靶向EP4受体小分子拮抗剂及其在骨关节炎、软骨缺损治疗中的应用的制作方法

6632.2009.05240.x(2010).)。软骨下骨板是皮质薄层，位于钙化软骨下方。软骨下骨板具有孔隙，形成通道，连通关节软骨层与软骨下骨层。大量的动脉和静脉血管以及神经网络通过这些通道，将微小的分支侵入到钙化软骨中(holmdahl,d.e.&ingelmark,b.e.doi:10.3109/17453675009043414(1950).)。在软骨层和软骨下骨层之间通道的分布和数量取决于机体衰老程度和软骨层与软骨下骨层之间传递的压力大小。软骨层和软骨下骨层之间的通道优先分布于关节受力较大的区域。通道的形状和直径大小也随软骨下骨板厚度不同而不同。在软骨下骨板较厚的区域通道直径较窄，形成树状网格，而在软骨下骨板较窄的区域，通道则较宽。软骨下骨松质骨对关节具有重要的减震和支撑功能，并且对软骨层的营养供应也很重要。相对于软骨下骨板，软骨下骨松质骨中有更多的孔隙结构并且具有代谢功能，其中含血管组织和神经系统。软骨下骨松质骨具有不均匀的结构，随着离关节表面的距离而变化。软骨下骨松质骨具有结构和机械各向异性(holopainen,j.t.et al.doi:10.1016/j.bone.2008.07.254(2008).)。软骨下骨是动态的结构，能够很好的适应关节处的机械压力，此外，机械压力还可以通过骨重构来改变软骨下骨组织的形状和结构(goldring,s.r. doi:10.1177/1759720x12437353(2012).)。“水泥线”是钙化软骨层与软骨下骨层之的界限。关节软骨与软骨下骨之间紧密接触，形成紧密复合的功能单元，称为“骨-软骨链接”。骨-软骨交界处的组织成分主要有：非钙化软骨，潮线，钙化软骨，水泥线和软骨下骨。骨-软骨交界处里面任一种组织的改变都会影响骨-软骨链接的功能，骨-软骨链接在关节的稳定性维持和退化中起作用(lyons,t.j., mcclure,s.f.,stoddart,r.w.&mcclure,j.doi:10.1186/1471-2474-7-52(2006).)。软骨下骨和软骨在承受外界压力方面具有互补作用。软骨下骨可以支持关节软骨，分散软骨层承受的机械压力。软骨下骨硬化后会增加软骨层承受的机械压力，导致继发性软骨损伤。同样，在关节软骨损坏或丢失后，传递到软骨下骨中的机械压力也会大大增加(lajeunesse,d.&reboul,p. doi:10.1097/00002281-200309000-00018(2003).)。钙化软骨层和软骨下骨板之间的通道使得关节软骨和软骨下骨之间建立起来生物化学联系。例如，软骨下骨重构过程中成骨细胞会释放前列腺素，白三烯和各种生长因子，它们会作用到关节软骨中(bellido,m.et al.doi:10.1186/ar3103(2010).)。此外，发生骨关节炎后，软骨细胞也会分泌大量的炎性因子作用到软骨下骨中，促进软骨下骨骨重构，打破软骨下骨的稳态。发生骨关节炎后，软骨下骨的早期变化是出现骨髓损伤(bml)，它广泛存在于钙化软骨，软骨下骨板和软骨下骨松质骨中。它通常是由机械压力超负荷引起的(vener,m.j.,thompson,r.c.,jr.,lewis,j.l.&oegema,t.r.,jr. doi:10.1002/jor.1100100603(1992).)，这些损伤有两种形式：线性微损伤和弥散性微损伤。它们对骨关节炎发生和发展有非常重要的作用。它们会启动软骨下骨骨重构，它们还为关节软骨与软骨下骨之间的联系提供了通道。在骨关节炎早期阶段，软骨下骨组织中的破骨细胞的活性显著提高，它们会起始软骨下骨中非偶联的骨重构。破骨细胞会通过吸收骨质，释放细胞因子，吸引血管系统和神经系统进入到钙化软骨层中，加剧骨关节炎的进展。2013年，曹旭等人研究表明，骨关节炎早期阶段，软骨下骨中的破骨细胞异常活跃，吸收骨质，释放出来转化生长因子β1(tgfβ1)，从而吸引巢蛋白阳性(nestin

)的间充质干细胞，一方面这些间充质干细胞会促进血管生成，另一方面它们会进行非偶联的骨重构，异常成骨 (zhen,g.et al.doi:10.1038/nm.3143(2013).)。2019年曹旭等人研究表明，骨关节炎早期阶段，软骨下骨中破骨细胞异常活跃，并释放出netrin-1,作用到背根神经细胞的dcc
受体上，从而吸引背根神经细胞侵入到软骨下骨组织中，提高机体对痛觉的敏感性。在破骨细胞中敲除netrin-1或者抑制破骨细胞活性均能有效的抑制骨关节炎引起的痛觉，这也为骨关节炎疼痛治疗提供了新的策略(zhu,s.etal.doi:10.1172/jci121561(2019).)。产生骨关节炎后，软骨下骨组织中的成骨细胞可以通过软骨下骨和软骨之间的联系促进软骨细胞分解代谢，使软骨细胞产生大量mmp-13，并降低蛋白聚糖的生成。同时，关节软骨细胞可引起软骨下骨中的成骨细胞增加mmp-1表达，从而影响成骨细胞功能。患有骨关节炎后，软骨下骨组织中的成骨细胞会表达多种和炎症反应相关的细胞因子，例如转化生长因子β1和前列腺素e2。炎症细胞因子的高表达会引起软骨下骨稳态被打破(weber,a., chan,p.m.b.&wen,c.doi:10.1016/j.pbiomolbio.2017.12.004(2019).)。软骨下骨中的骨细胞在感受到微损伤后会释放出凋亡信号，会促进破骨细胞的生成并抑制硬骨素的产生，从而进一步打破软骨下骨的稳态，促进非偶联的骨重构(henriksen, k.,neutzsky-wulff,a.v.,bonewald,l.f.&karsdal,m.a. doi:10.1016/j.bone.2009.03.671(2009).)。2019年，白晓春等人研究发现机械应力损伤可以激活软骨下骨前体成骨细胞中的雷帕霉素靶蛋白复合体1(mtorc1)相关的信号通路，导致前体成骨细胞异常增殖和分泌cxcl12，促进软骨下骨组织中非偶联的骨重构产生，诱发和加速骨关节炎的进展。抑制软骨下骨前体成骨细胞mtorc1信号通路的异常激活能有效改善软骨下骨非偶联的骨重构，延缓骨关节炎的进展。该研究为软骨下骨非偶联骨重构在骨关节炎发病机制提供了新的理论基础，为靶向mtorc1治疗骨关节炎提供了新的策略(lin,c.et al. doi:10.1038/s41413-018-0041-8(2019).)。
6.前列腺素e2(prostaglandine2，pge2)是重要的促炎因子，在骨关节炎病人的软骨中可检测到pge2的高表达。下调pge2在延缓骨关节炎病程进展以及消炎止痛中有着重要作用。nsaids或选择性cyclooxygenase-2(cox-2)抑制剂 coxibs可以抑制pge2的产生，因而具有一定的消炎和缓解疼痛的作用，在骨关节炎的临床治疗过程中，它们被用于缓解骨关节炎病人的疼痛。然而，pge2参与调节多种生理、病理过程，nsaids和一些选择性cox-2抑制剂抑制了pge2 的产生，而具有较大毒副作用，和心血管风险。美国食品药品管理局(fda)警告显示，nsaids和一些选择性cox-2抑制剂可能有肾脏、胃肠道(gi)和肝毒性。因此，cox下游的gpcr是理想的治疗骨关节炎的靶标：不仅因为gpcr 受体是很好的药物靶点，已批准的30％的药物都是靶向gpcr的，它们是多功能的细胞传感器；更是由于靶向cox下游受体可以规避pge2产量变化而导致的副作用，具有较低的胃肠道和心血管风险，可满足医疗需求；更重要的是，近期研究表明，cox-2促进成骨细胞分化并抑制骨骼祖细胞的软骨分化，进一步表明cox-2信号通路在调节软骨细胞代谢和分化中的潜在作用。说明了cox-2 信号通路抑制剂可在炎消镇痛的同时，参与调节软骨分化，可能成为极具潜力的骨关节炎治疗药物。
7.pge2下游有四个不同亚型的受体(ep1-ep4)，它们都属于g蛋白偶联受体家族。pge2大量被广泛认可的生物学功能，都是由ep2和ep4受体介导的。 ep4与骨关节炎的软骨退变有相关性，研究发现，ep4在炎症关节组织和关节软骨中表达增加。ep4受体还介导由pge2引起的炎症和感觉神经元敏感性，已被开发为治疗骨关节炎引起的炎症和疼痛的治疗靶点。靶向ep4受体的拮抗剂可阻断pge2/ep4的信号通路，且不会抑制类前列腺素的合成，可以避免经典的 nsaids以及选择性cox2抑制剂对于胃肠道及心血管的潜在毒副作用。ep2受体与pge2的亲和力较低，而ep4受体对pge2具有较高亲和力，靶向pge2下游ep4受体开发
特异性拮抗剂获得了学术界和工业界越来越多的关注。 grapiprant是辉瑞公司研发的唯一被fda批准的ep4拮抗剂，用于治疗犬骨关节炎引起的炎症和疼痛。此外还有一系列ep4拮抗剂正被开发作为治疗骨关节炎的抗炎药物。
8.ep4受体偶联gαs蛋白，通过激活腺苷酸环化酶提高细胞内camp的水平。在血管调控中，ep4受体可以通过pkac，camp，内皮一氧化氮合酶(enos)和 pka介导血管舒张，和血管生成(stillman,b.a.,audoly,l.&breyer,r.m. doi:10.1016/s0014-2999(98)00522-6(1998).)。creb可以被pka或不同的mapk 磷酸化。creb调节fcγriia的表达，fcγriia是中性粒细胞和单核细胞在抵抗细菌感染时的重要受体。在髓样plb细胞的分化过程中，pge2可以通过ep4 受体激活pka-creb信号通路发挥作用(hazan-eitan,z.,weinstein,y.,hadad,n., konforty,a.&levy,r.doi:10.1182/blood-2006-05-021881(2006).)。在单核细胞中， ep4受体通过激活creb和与趋化因子受体ccr7的启动子结合，促进单核细胞细胞的迁移。ep4受体还可以通过epac这个camp激活的交换蛋白来发挥作用。 epac-1和epac-2是鸟嘌呤核苷酸交换因子，连接camp和ras超家族成员，调控细胞增殖、分化、迁移和炎症反应。而在足细胞中，pge2可以通过ep4调控其下游的amp激活蛋白激酶(ampk)来发挥作用(faour,w.h.,gomi,k.& kennedy,c.r.doi:10.1016/j.cellsig.2008.08.007(2008).)。因此，pge2-ep4能够激活多种依赖camp的信号传导途径，例如ampk，epac和pka，这些信号传导途径可能协同发挥作用或以交替方式介导ep4下游信号传导。