35*smox 0.38*tll2 1.37*dph2–1.02*b2m–0.21*lcat14.所述“风险值”在本发明中亦称为“m6asig评分”、“m6asig-score”、“m6a评分”。15.另一方面，本发明还提供了检测b2m、lcat、smox、tll2和dph2中至少一种的试剂、前述预后模型在以下方面中的应用：16.1)预测肝癌患者的预后，17.2)预测抗pd-1/pd-l1治疗的疗效中的应用；所述抗pd-1/pd-l1治疗包括施用阿替利珠单抗。18.优选地，所述抗pd-1/pd-l1治疗的疗效是针对任何癌症患者；更具体地，是针对转移性尿路上皮癌患者或黑色素瘤患者接受抗pd-1/pd-l1治疗的疗效。19.3)判断患者对抗血管生成药物(anti-angiogenicdrugs)的药物敏感性中的应用；所述药物包括索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)和培唑帕尼(pazopanib)；所述m6asig-score越高，索拉非尼、达沙替尼和培唑帕尼的ic-50值越高，也即该患者对药物的敏感性约低，也就是患者接受索拉非尼、达沙替尼和培唑帕尼的疗效越差。20.本发明所述预后的指标可以包括但不限于以下指标：1-5年总体存活率(1-5yearsoverallsurvivalrate，os)、无进展生存期(progression-freesurvival，pfs)、1-5年无进展生存(1-5yearspfs)、疾病进展时间(timetoprogress，ttp)、无病生存期(disease-freesurvival，dfs)、治疗失败时间(timetotreatmentfailure，ttf)、客观缓解率(objectiveresponserate，orr)、应答率(responserate，rr)、完全应答率(completeresponse，cr)、部分应答率(partialresponse，pr)、疾病稳定(stabledisease，sd)、疾病进展(progressivedisease，pd)。21.具体地，本发明预后包括1、2、3、4、5年的总体生存期；所述预后还包括cr/pr、sd/pd；所述“/”代表“或”。22.本发明所述“tis、ips、tide”皆为常用的癌症分期标准；所述ips(immunophenoscore)是预测免疫治疗反应的生物标志物，用于根据四组免疫相关分子评估肿瘤免疫原性的决定因素：mhc、免疫检查点、效应细胞和抑制细胞；所述tis(tumorinflammationsignature)是一种18个基因的分期标准，用于预测抗pd-1抑制剂的治疗效果，反映了tme中存在抑制的适应性免疫反应(抗原呈递、ifn-γ和细胞毒性细胞)；所述tide(tumorimmunedysfunctionandexclusion)用于评估两种不同的肿瘤免疫逃逸机制，即细胞毒性t淋巴细胞(ctl)功能障碍和ctl免疫抑制因子排斥，tide评分越高的患者越容易逃避抗肿瘤免疫，从而导致免疫治疗的有效性越低。23.另一方面，本发明还提供了前述模型与vegfr联合后在预测肝癌患者预后中的应用。高vegfr而低m6asig评分的患者具有最好的预后，总体生存率最高。24.根据以上应用，本发明还提供了以下产品：25.一方面，本发明提供了一种预测肝癌预后的试剂盒，所述试剂盒包括检测b2m、lcat、smox、tll2和dph2表达水平的试剂。26.进一步，所述试剂为检测所述生物标志物转录的rna的量的试剂。27.进一步，所述试剂为检测所述生物标志物转录的mrna的量的试剂。28.进一步，所述试剂为检测所述生物标志物编码的蛋白质(多肽)的量的试剂。29.另一方面，本发明提供了一种预测肝癌预后的装置，其特征在于，所述装置包括：30.1)用于输入生物样品中生物标志物的水平的输入模块，所述生物标志物选自b2m、lcat、smox、tll2和dph2；31.2)用于计算患者的预后的计算模块；32.3)用于输出预测结果的输出模块。33.以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。34.术语“生物标志物”指患者表型(例如病理学状态或对治疗剂的可能的反应性)的指示物，其可以在该患者的生物样品中检测到。本发明所述“生物样品”包括：活检组织、外周血、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液。35.具体地，本发明所述生物标志物包括b2m、l-cat、smox、tll2和dph2，所述生物标志物构成的预测模型基于所述生物标志物的表达水平，可以预测肝癌患者的预后、预测抗pd-1/pd-l1治疗的疗效、以及判断抗血管生成药物(anti-angiogenicdrugs)的疗效。本发明所述“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的表达量。36.