ep4受体的c末端具有g蛋白偶联受体激酶(grk)和pka潜在的磷酸化位点，并可能为其他信号分子(例如arrestins或ep4受体相关蛋白)提供额外的相互作用位点(takayama, k.,sukhova,g.k.,chin,m.t.&libby,p. doi:10.1161/01.res.0000204451.88147.96(2006).)。ep4受体磷酸化后会招募βrestin-1，激活c-src调控表皮生长因子受体，通过pi3k和akt传递信号 (buchanan,f.g.et al.doi:10.1073/pnas.0510562103(2006).)。ep4受体也可以偶联 gαi蛋白，这也会引起在hek293细胞中过表达ep4受体后pi3k/erk信号通路的激活(fujino,h.&regan,j.w.doi:10.1124/mol.105.017749(2006).)。ep4受体还可以调控小鼠体内神经系统和血管系统的形成，在体外，ep4可以通过erk 调控内皮细胞迁移和血管形成。在脑缺血小鼠模型中，ep4受体通过akt/enos 信号通路发挥保护作用(liang,x.et al.doi:10.1172/jci46279(2011).)。ep4受体在 b淋巴细胞和t淋巴细胞，树突状细胞，nk细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞中都有表达，发挥重要的作用(kalinski,p. doi:10.4049/jimmunol.1101029(2012).)。ep4受体对于单核细胞衍生的树突状细胞的迁移有着重要的调控作用，通过调控树突细胞产生基质金属蛋白酶9(mmp9) 来发挥作用(kabashima,k.et al.doi:10.1038/nm872(2003).)。在th17细胞的分化过程中，pge2也可以通过ep4受体来发挥调控作用。树突状细胞在lps诱导的情况下，ep4受体可以促进其分泌il-23，反过来，树突状细胞可以分泌多种细胞因子促进t细胞分泌il-17。在未成熟的t细胞中，ep4可以促进其il-23和 il-1受体的表达。此外在小鼠中，ep4拮抗剂ono-ae3-208对自身免疫性脑脊髓炎和接触性超敏反应有很好的治疗作用，并可以减少局部淋巴结中il-17的产生。ep4可以抑制人类浆细胞样树突状细胞干扰素-β(il-β)的产生。在pge2刺激下，成熟的树突状细胞会促进th2极化，并产生吸引th2的趋化因子，这表明 ep4受体在过敏性致敏反应中起关键作用(mcilroy,a.et al. doi:10.1111/j.1365-2567.2006.02326.x(2006).)。非甾体类抗炎药会加剧人类胃肠道黏膜损伤和炎症反应，并导致胃溃疡和胃肠道出血(kaufmann,h.j.&
taubin,h. l.doi:10.7326/0003-4819-107-4-513(1987).)。ep4受体可以通过刺激十二指肠产生碳酸氢盐和粘液保护肠胃道(aihara,e.et al.doi:10.1016/j.lfs.2007.04.012 (2007).)。ep4受体对抑制小肠上皮细胞有重要的调控作用，可以抑制其凋亡，并且促进肠胃道组织中血管的舒张，产生血管内皮生长因子，促进毛细血管生成和粘膜愈合(hatazawa,r.et al.doi:10.1152/ajpgi.00131.2007(2007).)，起到保护肠胃道的作用。2010年一项临床研究表明ep4受体激动剂ono-4819cd对患有轻度至中度肠胃道溃疡患者有保护作用。在ep4受体激动剂治疗的患者中，ep4 受体激动剂可以保护肠胃道黏膜屏障，抑制缺血再灌注，减缓患者的临床症状 (nakase,h.et al.doi:10.1002/ibd.21080(2010).)。pge2可以通过ep4受体诱导内皮细胞的血管生成，细胞水平上的研究表明，pge2可以通过ep4受体诱导小鼠肺微血管内皮细胞的迁移和微管生成。ep4受体激动剂虽然对血管内皮细胞的增殖没有调控作用，但会通过erk来促进血管内皮细胞迁移。pge2通过人脐静脉内皮细胞中的ep4受体激活enos，调控下游pka/pi3k/akt信号通路，来诱导血管生成(namkoong,s.et al.doi:10.1038/emm.2005.72(2005).)。研究表明 ep4促进血管生成作用与gαs下游信号通路有关，pka催化亚基γ的激活以及 rap1a，hspb6和enos的激活对于ep4受体调控血管生成至关重要。ep4受体在脉管系统中具有广泛的生物学功能。对于血管疾病，例如抗缺血，血管舒张和血小板抑制作用，刺激内皮屏障功能和血管生成等，ep4受体激动剂可能可以作为新的有效治疗策略。ep4受体对于多种肿瘤都具有调控作用，ep4受体会促进肿瘤细胞的血管生成，增殖，转移，抑制其凋亡。ep4受体对于肿瘤免疫调控具有重要的作用。pge2可以通过ep4受体抑制自然杀伤细胞和γδt细胞的活性抑制巨噬细胞发挥功能。pge2还可以通过树突状细胞上的ep4受体从而抑制其分化成熟，它们分化成髓样抑制细胞的表型(obermajer,n.,muthuswamy,r., lesnock,j.,edwards,r.p.&kalinski,p.doi:10.1182/blood-2011-07-365825 (2011).)。靶向肿瘤微环境中的ep4受体，开发新型ep4受体小分子抑制剂为肿瘤免疫治疗提供了新的有效策略。
9.已有的针对ep4拮抗剂治疗骨关节炎的研究主要集中在其抗炎作用和减轻疼痛方面，并无报道和专利文献提及软骨中的ep4信号通路的活性与软骨合成代谢的相关性，对于软骨损伤修复的影响，以及对于软骨下骨稳态的调控。因此 ep4受体可能成为治疗骨关节炎的新的靶点。


技术实现要素：

10.本发明原理在于，发明人首次创新地研究发现新型靶向ep4小分子拮抗剂能促进关节软骨成软骨化，抑制关节软骨肥大化，促进软骨的合成代谢、抑制分解代谢，进而修复关节软骨损伤，促进软骨再生。该小分子在小鼠和人的软骨外植体中，可减缓炎性环境下关节软骨基质的释放。在小鼠手术诱导的骨关节炎模型中可以减少软骨损伤。在衰老小鼠模型中保护软骨下调软骨的分解代谢。在大鼠全层软骨缺损模型中可有效促进软骨损伤的修复。该新型靶向ep4小分子拮抗剂可以通过抑制骨关节炎早期软骨下骨中破骨细胞分化活性从而抑制软骨下骨非偶联的骨重构，维持软骨下骨稳态从而抑制骨关节炎的进展。由此说明该新型靶向ep4小分子拮抗剂可用于开发治疗骨关节炎的药物，为解决关节软骨损伤修复这一世界难题提供新的药靶。
11.本发明提供了一种如式(i)所示的三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的
盐，所述化合物为结构新颖的化合物：
[0012][0013]
其中：
[0014]
n＝0-6；
[0015]
x＝0或者选自下列基团中的任意一个：ch2，o，s，so，so2，nr9；其中 r9选自氢，c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，苯基，苄基，五元或六元杂环芳香基，其中，r
10
选自c
1-6
烷基及其异构体、苯基、苄基，其中，r
11
选自c
1-6
烷基及其异构体、苯基、苄基；
[0016]
选自下列基团中的任意一个，包括苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、c
3-6
脂肪环烷基；
[0017]
y＝0或者任意选自下列基团中的一个或多个：c
1-6
烷基、卤素、硝基、-cn、多氟c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、多氟c
1-6
烷氧基；
[0018]
选自下列基团中的任意一个，包括c
3-6
环烷基、苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、取代的苯基及五元及取代的五元或六元杂环芳香基；
[0019]
r1选自下列基团中的任意一个：氢；卤素；c
1-6
烷基；c
3-6
环烷基，其中，环烷基上包含杂原子o、n、s、so2或是一个或多个卤素取代；多氟c
1-6
烷基；苯基；杂环芳香基，其中，芳香基上有一个或多个取代基，包括卤素、羟基、 c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、三氟c
1-6
烷基、多氟c
1-6
烷氧基、硝基、氰基；取代的苯基及取代的杂环芳香基，其中，所述苯基及杂环芳香基上有一个或多个取代基，包括卤素、羟基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、三氟c
1-6
烷基、多氟c
1-6
烷氧基、硝基、氰基；c
5-6
环烯基，其中，环烯基上包含杂原子o、n、s、so、so2；-ch＝cr
12r13
，其中，r
12
和r
13
分别选自h、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、三氟c
1-6
烷基，或r
12
和 r
13
连接起来形成3至6元碳环，其中，环烷基上包含杂原子o、n、s、so、so2或是一个或多个卤素取代；c≡c-z-r
14
，其中，z选自o、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基； r
14
选自h、卤素、羟基、c
1-6
烷氧基、多氟c
1-6
烷氧基；
[0020]
r2和r3为分别选自：氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基；或r2、r3连接起来构成3 至6元碳环，这些碳环包含一个杂原子，各选自o、s或nr
15
，其中，r
15
选自氢，c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，c
3-6
氟代环烷基，c
1-6
氟代烷基，芳香基，杂环芳香基，其中，r
16
选自c
1-6
烷基及其异构
体、苯基、苄基、萘基，其中，r
17
选自c
1-6
烷基及其异构体、苯基、苄基、萘基；
[0021]
r4选自下列基团中的任意一个：-cooh，羧酸酯；四氮唑基；磷酸基；磺酸基；其中，r
18
为c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，苯基，取代的苯基；其中，苯基上有一个或多个取代基，包括卤素、羟基、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、三氟c
1-6
烷基、多氟c
1-6
烷氧基、硝基、氰基。
[0022]
优选地，
[0023]
n＝0-6；
[0024]
x＝0或者选自下列基团中的任意一个：ch2；o；s；so；so2；nr9，其中 r9选自氢，c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，苯基，苄基，五元或六元杂环芳香基，其中，r
10
选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基及其异构体、苯基、苄基，其中， r
11
选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基及其异构体、苯基、苄基；
[0025]
选自下列基团中的任意一个，包括苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、c
3-6
脂肪环烷基；
[0026]
y＝0或者任意选自下列基团中的一个或多个：甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、卤素、硝基、-cn、二氟甲基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基；
[0027]
选自下列基团中的任意一个，包括c
3-6
环烷基、苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、取代的苯基及五元及取代的五元或六元杂环芳香基；
[0028]
r1选自下列基团中的任意一个：氢；卤素；c
1-6
烷基；c
3-6
环烷基，其中，环烷基上包含杂原子o、n、s、so2或是一个或多个卤素取代；二氟甲基；三氟甲基；苯基；杂环芳香基，其中，芳香基上有一个或多个取代基f、cl、br、i、羟基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、三氟甲基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、硝基、氰基；取代的苯基及取代的杂环芳香基，其中，所述苯基及杂环芳香基上有一个或多个取代基，包括f、cl、br、i、羟基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、三氟甲基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、硝基、氰基；c
5-6
环烯基，其中环烯基上包含杂原子o、n、s、so、so2；-ch＝cr
12r13
，其中，r
12
和r
13
分别选自h、 c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、三氟甲基，或r
12
和r
13
连接起来形成3至6元碳环，其中环烷基上包含杂原子o、n、s、so、so2或是一个或多个卤素取代；c≡c-z-r
14
，其中z选自o、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基；其中，r
14
选自h、f、cl、br、i、羟基、甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基；
[0029]
r2和r3为分别选自：氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基；或r2、r3连接起来构成3 至6元碳环，这些碳环包含一个杂原子，各选自o、s或nr
15
，其中，r
15
选自氢，c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，c
3-6
氟代环烷基，c
1-6
氟代烷基，芳香基，杂环芳香基，其中，r
16
选自甲基、乙基、丙基、异
丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基及其异构体、苯基、苄基、萘基，其中，r
17
选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基及其异构体、苯基、苄基、萘基；
[0030]
r4选自下列基团中的任意一个：-cooh，羧酸酯；四氮唑基；磷酸基；磺酸基；其中，r
18
为c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，苯基，取代的苯基；其中苯基上有一个或多个取代基f、cl、br、i、羟基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、三氟甲基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、硝基、氰基。
[0031]
进一步优选地，n＝0；
[0032]
x为ch2；
[0033]
为苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、c
3-6
脂肪环烷基；
[0034]
y任意选自下列基团中的一个或多个：甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、卤素、硝基、-cn、二氟甲基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基；
[0035]
为苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、c
3-6
脂肪环烷基；
[0036]
r1为苯基；取代的苯基及取代的杂环芳香基，其中，所述苯基及杂环芳香基上有一个或多个取代基，包括f、cl、br、i；
[0037]
r2和r3为氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基；或r2、r3连接起来构成3至6元碳环，这些碳环包含一个杂原子，各选自o、s或nr
15
，其中r
15
选自氢，c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，c
3-6
氟代环烷基，c
1-6
氟代烷基，芳香基，杂环芳香基；
[0038]
r4为-cooh，羧酸酯；四氮唑基；磷酸基；磺酸基。
[0039]
或者，进一步优选地，
[0040]
n＝2；
[0041]
x为o；
[0042]
为苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、c
3-6
脂肪环烷基；
[0043]
y任意选自下列基团中的一个或多个：甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、卤素、硝基、-cn、二氟甲基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基；
[0044]
为苯基、含一个或多个o、n、s原子的五元或六元杂环芳香基、c
3-6
脂肪环烷基；
[0045]
r1为c
1-6
烷基；c
3-6
环烷基，其中环烷基上包含杂原子o、n、s、so2或是一个或多个卤素取代；二氟甲基；三氟甲基；苯基；杂环芳香基，其中，芳香基上有一个或多个取代基f、cl、br、i、羟基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、三氟甲基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、硝基、氰基；取代的苯基及取代的杂环芳香基，其中，所述苯基及杂环芳香基上有一个或多个取代基，包括f、cl、br、i、羟基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、三氟甲基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、硝基、氰基；c
5-6
环烯基，其中环烯基上包含杂原子o、n、s、so、so2；-ch＝cr
12r13
，其中r
12
和r
13
分别选自h、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、三氟甲基，或r
12
和r
13
连接起来形成3至6元碳环，其中，环烷基上
包含杂原子o、n、s、so、so2或是一个或多个卤素取代；c≡c-z-r
14
，其中，z选自o、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基；其中，r
14
选自h、f、cl、br、i、羟基、甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基；
[0046]
r2和r3为氢、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基；或r2、r3连接起来构成3至6元碳环，这些碳环包含一个杂原子，各选自o、s或nr
15
，其中，r
15
选自氢，c
1-6
烷基，c
3-6
环烷基，c
3-6
氟代环烷基，c
1-6
氟代烷基，芳香基，杂环芳香基；
[0047]
r4为-cooh，羧酸酯；四氮唑基；磷酸基；磺酸基。
[0048]
本发明所述的三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐，包括但不限于以下：
[0049]
(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸
[0050]
4-(1-1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)环丙基)苯甲酸
[0051]
(s)-4-(1-(1-(2-(3-(三氟甲基)苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基) 乙基)苯甲酸
[0052]
(s)-4-(1-(1-4-(三氟甲基)苄基)-4-环丙基-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰胺基)乙基)苯甲酸
[0053]