本文所述的基因表达水平的检测可以采用本领域已知的测定方法，包括但不限于检测所述生物标志物的rna转录物的量或所述生物标志物编码的多肽的量的方法。37.在本文中，所述生物标志物的rna转录物可通过本领域已知的方法转化为与其互补的cdna，通过测定互补cdna的量可以获得rna转录物的量。在本文中，rna转录物可以通过例如杂交、扩增、测序的方法来检测和量化，包括但不限于将rna转录物与探针或者引物杂交的方法，通过基于聚合酶链式反应(pcr)的各种定量pcr技术或测序技术检测rna转录物或其对应cdna产物的量的方法。所述定量pcr技术包括但不限于荧光定量pcr、实时pcr或半定量pcr技术。所述测序技术包括但不限于sanger测序、二代测序、三代测序和单细胞测序等。38.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂可以是以下任意方法中所使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法；39.优选地，所述检测mrna表达量的试剂可以是以下任意方法中使用到的试剂：基于pcr的检测方法、southern杂交方法、northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、dna微阵列方法、aso法、高通量测序平台方法。40.本发明所述“试剂盒”是包含至用于特异性检测本发明的生物标志基因或蛋白质的制成品(例如，包装或容器)。在某些实施方案中，该制成品作为用于进行本发明的方法的单位推销、分销或销售。41.本发明所述“输入模块”包括鼠标、键盘、触摸屏显示器、一个或多个按钮、一个或多个开关、一个或多个触发器等等中的一个或多个。lihc验证集中的生存差异分析，b：dph2在gse76427中的生存差异分析，c：dph2与索拉非尼相关性分析；d：lcat在tcga-lihc验证集中的生存差异分析，e：lcat在gse76427中的生存差异分析，f：lcat与索拉非尼相关性分析；g：tli2在tcga-lihc验证集中的生存差异分析，h：tli2在gse76427中的生存差异分析，i：tli2与索拉非尼相关性分析。63.图19是血管相关基因特征与索拉非尼-ic50之间的相关性分析，a：m6asig评分与血管相关基因特征的相关性分析，b：vegfr与索拉非尼-ic50的相关性分析，c：fgf与索拉非尼-ic50的相关性分析，d：pdgfr与索拉非尼-ic50的相关性分析，e：vegf与索拉非尼-ic50的相关性分析，f：fgfr与索拉非尼-ic50的相关性分析，g：pdgf与索拉非尼-ic50的相关性分析，h：angiogenesis(血管生成)与索拉非尼-ic50的相关性分析。64.图20是vegfr高低信号组的生存差异分析。65.图21是vegfr与m6asig评分联合进行生存差异分析。66.图22是在肝癌数据集中验证vegfr与m6asig评分联合的预后roc检验效能评价，a：1年，b：2年，c：3年。具体实施方式67.实施例1、构建基于m6a特征基因的肝癌预后风险模型，并测试其预后效果68.模型构建方法：69.1、通过文献获取24个m6a调控的关键基因。24个基因分别是15个readers：eif3a，elavl1，fmr1，hnrnpa2b1，hnrnpc，igf2bp1-3，lrpprc，rbmx，ythdc1/2；7个writers：cbll1，mettl3/14，rbm15/15b，wtap，zc3h13；2个erasers：alkbh5，fto。70.2、通过tcga和geo获取包含生存和基因表达的肝癌数据，本研究共纳入593份hcc样本，包括来自tcga-lihc数据集(非肿瘤＝50，肿瘤＝375)和gse76427数据集(非肿瘤＝52，肿瘤＝115)的样本。rna转录组数据(fpkm格式)被转换为百万/千碱基(tpm)的转录组格式。使用sva包消除数据集之间的批量效应(batcheffect)。71.tcga数据按1：1分为训练集和测试集，geo数据gse76427作为独立验证集。72.3、利用“pam”算法对24个关键基因进行m6a的表达矩阵聚类，鉴定出3种m6a修饰模式(图1a，b)。3种m6a修饰模式分别对应了肿瘤免疫中的“免疫激活型”、“基质激活型”和“免疫荒漠型”。73.4、利用“limma”包筛选3种m6a修饰模式的显著差异基因(校正p＜0.001；图2a)，共得到420个m6a相关的差异表达基因(degs)。74.5、进一步通过单因素cox，筛选出肝癌预后相关的61个预后基因，(p《0.05)。75.6、在tcga训练集中，通过lasso回归得到10个差异表达基因(图2b-c)，多因素cox风险回归得到5个核心基因。以上基因的多因素森林图如图3所示。76.基于以上筛选到的基因，构建基于m6a修饰的肝癌预后风险模型。该模型的具体公式是：77.m6asig-score＝0.35*smox 0.38*tll2 1.37*dph2–1.02*b2m–0.21*lcat，78.m6asig-score代表风险值。