(s)-4-(1-(4-(噻吩-3-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸
[0054]
(s)-4-(1-(4-(丙-1-烯-1-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基) 乙基)苯甲酸
[0055]
(s)-4-(1-(4-(丙-1-炔-1-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基) 乙基)苯甲酸
[0056]
(s)-4-(1-(4-(呋喃-3-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸
[0057]
(s)-4-(1-(5-(甲基噻吩-2-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸
[0058]
(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-(5-甲基噻吩-2-基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸
[0059]
(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-(5-甲基呋喃-2-基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸。
[0060]
本发明还提供了三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐的制备方法。本发明对新型三氮唑类化合物的制备提供了新的思路。反应通过末端溴制备相应的叠氮化物，然后在氩气条件下，与相应的炔进行惠斯根1,3-偶极环加成反应，生成两种不同构型的三氮唑类衍生物(如下反应式a)，现有技术中，1,3
-ꢀ
偶极环加成往往通过cu催化含有末端h炔的衍生物，生成单一的三氮唑构型，本发明在一定程度上利用huisgen环化的优点，通过反应得到的产物具有很好的官能团兼容性和选择性。
[0061][0062]
1,3-偶极环加成反应，根据前线轨道理论，基态时1,3-偶极体的lumo和亲偶极体的homo，以及基态时1,3-偶极体的homo和亲偶极体的lumo，都是分子轨道对称守恒原理所允许的，因此反应可以发生。在反应原理上是耐热的 [4π 2π]环化加成反应，该反应具有协同与立体特异性。并且产物的位置选择性可以根据前线轨道理论进行推算。
[0063]
方法一，如反应式(i)所示
[0064][0065]
在室温条件下，多取代芳香溴化物和叠氮化钠在二甲亚砜中搅拌反应12小时，得到相应的叠氮取代物，然后直接和丙炔酸乙酯的衍生物在甲苯中回流8 小时，经过纯化后得到相应的中间体。然后在四氢呋喃、甲醇和水相应比例的溶液中，加入中间体和一水合氢氧化锂，完成水解，最后在进行酰胺反应、纯化后再水解，得到目标化合物。经过核磁共振谱、高效液相色谱和lc-ms等方法证明化合物的结构和纯度。
[0066]
方法二，如反应式(ii)所示
[0067][0068]
在室温条件下，多取代芳香溴化物和叠氮化钠在二甲亚砜中搅拌反应12小时，得到相应的叠氮取代物，接下来直接和3-溴丙炔酸乙酯在甲苯中回流8小时，经过纯化后得到相应的中间体。该中间体和有机硼酸试剂、有机锡试剂等发生 suzuki偶联反应、stille偶联反应引入不同的基团，然后在四氢呋喃、甲醇和水相应比例的溶液中，加入中间体和一水合氢氧化锂，完成水解，最后在进行酰胺反应、纯化后再水解，得到目标化合物。经过核磁共振谱、高效液相色谱和lc-ms 等方法证明化合物的结构和纯度。
[0069]
本发明还提供了一种药物组合物，其含有如上所述的三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
[0070]
本发明还提供了所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐、或药物组合物作为ep4受体拮抗剂在预防/治疗骨关节炎中的应用。
[0071]
本发明还提供了上述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐、或药物组合物在制备治疗骨关节炎和/或软骨缺损引起的软骨退变、或软骨损伤、或软骨下骨病变、或疼痛的药物中的应用。
[0072]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐用于抑制蛋白聚糖的丢失，起保护关节软骨的作用。
[0073]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐能有效下调基质降解酶mmp3、mmp13对骨关节炎关节软骨的破坏作用。
[0074]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐通过抑制 ep4受体用于治疗骨关节炎引起的关节软骨损伤及疼痛。
[0075]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐通过抑制 ep4受体用于治疗关节软骨缺损及疼痛。
[0076]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐可作为治疗骨关节炎的药物单独使用，也可与其他药物联合使用。
[0077]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐、或药物组合物可用于制备治疗类风湿性关节炎、关节炎、滑膜炎，以及关节炎引起的疼痛的药物中的应
用。
[0078]
在上述实施方案中，所述药物还包括载体或辅料成分。
[0079]
本发明还提供了上述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐、或药物组合物在体外和/或体内促进软骨修复，促进软骨再生，进而修复关节软骨损伤中的应用。
[0080]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐用于促进关节软骨成软骨化，抑制关节软骨肥大化。
[0081]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐用于促进软骨细胞合成代谢，抑制软骨细胞分解代谢。
[0082]
本发明还提供了上述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐、或药物组合物在制备用于维持软骨下骨稳态，抑制骨关节炎早期软骨下骨中破骨细胞分化活性从而抑制软骨下骨非偶联的骨重构，减少骨赘形成的药物中的应用。
[0083]
本发明中，所述三氮唑类化合物及其衍生物或药学上可接受的盐用于抑制或缓解上述疾病或症状。
[0084]
本发明中，在小鼠aclt骨关节炎模型中，ep4特异性小分子抑制剂三氮唑类化合物及其衍生物抑制骨关节炎中软骨下骨非偶联的骨重构，维持软骨下骨稳态，抑制骨关节炎进展。
[0085]
本发明中，在衰老小鼠自发骨关节炎模型中，ep4特异性小分子抑制剂三氮唑类化合物及其衍生物抑制骨关节炎中软骨下骨非偶联的骨重构，维持软骨下骨稳态，抑制骨关节炎进展。
[0086]
本发明通过体内前交叉韧带断裂(aclt)小鼠骨关节炎模型和衰老小鼠自发骨关节炎模型发现三氮唑类化合物及其衍生物可以抑制骨关节炎情况下软骨下骨非偶联的骨重构，维持软骨下骨稳态，抑制骨关节炎的进展。本发明药物可用于骨关节炎疾病的治疗。
[0087]
本发明的有益效果在于：本发明公开的结构新颖的三氮唑类化合物可作为靶向前列腺素受体ep4的一系列小分子拮抗剂，可用于治疗骨关节炎引起的软骨退变以及软骨下骨病变以及疼痛，促进关节软骨成软骨化，抑制关节软骨肥大化，促进软骨的合成代谢、抑制分解代谢，促进软骨再生，进而修复关节软骨损伤；同时可维持软骨下骨稳态，抑制骨关节炎早期软骨下骨中破骨细胞分活性从而抑制软骨下骨非偶联的骨重构，减少骨赘形成。本发明提供的小分子化合物还可用于研究体外或体内治疗骨关节炎的用途。本发明还涉及该三氮唑类化合物的制备方法，所述方法具有合成简单、反应产率高、纯化方便以及保持产物性质稳定的优点。
附图说明
[0088]
图1所示为利用原代小鼠软骨细胞筛选新型ep4受体小分子拮抗剂，其中，
[0089]
图1a、b所示为抑制软骨细胞分解代谢效果最明显的7个化合物对mmp3 与mmp13的抑制效果。黑色实心柱显示抑制mmp3、mmp13效果较好的 hl-1-148和hl-3-55。
[0090]
图1c所示为hl-1-148与hl-3-55的口服生物利用度。
[0091]
图2所示为新型ep4拮抗剂hl-1-148抑制软骨分解代谢、促进合成代谢，其中，
[0092]
图2a所示为qrt-pcr分析原代软骨细胞在1ng/ml il-1β和不同浓度的 hl-1-148(0.3μm，1μm，3μm，10μm，30μm)处理24小时后，分解代谢因子 mmp13、mmp3、mmp9的表达，n＝
3。
[0093]
图2b所示为用1ng/ml il-1β和图中所示浓度的hl-1-148处理原代软骨细胞 24小时，通过western blot检测col2、mmp13和mmp3的蛋白表达水平。该结果表明hl-1-148可剂量梯度地下调软骨分解代谢相关基因。
[0094]
图2c所示为qrt-pcr分析人的关节原代软骨细胞在1ng/ml il-1β和10μm 的celecoxib，30μm的grapiprant、hl-1-148处理12hr后，检测软骨合成代谢相关基因col2a1、sox9、acan。该结果表明hl-1-148比celecoxib、grapiprant 具有更好的促进软骨细胞合成代谢的作用。
[0095]
图3所示为筛选出的两种化合物hl-1-148与hl-3-55以及阳性药celecoxib 和grapiprant的体内体外毒性分析，其中，
[0096]
图3a-d所示为用hl-1-148与hl-3-55以及阳性药celecoxib和grapiprant 处理小鼠原代软骨细胞72小时，用cck-8法评估细胞存活率，分别计算ic
50
值。所有实验为三次重复。
[0097]
图3e所示为药物的体内毒性测试，检测孵化后24小时的斑马鱼胚胎的死亡率，以及孵化后72小时的斑马鱼存活数量及畸形情况，(n＝30)。
[0098]
图4所示为hl-1-148在人关节炎软骨外植体中通过抑制mmps活性和促进细胞外基质生成，下调软骨基质分解代谢，其中，
[0099]
图4a所示为使用celecoixb、grapiprant和hl-1-148处理oa患者软骨外植体7天后，通过番红和快绿染色检测软骨外植体的蛋白多糖含量。每组n＝5。
[0100]
图4b所示为蛋白多糖释放相关的未染色面积(％)，采用番红和快绿染色染色法测定(各组n＝5,sd)。
[0101]
图4c所示为用1,9-二甲基亚甲基蓝(dmmb)测定人软骨外植体中总糖胺聚糖(gag)的释放。分泌的gag与软骨外植体的湿重之间的比率被正常化来计算 gag的释放。说明hl-1-148可以抑制人软骨外植体基质中的糖胺聚糖释放，在炎性环境中起到保护软骨的作用。
[0102]
图5所示为hl-1-148在小鼠关节炎软骨外植体中通过抑制mmps活性和促进细胞外基质生成，下调软骨基质分解代谢，其中，
[0103]
图5a所示为番红和快绿检测小鼠股头48小时的il-1β以及celecoixb，grapiprant，和hl-1-148处理后的染色。每组n＝3；比例尺，100μm。
[0104]
图5b所示为各组释放出的总蛋白多糖含量。结果表明hl-1-148可以抑制小鼠关节软骨外植体基质中的糖胺聚糖释放，在炎性环境中起到保护软骨的作用。
[0105]
图5c所示为mmp13的免疫荧光染色。结果表明hl-1-148可下调关节软骨 mmp13的表达。
[0106]
图6所示为，ep4拮抗剂hl-1-148在dmm(destabilization ofthe medial meniscus)手术引起的骨关节炎中起到保护关节软骨作用，其中，
[0107]
图6a所示为野生型8周龄雄鼠dmm手术或sham手术后每天口服灌胃给药6周，每天给药剂量如图所示，膝关节的番红和快绿染色，红色为关节软骨，标尺，200μm。结果表明，相比两个阳性药，较低剂量给药的hl-1-148治疗显著抑制了关节软骨退变，上调蛋白聚糖含量，使得safranin-o染色的红色加深，关节软骨完整性更好。
[0108]
图6b所示为sham、溶剂对照vehicle组、celecoxib组、grapipant组、hl-1-148 组
对膝关节滑膜炎h&e染色，每组n＝8，标尺，100μm。结果表明，相比两个阳性药，较低剂量给药的hl-1-148治疗显著下调dmm手术引起的滑膜炎症。
[0109]
图6c所示为dmm手术后6周，sham、溶剂对照vehicle组、celecoxib组、 grapipant组、hl-1-148组治疗的小鼠膝关节关节软骨切片的免疫组化染色。标尺，100m。结果表明hl-1-148有效下调关节软骨分解代谢相关的基因mmp13、 colx的表达，促进关节软骨合成代谢相关的基因col2、acan、sox9的表达，起到保护软骨的作用。
[0110]
图6d所示为图6a相应的骨关节炎评分(oarsi score)。结果表明hl-1-148 治疗组oarsi评分最低，有效治疗手术引起的骨关节炎。
[0111]
图6e所示为图6b相应的滑膜炎评分。表明hl-1-148治疗组有效下调滑膜炎症评分。
[0112]
图6f所示为手术后6周，通过von frey和热辐照分析口服指定药物对缓解骨关节炎引起的疼痛的作用。(n＝8)。结果表明hl-1-148有效抑制了手术引起的骨关节炎导致的关节痛。
[0113]
图7所示hl-1-148可以减少衰老小鼠的关节软骨退变，其中，
[0114]
图7a所示为23月龄小鼠膝关节切片的番红快绿染色，从20月龄开始每天分别灌胃30mg/kg的vehicle，celecoxib或hl-1-148治疗3个月。每组n＝8，标尺，200μm。结果表明hl-1-148治疗可保护衰老小鼠的关节软骨。
[0115]
图7b所示为图7a中软骨厚度的统计，表明hl-1-148可显著上调衰老小鼠关节软骨的厚度。
[0116]
图7c所示为免疫染色检测衰老小鼠在口服vehicle、celecoxib或hl-1-148 治疗3个月后，膝关节切片的colx、mmp13和sox9表达。标尺，100μm。结果表明hl-1-148可下调关节软骨的colx、mmp13的表达，上调sox9的表达，延缓衰老导致的关节软骨的退变。
[0117]
图8所示hl-1-148可修复大鼠膝关节软骨全层缺损，其中，
[0118]
图8a所示为大鼠进行膝关节全层软骨缺损手术后6周的软骨修复再生情况。肉眼可见含有缓释hl-1-148的水凝胶与水凝胶对照比可有效修复关节软骨缺损，每组n＝4。
[0119]
图8b所示为手术后6周大鼠膝关节关节切片的h&e染色。
[0120]
图8c所示为手术后6周大鼠膝关节关节切片的番红快绿染色，标尺，500μm，虚线圆表示缺陷区域。结果表明hl-1-148可显著促进软骨缺损的修复，促进新生软骨的产生，比grapiprant具有更好的修复关节软骨缺损的作用。
[0121]
图8d所示为图8a对应的软骨缺损再生组织的宏观评分。结果表明膝关节全层软骨缺损手术后6周，从关节软骨外观观察hl-1-148可有效修复关节软骨损伤。
[0122]
图8e所示为图8c对应的软骨切片中软骨缺损再生组织的组织学评分。结果表明hl-1-148在膝关节全层软骨缺损手术后，可有效修复缺损组织，促进软骨的生成。
[0123]
图9所示为ep4特异性小分子抑制剂hl-1-148对前交叉韧带断裂诱导的小鼠骨关节炎模型有很好的治疗效果。图9a、图9b、图9c是hl-1-148治疗前交叉韧带断裂诱导的小鼠骨关节炎。结果表明hl-1-148能够有效抑制前交叉韧带断裂诱导的小鼠骨关节炎的进展。
[0124]
图10所示为ep4特异性小分子抑制剂hl-1-148对衰老小鼠诱导的自发骨关节炎模型有很好的治疗效果。其中，图10a是hl-1-148治疗衰老小鼠诱导的自发骨关节炎。结果表明hl-1-148能够有效抑制衰老小鼠诱导的自发骨关节炎的进展。
[0125]
图11所示为ep4特异性小分子抑制剂hl-1-148能够抑制骨关节炎中小鼠痛觉的产生。其中，图11a是hl-1-148对前交叉韧带断裂诱导的小鼠骨关节炎模型中痛觉产生的抑制效果。结果表明hl-1-148能够有效抑制手术引起的骨关节炎导致的关节痛。
[0126]
数据取平均值并加了标准差表示。显著性分析用student-t检验，各组之间比较采用two-way anova检验，当p《0.05时具有统计学差异(*)，p《0.01时为显著性统计学差异(**)，p《0.001时为极显著性统计学差异(***)。
具体实施方式
[0127]
现结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0128]
实施例1-1、化合物(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢-1,2,3-三唑
ꢀ-
5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0129][0130]
在无水二甲亚砜(8ml)中加入1-(2-溴乙氧基)-4-氟苯(657mg,3.00mmol)和叠氮化钠(215mg,3.30mmol)，在室温下搅拌12小时，反应结束后加水和乙酸乙酯进行萃取，取有机层加入一定量无水硫酸钠，过滤，经减压蒸干有机溶剂，无需进一步纯化，得到粗产物1-(2-叠氮基乙氧基)-4-氟苯(516mg,产率95％)。
[0131]
将1-(2-叠氮基乙氧基)-4-氟苯(516mg,2.85mmol)加入到甲苯溶液(15ml)中，然后加入苯丙炔酸乙酯(496mg,2.85mmol)，在120℃条件下回流8小时，反应结束后冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，经过柱层析纯化，得到中间体1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-苯基-5-甲酸乙酯(446mg,产率44％)。
[0132]
将1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-苯基-5-甲酸乙酯(446mg, 1.25mmol)和相应的量的一水合氢氧化锂(262mg,6.25mmol)加入四氢呋喃/甲醇/ 水(4ml/4ml/2ml)的混合溶液中，在68℃条件下搅拌3h小时，减压蒸干有机溶剂，加水溶解，然后用1m hcl(3ml)调ph至弱酸性，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干溶剂后得到1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-苯基-5-甲酸(393mg,产率 96％)。
[0133]
将1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-1h-1,2,3-三唑-4-苯基-5-甲酸(393mg,1.20mmol)， (s)-4-(1-氨基乙基)苯甲酸甲酯(255mg，1.32mmol)以及，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’-
四甲基脲六氟磷酸酯(547mg，1.44mmol)一并加入到n,n-二甲基甲酰胺(8ml)中，然后加入n，n-二异丙基乙胺(0.42ml,2.40mmol)，在室温下搅拌5h，反应结束后加入水，并用乙酸乙酯萃取，常规处理后经柱层析纯化，得到(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-苯基-1
氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸乙酯(506mg,产率84％)。
[0134]