79.通过“survival”包中的“surv_cutpoint”功能确定cutoff值，并将各数据集中的患者分为高低得分两组，得到高分患者138例，低分患者347例。进行kaplan-meier生存分析，并对1、2、3、5年生存率生成roc曲线。80.tcga训练集中生存分析结果如图4a所示，预后效果roc曲线如图4b所示。tcga测试集中生存分析结果如图5a所示，预后效果roc曲线如图5b所示。gse76427训练集中生存分析结果如图6a所示，预后效果roc曲线如图6b所示。81.实施例2、风险模型与免疫疗效评分的相关性分析82.与pd-l1、tmb和msi一样，ips、tis和tide最近也被广泛应用于预测免疫疗效。分析本发明所提供的模型与以上评分标准的相关性，我们的研究表明，低m6asig评分组的tis和ips显著升高、tide(exclusion、mdsc和m2)显著降低。具体如图7所示(均p《0.001)。83.以pd-1/pd-l1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂(immune-checkpointinhibitors，icis)治疗在癌症治疗方面取得了重大突破。本发明通过外部免疫治疗数据集，验证了本模型预测免疫治疗疗效的准确性。外部数据集分别是imvigor210数据集、liu数据集。84.以上所述imvigor210数据集中包括348例接受阿替利珠单抗(atezolizumab，抗pd-l1单抗)治疗的转移性尿路上皮癌患者，具体发表文章为mariathasans,turleysj,nicklesdetal.tgfbetaattenuatestumourresponsetopd-l1blockadebycontributingtoexclusionoftcells,nature2018；554:544-548；85.所述liu数据集中包括121名接受抗pd-1/pd-l1治疗的黑色素瘤患者；具体发表文章为liud,schillingb,liudetal.integrativemolecularandclinicalmodelingofclinicaloutcomestopd1blockadeinpatientswithmetastaticmelanoma,naturemedicine2019；25:1916-1927。86.imvigor210数据集中的研究显示：imvigor210-免疫治疗数据集中，m6asig-score与免疫治疗预后显著相关；免疫治疗获益患者的m6asig-score显著低于无效组。m6asig评分较低的患者总体生存概率显著延长(图8a，p《0.001，对数秩检验)，cr/pr(完全缓解和部分缓解)患者的m6asig评分显著高于sd/pd(病情稳定和进展)患者(图8b，p《0.001，wilcoxon秩和检验)，免疫疗效预测效果roc曲线如图9所示。liu数据集中的研究也有类似结果(图10a，p《0.001，对数秩检验；图10b，p＝0.019，wilcoxon秩和检验)，免疫疗效预测效果roc曲线如图11所示。87.实施例3、风险模型与血管相关评分、药物敏感性的相关性分析88.为探讨m6asig-score在预测患者对抗血管生成药物的敏感性的准确性。用prrophetic包计算gdsc数据集(genomicsofdrugsensitivityincancer)中抗血管生成药物的ic50。我们对m6asig评分与索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)和培唑帕尼(pazopanib)的ic50进行了spearman相关分析。89.结果显示，m6asig-score与索拉非尼(图12a)、达沙替尼(图12b)和培唑帕尼(图12c)的ic50显著正相关。提示m6asig-score越高，抗血管生成药物的疗效越差。也就是m6asig-score越低的患者更有可能在抗血管生成药物的治疗中获益。90.实施例4、对5个核心基因的研究91.为探讨5个hub基因在免疫治疗和抗血管生成治疗中的作用机制。我们首先探讨了5个hub基因与免疫细胞浸润之间的相关性。5个核心基因与免疫细胞浸润相关性(图13)，提示b2m基因表达与cd8 t细胞和m1型巨噬细胞浸润显著正相关，而smox与抑制性免疫细胞treg显著正相关。这提示b2m高表达是免疫治疗的优效人群，而smox高表达患者免疫治疗效果较差。92.在imvigor210免疫治疗数据集、liu数据集同样验证了b2m高表达的患者表现出显著的总生存概率延长、而高smox的患者导致免疫治疗效果差(图14、15)。5个核心基因与血管相关评分的相关性分析(图16)，提示b2m基因表达与vegfr和血管生成显著正相关，而smox与pdgfr和fgfr显著正相关。这提示b2m高表达是抗血管治疗的优效人群，而smox高表达患者抗血管效果较差。b2m和smox表达与索拉非尼药物敏感性分析验证了本结果：b2m与索拉非尼-ic50呈显著负相关，smox的表达与索拉非尼-ic50呈显著正相关(图17)。93.kaplan-meier分析表明，b2m、lcat的高表达与预后变差相关；dph2、smox、tli2的高表达代表预后更好；b2m、smox和dph2的结果进一步在tcga-lihc验证集和gse76427中得到印证。lcat在gse76427中、tll2在tcga-lihc验证集和gse76427中未得到p《0.05的结果。94.在与免疫治疗反应相关性的研究中，lcat和tll2的表达与免疫治疗反应无显著相关性(图19d-e，g-h；所有p》0.05，对数秩检验)。此外，dph2的表达与索拉非尼-ic50无显著相关性(图18c，p＝0.9，斯皮尔曼相关试验)，lcat的表达与索拉非尼-ic50呈显著负相关(图18f，r＝-0.25，p《0.001，斯皮尔曼相关试验)，tll2的表达与索拉非尼ic50呈显著正相关(图18i，r＝0.15，p《0.001，spearman相关检验)。95.实施例5、本发明所提供的模型与vegfr的联合96.我们进一步探讨了血管相关基因特征与抗血管生成药物ic50之间的相关性。vegr1-3是抗血管生成药物索拉非尼、雷戈拉非尼、伦伐替尼和多那非尼的靶点。vegfr信号(本发明中可称vegfr评分或简称为vegfr)是由基因vegr1-3基因表达量进行的基因集变异分析(genesetvariationanalysis，gsva)得到的。97.我们的分析显示m6asig评分与血管生成和vegfr信号显著负相关，与fgfr信号呈正相关(图19a)。vegr和fgf与索拉非尼的ic50呈显著负相关(图19b-c；所有p《0.05，spearman相关检验)。pdgfr和vegf与索拉非尼的ic50显著正相关(图19d-e；所有p《0.05，spearman相关检验)。fgfr、pdgf与血管生成信号无显著相关性(图19f-h；所有p》0.05，spearman相关检验)。这些发现表明vegfr可以预测抗血管生成药物索拉非尼的疗效。98.正如预期的那样，我们发现具有高vegfr的患者总体生存期延长(图20，p＝0.004，对数秩检验)，而m6asig评分低且vegfr信号高(图中标记为h-vegfr)的患者表现出显著的生存优势(图21，p《0.001，对数秩检验)。进一步行1、2、3年生存率roc曲线分析，结果显示m6asig评分联合vegfr的预测效能高于单独使用m6asig评分或vegfr(图22a-c)。综上所述，我们的研究结果令人信服地证明m6asig评分是预测hcc免疫治疗和抗血管生成反应的有力生物标志物。99.以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。100.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。101.此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及生物医学领域，涉及基于m6a特征基因的肝癌预后风险模型及其应用。
背景技术：
：：2.肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因。由于起病隐匿，预后差，缺乏特异性，多数患者确诊时已到了晚期。传统的治疗手段，如手术切除、肝移植、放疗、化疗等治疗作用有限，未能使患者明显受益。只有少数患者受益于如索拉非尼的一线治疗，而又在六个月内出现了显著的耐药性。晚期肝癌的联合治疗临床试验包括imbrave150ⅲ期(阿替利珠单抗 贝伐珠单抗联合治疗)，orient-32ⅲ期(信迪利单抗 贝伐珠单抗联合治疗)和keynote-524ⅰb期研究(帕博利珠单抗 仑伐替尼联合治疗)，以上联合治疗已经将中位无进展生存期(medianprogression-freesurvival，mpfs)提高到4.6～9.3个月。3.肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)由各种免疫细胞、炎症细胞、内皮细胞、成纤维细胞和非细胞成分(包括细胞因子和趋化因子)组成。tme在抗肿瘤、免疫逃逸、肿瘤复发和转移中起着至关重要的作用。4.n6-甲基腺苷(m6a)是mrna和非编码rna中的一种常见rna修饰，可以影响rna剪接、翻译、稳定性以及某些非编码rna的表观遗传影响。m6a的形成和功能由甲基化转移酶(methyltransferase，也可称为writers)、去甲基化酶(也可称为erasers)和甲基化阅读蛋白(也可称为readers)等共同参与。其中甲基化转移酶包括mettl3/14、wtap和kiaa1429等，主要作用就是催化mrna上腺苷酸发生m6a修饰。