将(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基) 苯甲酸乙酯(506mg,1.00mg)和相应的量的一水合氢氧化锂(210mg,5.00mmol)加入四氢呋喃/甲醇/水(4ml/4ml/2ml)的混合溶液中，在67℃条件下搅拌3h小时，减压蒸干有机溶剂，加水溶解，然后用1m hcl(3ml)调ph至弱酸性，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干溶剂后，常规处理后经柱层析纯化，得到目标产物(460mg,97％)。1h nmr(500mhz,dmso)δ12.88(s,1h),9.52(d,j＝7.9hz,1h),7.89(d,j＝ 8.2hz,2h),7.65(dd,j＝6.6,3.0hz,2h),7.47(d,j＝8.3hz,2h),7.43-7.29(m, 3h),7.14-7.01(m,2h),6.85(dd,j＝9.1,4.4hz,2h),5.32-5.20(m,1h),4.79(t,j＝5.1hz, 2h),4.30(t,j＝6.2hz,2h),1.41(d,j＝7.0hz,3h)。
[0135]
实施例1-2、化合物4-(1-1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)环丙基)苯甲酸的制备
[0136][0137]
将(s)-4-(1-氨基乙基)苯甲酸甲酯置换成4-(1-氨基环丙基)-苯甲酸甲酯，按实施例1-1的方法制备。1h nmr(500mhz,dms0)δ12.86(s,1h),9.69(s,1h),7.81(d, j＝8.5hz,2h),7.66(d,j＝8.2hz,2h),7.45(dd j＝15.6,8.2hz,3h),7.36(d,j＝8.5hz, 2h),7.09(t,j＝8.8hz,2h),6.92(dd,j＝9.2,4.4hz,2h),4.84(t,j＝5.0hz,2h),4.37(t, j＝5.0hz,2h),1.36(t,j＝6.4hz,2h),1.30(t,j＝5.8hz,2h)。
[0138]
实施例1-3、化合物(s)-4-(1-(1-(2-(3-(三氟甲基)苯氧基)乙基)-4-苯基-1氢
ꢀ-
1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0139][0140]
将1-(2-溴乙氧基)-4-氟苯置换成1-(2-溴乙氧基)-3-(三氟甲基)苯，按实施例1-1的方法制备。1h nmr(500mhz,dms0)δ12.80(s,1h),9.57(d,j＝7.7hz,1h), 7.88(d,j＝8.1hz，2h),7.65(d,j＝5.3hz,2h),7.48(t，j＝9
·
8hz，3h),7.39(d,j＝ 2.4hz,3h),7.29(d，j＝7.5hz,1h),7.17(d,j＝7.1hz,2h),5.31-5.21(m,1h), 4.89-4.77(m,2h),4.51-4.38(m,2h),1.42(d,j＝6.9hz,3h)。
[0141]
实施例1-4、化合物(s)-4-(1-(1-4-(三氟甲基)苄基)-4-环丙基-1氢-1,2,3-三唑-5
-ꢀ
甲酰胺基)乙基)苯甲酸的制备
(三氟甲基)苄基)-1h-1,2,3-三唑-5-甲酸(271mg,产率 96％)。
[0151]
将4-(噻吩-3-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1h-1,2,3-三唑-5-甲酸(271mg, 0.77mmol)，(s)-4-(1-氨基乙基)苯甲酸甲酯(164mg，0.85mmol)以及，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’-
四甲基脲六氟磷酸酯(351mg，0.93mmol)一并加入到n,n
-ꢀ
二甲基甲酰胺(8ml)中，然后加入n，n-二异丙基乙胺(0.27ml,1.54mmol)，在室温下搅拌5h，反应结束后加入水，并用乙酸乙酯萃取，常规处理后经柱层析纯化，得到(s)-4-(1-(4-(噻吩-3-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基) 乙基)苯甲酸乙酯(342mg,产率84％)。
[0152]
将(s)-4-(1-(4-(噻吩-3-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基) 乙基)苯甲酸乙酯(342mg,0.647mmol)和相应的量的一水合氢氧化锂(136mg, 3.24mmol)加入四氢呋喃/甲醇/水(4ml/4ml/2ml)的混合溶液中，在67℃条件下搅拌3h小时，减压蒸干有机溶剂，加水溶解，然后用1m hcl(3ml)调ph至弱酸性，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干溶剂后，常规处理后经柱层析纯化，得到目标产物 (314mg,97％)。1h nmr(500mhz,dmso)δ12.85(s,1h),9.44(d,j＝7.9hz, 1h),7.86(d,j＝8.0hz,2h),7.70(d,j＝0.9hz,1h),7.68-7.58(m,3h),7.39(d,j＝ 5.0hz,1h),7.34(t,j＝8.2hz,4h),5.74(q,j＝15.7hz,2h),5.16(p,j＝7.1hz,1h), 1.35(d,j＝7.0hz,3h).
[0153]
实施例1-6、化合物(s)-4-(1-(4-(丙-1-烯-1-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢
ꢀ-
1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0154][0155]
将实施例1-5方法的第四步前增加一步实验，取上一步产物(150mg,0.4mmol) 溶于n，n-二甲基甲酰胺(5ml)中，加入稀丙基三丁基锡(0.16ml,0.5mmol)，醋酸钯(9mg，0.04mmol)，三苯基膦(32mg，0.12mmol)，在惰性气体保护下，95℃条件下反应12h后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，常规处理后过硅胶柱，得4-(丙
ꢀ-
1-烯-1-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1h-1,2,3-三唑-5-甲酸乙酯(101mg，75％)。其它的步骤都相同。1h nmr(500mhz,dmso)δ12.89(s,1h),9.27(d,j＝8.0hz,1h), 7.87(d,j＝8.3hz,2h),7.62(d,j＝8.2hz,2h),7.37(d,j＝8.2hz,2h),7.28(d,j＝8.0hz,2h), 6.56-6.47(m,1h),6.39(d,j＝1.7hz,1h),5.72(d,j＝1.7hz,2h),5.14-5.07(m,1h), 1.85(dd,j＝6.7,1.5hz,3h),1.39(d,j＝7.0hz,3h)。
[0156]
实施例1-7、化合物(s)-4-(1-(4-(丙-1-炔-1-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢
ꢀ-
1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0157][0158]
将实施例1-5方法的第四步前增加一步实验，取上一步产物(150mg,0.4mmol) 溶于n，n-二甲基甲酰胺(5ml)中，加入入1-丙炔基-三正丁基锡(0.16ml,0.5mmol)，醋酸钮(9mg，0.04mmol)，三苯基膦(32mg，0.12mmol)，在惰性气体保护下，95℃条件下反应12h后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，常规处理后过硅胶柱，得4-(丙-1-烯-1-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1h-1,2,3-三唑-5-甲酸乙酯(101mg，75％)。其它的步骤都相同。1h nmr(500mhz,dms0)δ12.88(s,1h),9.07(d,j＝7.8hz,1h), 7.89(d,j＝7.7hz,2h),7.67(d,j＝7.9hz,2h),7.44(d,j＝7.8hz,2h),7.32(dd,j＝20.7, 8.2hz,2h),5.87-5.73(m,2h),5.12(dd,j＝13.9,6.9hz,1h),2.11(s,3h),1.39(d,j＝6.8hz, 3h)。
[0159]
实施例1-8、化合物(s)-4-(1-(4-(呋喃-3-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3
-ꢀ
三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0160][0161]
将3-噻吩硼酸置换成3-呋喃硼酸，按实施例1-5的方法制备。1h nmr (500mhz,dmso)δ12.82(s,1h),9.39(d,j＝7.9hz,1h),7.94(s,1h),7.86(d,j＝8.0hz, 2h),7.77(s,1h),7.63(d,j＝8.0hz,2h),7.36(t,j＝9.3hz,2h),7.30(d,j＝8.0hz,2h), 6.74(s,1h),5.81-5.67(m,2h),5.14(dd,j＝14.3,7.2hz,1h),1.37(d,j＝6.9hz,3h)。
[0162]
实施例1-9、化合物(s)-4-(1-(5-(甲基噻吩-2-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢
ꢀ-
1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0163][0164]
将3-噻吩硼酸置换成5-甲基噻酚-2-硼酸，按实施例1-5的方法制备。1hnmr(500mhz,dmso)δ12.85(s,1h),9.44(d,j＝7.9hz,1h),7.86(d,j＝8.0hz, 2h),7.70(d,j＝0.9hz,1h),7.68-7.58(m,3h),7.39(d,j＝5.0hz,2h),7.34(d,j＝ 8.2hz,2h),5.74(q,j＝15.7hz,2h),5.16(p,j＝7.1hz,1h),2.88(d,j＝7.0hz,3h),1.35 (d,j＝6.5hz,3h)。
[0165]
实施例1-10、化合物(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-(5-甲基噻吩-2-基)-1 氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0166][0167]