而去甲基化酶包括fto和alkhb5等，作用是对已发生m6a修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6a修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如rna降解、mirna加工等。越来越多的证据表明，m6a修饰可调节mrna代谢、转运、稳定、降解，并进一步影响细胞生物学功能，如细胞增殖、干细胞分化、侵袭、转移和肿瘤稳态。此外，m6a修饰在调节肿瘤免疫微环境(time)中起着至关重要的作用。然而，m6a在hcc肿瘤免疫和血管生成微环境中的综合功能尚未得到充分认识。5.尽管目前fda批准的肝癌(hcc)抗血管生成药物索拉非尼(sorafenib)和仑伐替尼(lenvatinib)取得了不错疗效，但大多数患者很快就会产生耐药性。因此，亟需要一种可靠的预测指标，指导肝癌个体化治疗。技术实现要素：6.我们在tcga-lihc训练集中构建了一种基于m6a调控的可预测免疫和抗血管治疗疗效的新型肝癌预后风险模型，并在tcga-lihc验证集和gse76427中进行了验证。我们已经证明，高m6asig评分与预后不良相关。7.另外，在两个独立的免疫治疗数据集中证实了m6asig评分的预测免疫治疗疗效的效果。另外，还验证了m6asig评分在预测药物敏感性中的应用；8.m6asig评分与抗血管生成药物敏感性呈负相关，另外，还验证了vegfr和m6asig联合后预测肝癌患者预后的效果。9.第一方面，本发明提供了一种肝癌(肝细胞癌，hepatocellularcarcinoma，hcc)的预后标志物组合、包括所述预后标志物组合预后模型、以及该模型的构建方法。10.所述预后标志物组合包括：b2m、lcat、smox、tll2和dph2。11.优选地，所述预后模型根据以下公式计算风险值：12.风险值(m6asig评分)：具体为13.m6asig-score＝0.35*smox 0.38*tll2 1.37*dph2–1.02*b2m–0.21*lcat14.所述“风险值”在本发明中亦称为“m6asig评分”、“m6asig-score”、“m6a评分”。15.另一方面，本发明还提供了检测b2m、lcat、smox、tll2和dph2中至少一种的试剂、前述预后模型在以下方面中的应用：16.1)预测肝癌患者的预后，17.2)预测抗pd-1/pd-l1治疗的疗效中的应用；所述抗pd-1/pd-l1治疗包括施用阿替利珠单抗。18.优选地，所述抗pd-1/pd-l1治疗的疗效是针对任何癌症患者；更具体地，是针对转移性尿路上皮癌患者或黑色素瘤患者接受抗pd-1/pd-l1治疗的疗效。19.3)判断患者对抗血管生成药物(anti-angiogenicdrugs)的药物敏感性中的应用；所述药物包括索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)和培唑帕尼(pazopanib)；所述m6asig-score越高，索拉非尼、达沙替尼和培唑帕尼的ic-50值越高，也即该患者对药物的敏感性约低，也就是患者接受索拉非尼、达沙替尼和培唑帕尼的疗效越差。20.本发明所述预后的指标可以包括但不限于以下指标：1-5年总体存活率(1-5yearsoverallsurvivalrate，os)、无进展生存期(progression-freesurvival，pfs)、1-5年无进展生存(1-5yearspfs)、疾病进展时间(timetoprogress，ttp)、无病生存期(disease-freesurvival，dfs)、治疗失败时间(timetotreatmentfailure，ttf)、客观缓解率(objectiveresponserate，orr)、应答率(responserate，rr)、完全应答率(completeresponse，cr)、部分应答率(partialresponse，pr)、疾病稳定(stabledisease，sd)、疾病进展(progressivedisease，pd)。21.具体地，本发明预后包括1、2、3、4、5年的总体生存期；所述预后还包括cr/pr、sd/pd；所述“/”代表“或”。22.本发明所述“tis、ips、tide”皆为常用的癌症分期标准；所述ips(immunophenoscore)是预测免疫治疗反应的生物标志物，用于根据四组免疫相关分子评估肿瘤免疫原性的决定因素：mhc、免疫检查点、效应细胞和抑制细胞；所述tis(tumorinflammationsignature)是一种18个基因的分期标准，用于预测抗pd-1抑制剂的治疗效果，反映了tme中存在抑制的适应性免疫反应(抗原呈递、ifn-γ和细胞毒性细胞)；所述tide(tumorimmunedysfunctionandexclusion)用于评估两种不同的肿瘤免疫逃逸机制，即细胞毒性t淋巴细胞(ctl)功能障碍和ctl免疫抑制因子排斥，tide评分越高的患者越容易逃避抗肿瘤免疫，从而导致免疫治疗的有效性越低。23.另一方面，本发明还提供了前述模型与vegfr联合后在预测肝癌患者预后中的应用。高vegfr而低m6asig评分的患者具有最好的预后，总体生存率最高。24.根据以上应用，本发明还提供了以下产品：25.一方面，本发明提供了一种预测肝癌预后的试剂盒，所述试剂盒包括检测b2m、lcat、smox、tll2和dph2表达水平的试剂。26.进一步，所述试剂为检测所述生物标志物转录的rna的量的试剂。27.进一步，所述试剂为检测所述生物标志物转录的mrna的量的试剂。28.进一步，所述试剂为检测所述生物标志物编码的蛋白质(多肽)的量的试剂。29.另一方面，本发明提供了一种预测肝癌预后的装置，其特征在于，所述装置包括：30.1)用于输入生物样品中生物标志物的水平的输入模块，所述生物标志物选自b2m、lcat、smox、tll2和dph2；31.2)用于计算患者的预后的计算模块；32.3)用于输出预测结果的输出模块。33.以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。34.术语“生物标志物”指患者表型(例如病理学状态或对治疗剂的可能的反应性)的指示物，其可以在该患者的生物样品中检测到。本发明所述“生物样品”包括：活检组织、外周血、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液。35.具体地，本发明所述生物标志物包括b2m、l-cat、smox、tll2和dph2，所述生物标志物构成的预测模型基于所述生物标志物的表达水平，可以预测肝癌患者的预后、预测抗pd-1/pd-l1治疗的疗效、以及判断抗血管生成药物(anti-angiogenicdrugs)的疗效。本发明所述“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的表达量。36.本文所述的基因表达水平的检测可以采用本领域已知的测定方法，包括但不限于检测所述生物标志物的rna转录物的量或所述生物标志物编码的多肽的量的方法。37.在本文中，所述生物标志物的rna转录物可通过本领域已知的方法转化为与其互补的cdna，通过测定互补cdna的量可以获得rna转录物的量。在本文中，rna转录物可以通过例如杂交、扩增、测序的方法来检测和量化，包括但不限于将rna转录物与探针或者引物杂交的方法，通过基于聚合酶链式反应(pcr)的各种定量pcr技术或测序技术检测rna转录物或其对应cdna产物的量的方法。所述定量pcr技术包括但不限于荧光定量pcr、实时pcr或半定量pcr技术。所述测序技术包括但不限于sanger测序、二代测序、三代测序和单细胞测序等。38.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂可以是以下任意方法中所使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法；39.优选地，所述检测mrna表达量的试剂可以是以下任意方法中使用到的试剂：基于pcr的检测方法、southern杂交方法、northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、dna微阵列方法、aso法、高通量测序平台方法。40.本发明所述“试剂盒”是包含至用于特异性检测本发明的生物标志基因或蛋白质的制成品(例如，包装或容器)。在某些实施方案中，该制成品作为用于进行本发明的方法的单位推销、分销或销售。41.本发明所述“输入模块”包括鼠标、键盘、触摸屏显示器、一个或多个按钮、一个或多个开关、一个或多个触发器等等中的一个或多个。lihc验证集中的生存差异分析，b：dph2在gse76427中的生存差异分析，c：dph2与索拉非尼相关性分析；d：lcat在tcga-lihc验证集中的生存差异分析，e：lcat在gse76427中的生存差异分析，f：lcat与索拉非尼相关性分析；g：tli2在tcga-lihc验证集中的生存差异分析，h：tli2在gse76427中的生存差异分析，i：tli2与索拉非尼相关性分析。63.图19是血管相关基因特征与索拉非尼-ic50之间的相关性分析，a：m6asig评分与血管相关基因特征的相关性分析，b：vegfr与索拉非尼-ic50的相关性分析，c：fgf与索拉非尼-ic50的相关性分析，d：pdgfr与索拉非尼-ic50的相关性分析，e：vegf与索拉非尼-ic50的相关性分析，f：fgfr与索拉非尼-ic50的相关性分析，g：pdgf与索拉非尼-ic50的相关性分析，h：angiogenesis(血管生成)与索拉非尼-ic50的相关性分析。64.图20是vegfr高低信号组的生存差异分析。65.图21是vegfr与m6asig评分联合进行生存差异分析。66.图22是在肝癌数据集中验证vegfr与m6asig评分联合的预后roc检验效能评价，a：1年，b：2年，c：3年。具体实施方式67.实施例1、构建基于m6a特征基因的肝癌预后风险模型，并测试其预后效果68.