将4-三氟甲基苄溴置换成1-(2-溴乙氧基)-4-氟苯，3-噻吩硼酸置换成5-甲基噻酚-2-硼酸，按实施例1-5的方法制备。1h nmr(500mhz,dmso)δ12.88(s,1h), 9.52(d,j＝7.9hz,1h),7.89(d,j＝8.2hz,2h),7.65(dd,j＝6.6,3.0hz,2h),7.47(d,j＝8.3hz, 2h),7.14-7.01(m,2h),6.85(dd,j＝9.1,4.4hz,2h),5.32-5.20(m,1h),4.79(t,j＝5.1hz, 2h),4.30(t,j＝6.2hz,2h),2.76(d,j＝6.7hz,3h),1.40(d,j＝7.0hz,3h)。
[0168]
实施例1-11、化合物(s)-4-(1-(1-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-4-(5-甲基呋喃-2-基)-1 氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0169][0170]
将4-三氟甲基苄溴置换成1-(2-溴乙氧基)-4-氟苯，3-噻吩硼酸置换成5-甲基呋喃-2-硼酸，按实施例1-5的方法制备。1h nmr(500mhz,dmso)δ12.88(s, 1h),9.52(d,j＝7.9hz,1h),7.89(d,j＝8.2hz,2h),7.65(dd,j＝6.6,3.0hz, 2h),7.47(d,j＝8.3hz,2h),7.14-7.01(m,2h),6.85(dd,j＝9.1,4.4hz,2h),5.32-5.20 (m,1h),4.79(t,j＝5.1hz,2h),4.30(t,j＝6.2hz,2h),2.81(d,j＝6.6hz,3h),1.41(d,j ＝7.0hz,3h)。
[0171]
实施例1-12、化合物(s)-4-(1-(4-环己基-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢-1,2,3-三唑
ꢀ-
5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0172][0173]
将3-噻吩硼酸置换成环己烯-1-基硼酸，所得产物在氢气气氛下，乙醇溶液中经pd/c还原得乙基4-环己基-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1氢1,2,3-三唑-5-羧酸乙酯。接下来按实施例1-5的方法制备。1h nmr(500mhz,dmso)δ12.8(s,1h), 9.13(d,j＝8.1hz,1h),7.88(d,j＝7.9hz,2h),7.64(d,j＝8.0hz,2h),7.38(d,j＝ 7.9hz,2h),7.31(d,j＝7.9hz,2h),5.75-5.63(m,2h),5.14(dd,j＝14.3,7.0hz, 1h),2.86(t,j＝11.5hz,1h),1.72(dd,j＝
31.2,8.4hz,4h),1.54-1.44(m,2h),1.37 (d,j＝7.0hz,3h),1.24-1.15(m,4h)。
[0174]
实施例1-13、化合物(s)-4-(1-(1-(4-(三氟甲基苄基)-4-(4-氟苯基)-1氢-1,2,3
-ꢀ
三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0175][0176]
将3-噻吩硼酸置换成4-氟苯硼酸，按实施例1-5的方法制备。1h nmr (500mhz,dmso)δ12.83(s,1h),9.07(d,j＝8.1hz,1h),7.87(d,j＝8.0hz,2h), 7.65(d,j＝7.8hz,2h),7.48(d,j＝8.0hz,2h),7.41(d,j＝8.0hz,2h),7.26(d,j＝ 8.7hz,2h),7.18(d,j＝7.6hz,2h),5.65(s,2h),5.16-5.04(m,1h),1.48(d,j＝ 6.8hz,3h)。
[0177]
实施例1-14、化合物(s)-4-(1-(4-(3,6-二氢-吡喃-4-基)-1-(4-(三氟甲基)苄基)-1 氢-1,2,3-三唑-5-甲酰氨基)乙基)苯甲酸的制备
[0178][0179]
将3-噻吩硼酸置换成3，6-二氢-吡喃-4-硼酸，按实施例1-5的方法制备。1hnmr(500mhz,dmso)δ12.87(s,1h),9.34(d,j＝8.2hz,1h),7.87(d,j＝7.9hz, 2h),7.65(d,j＝8.0hz,2h),7.35(dd,j＝15.4,7.9hz,4h),6.07(s,1h),5.66(q,j＝ 15.7hz,2h),5.16-5.06(m,1h),4.07(q,j＝18.0hz,2h),3.80-3.64(m,2h),2.39 (s,2h),1.33(d,j＝6.9hz,3h)。
[0180]
实施例2：在小鼠原代软骨细胞中筛选ep4新型小分子拮抗剂。将剥离三天之内的乳鼠的膝关节软骨，用pbs洗净后剪碎，胰酶消化30min，37℃；800rpm 离心3min，然后去除胰酶，加二型胶原酶(0.1％)消化过夜(0.2％二型胶原酶大约4h)，第二天离心，去除二型胶原酶，加dmem-f12培养基(含血清和双抗) 培养在10cm皿中，培养2-3后进行相关细胞实验。然后将1ng/ml il-1β同时加入一系列ep4的小分子拮抗剂(本发明实施例1-14制备的化合物)中，24h后同时提取mrna反转成cdna检测mmp13的表达。结果发现部分小分子拮抗剂可以在mrna水平不同程度地下调mmp13，其中效果较明显的有7个化合物 (图1a)。同时，本发明也利用筛选出来的7种效果较明显的小分子拮抗剂进一步对mmp13和mmp3的表达进行检测。celecoxib购买于damas-beta公司 (29322b)、grapiprant购买于羽朵生物。
[0181]
表1本发明化合物对人/鼠前列腺素e2受体ep4亚型钙流抑制效果
[0182][0183]
max190)中，在450nm 波长下测定其od值。小鼠关节软骨细胞原代培养采用不同剂量(1-1000μm)的 hl-1-148或hl-3-55、celecoxib和grapiprant处理，并用cck-8法评估其生存能力。结果表明，celecoxib具有较高的毒性，ic
50
约为34.7μm，hl-1-148毒性最小，其ic
50
为582.4(图3a-d)。
[0194]
通过斑马鱼胚胎毒性试验，检测hl-1-148、celecoxib和grapiprant的体内毒性。以加入溶剂对照的斑马鱼胚胎作为对照，与hl-1-148、celecoxib和 grapiprant处理的斑马鱼胚胎进行比较。hl-1-148在24hpf(hours post-fertilization) 时死亡率较低，在72hpf时孵化率较高，畸形率较对照组低(图3e)。
[0195]
实验结果见图3，本发明所述ep4受体拮抗剂hl-1-148与hl-3-55以及 celecoxib和grapiprant相比具有最低的软骨细胞体外毒性。在斑马与胚胎毒性实验中，hl-1-148与celecoxib和grapiprant相比在体内毒性最低，具有较好的成药潜力。
[0196]
实施例5：在骨关节炎病人软骨外植体中，hl-1-148通过抑制mmps的活性和促进胞外基质的产生来保护关节软骨。取关节置换手术废弃的骨关节炎病人软骨组织，将外植体(3mmx3mm)置于24孔板中，在1ml无血清f12培养基中培养24h，用血清改变培养基，分别加入1ng/ml il-1β、celecoxib、grapiprant、 hl-1-148培养7天。收集培养基用于释放糖胺聚糖。为了量化gags，将培养基与甲酸缓冲液中的二甲亚甲基蓝混合，使用spectramax(molecular devices, sunnyvale,ca)测定535nm的吸光度。分泌的蛋白聚糖与软骨外植体重量的比率被均一化，以计算蛋白聚糖的释放，并对处理后的软骨进行番红快绿染色。配制 0.1％的番红染液，0.05％固绿染液，1％的冰乙酸，95％酒精。将脱好腊的组织切片放入0.1％的番红染液5分钟，水洗三遍，再放入0.05％固绿染液5分钟，洗三遍，1％的冰乙酸10s，洗三遍，95％酒精1-2分钟，100％酒精2分钟，二甲苯封片。
[0197]
实验结果见图4，hl-1-148显示出比其他对照组及阳性药物更好的抑制软骨蛋白聚糖释放的作用，蛋白多糖含量和蛋白聚糖染色面积百分比由红色染料 o-fast绿色染色显著增加(图4a、b)，celecoxib和grapiprant也有抑制作用，但 hl-1-148显示出最好的抑制蛋白聚糖释放的功效(图4c)。
[0198]
根据实验结果可见，本发明所述小分子hl-1-148具有抑制人关节软骨外植体软骨基质蛋白聚糖释放的作用，可以用于抑制骨关节炎导致的软骨分解代谢上调而引起的软骨退变。
[0199]
实施例6：小鼠关节软骨外植体中，hl-1-148通过抑制mmps的活性和促进胞外基质的产生来保护关节软骨。对10周龄的野生型小鼠进行股骨头软骨外植体分离。将股骨头切下，置于f12培养基中。将股骨头软骨外植体置于24孔板中，在1ml无血清f12培养基中培养24h，用血清换培养基，分别加入1ng/ml il-1β、celecoxib、grapiprant、hl-1-148处理48h。收集培养基用于释放糖胺聚糖，对软骨外植体进行番红快绿染色。并用免疫组化检测软骨外植体的mmp13 的表达：
[0200]
1.烤片：将石蜡切片的关节腿骨切片置于热台(60℃)上烤片1h。
[0201]
2.组织脱腊、抗原的修复：
[0202]
水浴锅温度调至100℃，配置抗原修复液(10xtris-edta)，将片子放入加满修复液的修复盒中，并置于100℃的水浴锅中，盖紧抗原修复盒的盖子，20min 后将其抗原修复盒整个取出，自然的冷却。
[0203]
4.去除过氧化氢酶：pbst洗两遍，在4％pfa固定，10min后pbst洗两遍，将切片滴加3％过氧化氢，过氧化氢用甲醇稀释，避光10min后，水洗2-3遍。
[0204]
5.打孔：用tritonx-100(1xpbs500ml加入1ml tritonx-100)打孔10min。
[0205]
6.封闭：滴加封闭液液(1x)，将切片置于湿盒中，室温放置1h.