模型构建方法：69.1、通过文献获取24个m6a调控的关键基因。24个基因分别是15个readers：eif3a，elavl1，fmr1，hnrnpa2b1，hnrnpc，igf2bp1-3，lrpprc，rbmx，ythdc1/2；7个writers：cbll1，mettl3/14，rbm15/15b，wtap，zc3h13；2个erasers：alkbh5，fto。70.2、通过tcga和geo获取包含生存和基因表达的肝癌数据，本研究共纳入593份hcc样本，包括来自tcga-lihc数据集(非肿瘤＝50，肿瘤＝375)和gse76427数据集(非肿瘤＝52，肿瘤＝115)的样本。rna转录组数据(fpkm格式)被转换为百万/千碱基(tpm)的转录组格式。使用sva包消除数据集之间的批量效应(batcheffect)。71.tcga数据按1：1分为训练集和测试集，geo数据gse76427作为独立验证集。72.3、利用“pam”算法对24个关键基因进行m6a的表达矩阵聚类，鉴定出3种m6a修饰模式(图1a，b)。3种m6a修饰模式分别对应了肿瘤免疫中的“免疫激活型”、“基质激活型”和“免疫荒漠型”。73.4、利用“limma”包筛选3种m6a修饰模式的显著差异基因(校正p＜0.001；图2a)，共得到420个m6a相关的差异表达基因(degs)。74.5、进一步通过单因素cox，筛选出肝癌预后相关的61个预后基因，(p《0.05)。75.6、在tcga训练集中，通过lasso回归得到10个差异表达基因(图2b-c)，多因素cox风险回归得到5个核心基因。以上基因的多因素森林图如图3所示。76.基于以上筛选到的基因，构建基于m6a修饰的肝癌预后风险模型。该模型的具体公式是：77.m6asig-score＝0.35*smox 0.38*tll2 1.37*dph2–1.02*b2m–0.21*lcat，78.m6asig-score代表风险值。79.通过“survival”包中的“surv_cutpoint”功能确定cutoff值，并将各数据集中的患者分为高低得分两组，得到高分患者138例，低分患者347例。进行kaplan-meier生存分析，并对1、2、3、5年生存率生成roc曲线。80.tcga训练集中生存分析结果如图4a所示，预后效果roc曲线如图4b所示。tcga测试集中生存分析结果如图5a所示，预后效果roc曲线如图5b所示。gse76427训练集中生存分析结果如图6a所示，预后效果roc曲线如图6b所示。81.实施例2、风险模型与免疫疗效评分的相关性分析82.与pd-l1、tmb和msi一样，ips、tis和tide最近也被广泛应用于预测免疫疗效。分析本发明所提供的模型与以上评分标准的相关性，我们的研究表明，低m6asig评分组的tis和ips显著升高、tide(exclusion、mdsc和m2)显著降低。具体如图7所示(均p《0.001)。83.以pd-1/pd-l1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂(immune-checkpointinhibitors，icis)治疗在癌症治疗方面取得了重大突破。本发明通过外部免疫治疗数据集，验证了本模型预测免疫治疗疗效的准确性。外部数据集分别是imvigor210数据集、liu数据集。84.以上所述imvigor210数据集中包括348例接受阿替利珠单抗(atezolizumab，抗pd-l1单抗)治疗的转移性尿路上皮癌患者，具体发表文章为mariathasans,turleysj,nicklesdetal.tgfbetaattenuatestumourresponsetopd-l1blockadebycontributingtoexclusionoftcells,nature2018；554:544-548；85.所述liu数据集中包括121名接受抗pd-1/pd-l1治疗的黑色素瘤患者；具体发表文章为liud,schillingb,liudetal.integrativemolecularandclinicalmodelingofclinicaloutcomestopd1blockadeinpatientswithmetastaticmelanoma,naturemedicine2019；25:1916-1927。86.imvigor210数据集中的研究显示：imvigor210-免疫治疗数据集中，m6asig-score与免疫治疗预后显著相关；免疫治疗获益患者的m6asig-score显著低于无效组。m6asig评分较低的患者总体生存概率显著延长(图8a，p《0.001，对数秩检验)，cr/pr(完全缓解和部分缓解)患者的m6asig评分显著高于sd/pd(病情稳定和进展)患者(图8b，p《0.001，wilcoxon秩和检验)，免疫疗效预测效果roc曲线如图9所示。liu数据集中的研究也有类似结果(图10a，p《0.001，对数秩检验；图10b，p＝0.019，wilcoxon秩和检验)，免疫疗效预测效果roc曲线如图11所示。87.实施例3、风险模型与血管相关评分、药物敏感性的相关性分析88.为探讨m6asig-score在预测患者对抗血管生成药物的敏感性的准确性。用prrophetic包计算gdsc数据集(genomicsofdrugsensitivityincancer)中抗血管生成药物的ic50。我们对m6asig评分与索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)和培唑帕尼(pazopanib)的ic50进行了spearman相关分析。89.结果显示，m6asig-score与索拉非尼(图12a)、达沙替尼(图12b)和培唑帕尼(图12c)的ic50显著正相关。提示m6asig-score越高，抗血管生成药物的疗效越差。也就是m6asig-score越低的患者更有可能在抗血管生成药物的治疗中获益。90.实施例4、对5个核心基因的研究91.为探讨5个hub基因在免疫治疗和抗血管生成治疗中的作用机制。我们首先探讨了5个hub基因与免疫细胞浸润之间的相关性。5个核心基因与免疫细胞浸润相关性(图13)，提示b2m基因表达与cd8 t细胞和m1型巨噬细胞浸润显著正相关，而smox与抑制性免疫细胞treg显著正相关。这提示b2m高表达是免疫治疗的优效人群，而smox高表达患者免疫治疗效果较差。92.在imvigor210免疫治疗数据集、liu数据集同样验证了b2m高表达的患者表现出显著的总生存概率延长、而高smox的患者导致免疫治疗效果差(图14、15)。5个核心基因与血管相关评分的相关性分析(图16)，提示b2m基因表达与vegfr和血管生成显著正相关，而smox与pdgfr和fgfr显著正相关。这提示b2m高表达是抗血管治疗的优效人群，而smox高表达患者抗血管效果较差。b2m和smox表达与索拉非尼药物敏感性分析验证了本结果：b2m与索拉非尼-ic50呈显著负相关，smox的表达与索拉非尼-ic50呈显著正相关(图17)。93.kaplan-meier分析表明，b2m、lcat的高表达与预后变差相关；dph2、smox、tli2的高表达代表预后更好；b2m、smox和dph2的结果进一步在tcga-lihc验证集和gse76427中得到印证。lcat在gse76427中、tll2在tcga-lihc验证集和gse76427中未得到p《0.05的结果。94.在与免疫治疗反应相关性的研究中，lcat和tll2的表达与免疫治疗反应无显著相关性(图19d-e，g-h；所有p》0.05，对数秩检验)。此外，dph2的表达与索拉非尼-ic50无显著相关性(图18c，p＝0.9，斯皮尔曼相关试验)，lcat的表达与索拉非尼-ic50呈显著负相关(图18f，r＝-0.25，p《0.001，斯皮尔曼相关试验)，tll2的表达与索拉非尼ic50呈显著正相关(图18i，r＝0.15，p《0.001，spearman相关检验)。95.实施例5、本发明所提供的模型与vegfr的联合96.我们进一步探讨了血管相关基因特征与抗血管生成药物ic50之间的相关性。vegr1-3是抗血管生成药物索拉非尼、雷戈拉非尼、伦伐替尼和多那非尼的靶点。vegfr信号(本发明中可称vegfr评分或简称为vegfr)是由基因vegr1-3基因表达量进行的基因集变异分析(genesetvariationanalysis，gsva)得到的。97.我们的分析显示m6asig评分与血管生成和vegfr信号显著负相关，与fgfr信号呈正相关(图19a)。vegr和fgf与索拉非尼的ic50呈显著负相关(图19b-c；所有p《0.05，spearman相关检验)。pdgfr和vegf与索拉非尼的ic50显著正相关(图19d-e；所有p《0.05，spearman相关检验)。fgfr、pdgf与血管生成信号无显著相关性(图19f-h；所有p》0.05，spearman相关检验)。这些发现表明vegfr可以预测抗血管生成药物索拉非尼的疗效。98.正如预期的那样，我们发现具有高vegfr的患者总体生存期延长(图20，p＝0.004，对数秩检验)，而m6asig评分低且vegfr信号高(图中标记为h-vegfr)的患者表现出显著的生存优势(图21，p《0.001，对数秩检验)。进一步行1、2、3年生存率roc曲线分析，结果显示m6asig评分联合vegfr的预测效能高于单独使用m6asig评分或vegfr(图22a-c)。综上所述，我们的研究结果令人信服地证明m6asig评分是预测hcc免疫治疗和抗血管生成反应的有力生物标志物。99.以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。100.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。101.此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