[0206]
7.一抗：直接甩掉封闭液，将i抗用抗体稀释液稀释，在4度冰箱过夜。
[0207]
8.二抗：pbst洗3遍片子，大约3min每次，滴加免疫组化二抗1h，用pbst 洗3遍，每次3min。
[0208]
9.abc：滴加abc，1h后直接甩掉abc，用pbst洗3遍，每次3min。
[0209]
10.ihc显色：避光配置1x显色液，显微镜下判断显色程度。
[0210]
11.染核过程：染核用苏木精5min，自来水洗3遍，酒精盐酸(75％配置1％终浓度盐酸)反蓝10-20s，观察细胞核变淡蓝色。封片。
[0211]
实验结果见图5，hl-1-148显示出比其他对照组及阳性药物更好的抑制软骨蛋白聚糖释放的作用，蛋白多糖含量和蛋白聚糖染色面积百分比由红色染料 o-fast绿色染色显著增加(图5a、b)，celecoxib和grapiprant也有抑制作用，但 hl-1-148显示出最好的抑制蛋白聚糖释放的功效(图5c)。
[0212]
小鼠股骨头软骨外植体在il-1β(1ng/ml)的刺激下分别加hl-1-148、 celecoxib、grapiprant后，hl-1-148可显著抑制软骨外植体的蛋白聚糖释放。免疫组化染色显示hl-1-148有效减少mmp13在软骨中的表达。
[0213]
根据实验结果可见，本发明所述小分子hl-1-148可抑制小鼠节软骨外植体软骨基质蛋白聚糖在il-1β(1ng/ml)的炎性环境中的释放，可以用于抑制骨关节炎导致的软骨分解代谢上调而引起的软骨退变。
[0214]
实施例7：在小鼠中，hl-1-148可延缓手术引起的骨关节炎导致的软骨退变。骨关节炎手术模型采用野生型小鼠(c57/bl/6)。8周龄雄性小鼠进行dmm手术，假手术小鼠作为对照组。术后6周收集膝关节进行组织学分析。采用国际骨关节炎研究协会(oarsi)组织病理学分级系统对切片进行评估。术后1天开始每日灌胃给药ep4抑制剂以及对照进行治疗，持续8周，ep4抑制剂溶于浓度为0.5％的羧甲基纤维素钠，对照组仅含羧甲基纤维素钠。随后进行痛觉行为学测定：机械痛：利用冯弗雷测痛套件测小鼠的足底，记录小鼠撤腿的冯弗雷针大小，每只小鼠测3次，每次按照sudo法测定，最终数据取三次测定平均值为该小鼠最终机械痛值。热痛：利用爪痛觉测试仪测试热源照射小鼠的足底，记录小鼠撤腿时的反应时间。每只小鼠测3次，取平均值为该小鼠最终热痛值。关节组织随后进行番红快绿染色以及h&e染色。并对软骨分解代谢标记物mmp13、colx以及合成代谢标记物col2a1、acan、sox9进行染色。
[0215]
实验结果见图6，hl-1-148治疗使得软骨损伤减轻，骨关节炎评分下降(图 6a、d)，骨关节炎导致的滑膜炎被抑制(图6b、e)，关节疼痛减轻(图6f)。与对照组相比，hl-1-148治疗小鼠的mmp13、colx免疫组化染色也在关节软骨处降低，而col2、acan、sox9在hl-1-148处理小鼠中升高(图6c)。
[0216]
根据实验结果可见，本发明所述小分子hl-1-148可治疗手术引起的关节炎，并缓解关节疼痛。可用于开发治疗骨关节炎引起的软骨退变，有效缓解关节疼痛的药物的用途。
[0217]
实施例8：野生型雄性小鼠(c57/bl/6)在相同条件下饲养至20月龄。从20 个月到
23个月，灌胃给药celecoxib和hl-1-148，每天30mg/kg，每组10只。分析膝关节组织学。
[0218]
实验结果见图7，采用hl-1-148治疗3个月，可缓解小鼠的关节软骨的衰老退变，增加关节软骨的厚度和完整性，23月龄的野生型小鼠显示出衰老相关软骨退变表型，例如，番红染色减少，软骨变薄，软骨缺损，hl-1-148治疗有效保护软骨的完整性，番红染色增强，关节软骨增厚(图7a、b)。且hl-1-148 还上调sox9表达、抑制软骨分解代谢相关标志物如colx、mmp13的表达(图 7c)。
[0219]
根据实验结果可见，hl-1-148能有效保护衰老小鼠关节软骨的完整性，可用于治疗衰老导致的软骨退变疾病。
[0220]
实施例9：hl-1-148通过促进软骨再生来保护软骨完整性，促进软骨缺损大鼠的关节软骨修复。淀粉水凝胶的制备采用固定的水-淀粉质量比为5，交联剂 ca(no3)2
·
4h2o溶于淀粉溶液中。混合物在60℃下搅拌1小时，得到粘性凝胶。经uv消毒30分钟后使用。药物hl-1-148和grapiprant分别溶解于dmso溶剂(100mm)中。将溶液按重量比1/10(w/w)混合制成药物/凝胶。
[0221]
淀粉水凝胶可以在体内缓释hl-1-148或阳性药grapiprant，具有支架的功能，促进细胞在软骨缺损部位沉积。本发明分别制备hl-1-148、grapiprant的凝胶，将其注射到雄性大鼠膝关节内修复手术引起的关节软骨缺损。雄性sd大鼠 (280～300g)分为3组(n＝4)，用3.5％水合氯醛(10ml/kg)麻醉大鼠，仰卧固定于手术台上。用手术刀沿右膝髌骨内侧缘纵向切开2厘米，打开包膜，露出关节软骨表面。用直径2mm的手动钻在大鼠股骨髁间窝(2mm*2mm)钻孔。当血液从缺损处流出时，停止钻孔。纱布用生理盐水冲洗后压紧。采用上述步骤建立软骨缺损模型，对照组关节腔注射100μl凝胶，hl-1-148水凝胶组注射等量的含有 hl-1-148的凝胶，grapiprant凝胶组注射100μl含有grapiprant的凝胶。逐层缝合韧带和皮肤。6周后，通过组织学染色和相关评分对修复关节软骨进行组织学分析。
[0222]
实验结果见图8，植入凝胶6周关节腔恢复情况显示，含hl-1-148的水凝胶的软骨修复功能优于grapiprant。治疗6周后，软骨缺损在对照水凝胶组和含有grapiprant的水凝胶组均存在，但hl-1-148水凝胶治疗组则呈现光滑的关节软骨表面，并充满类软骨状的新生组织(图8)。番红染色表明hl-1-48水凝胶治疗组软骨缺损处形成了软骨组织以及蛋白聚糖的分泌。而grapiprant凝胶组的缺损区域缺少番红染色(图8a、c)。hl-1-48水凝胶治疗组的软骨下骨结构比对照组和grapiprant治疗组更致密(图8b)。
[0223]
根据实验结果可见，hl-1-148比grapiprant具有更好的软骨修复的效果，可以通过促进软骨样组织的形成来修复大鼠关节软骨缺损，可用于开发治疗软骨缺损，促进软骨修复的药物。
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实施例10：前交叉韧带断裂的小鼠骨关节炎模型中，hl-1-148具有良好的治疗效果。原理：体内小鼠实验给予hl-1-148缓解前交叉韧带断裂诱发的小鼠骨关节炎。
[0225]
方法：取10-12周龄的雄性c57bl/6小鼠，用350μl阿弗丁将其麻醉，然后用剃毛刀对小鼠右腿进行剃毛，在右腿关节处用手术刀划开1cm长度的伤口，找到髌韧带，然后辅助人员在髌韧带右侧穿线，将髌韧带扯开，暴露关节腔。将小鼠转移到体式显微镜下，放大倍数控制在8到12倍之间，找到小鼠关节腔，用手术刀划开关节腔，暴露出来前交叉韧带，然后用手术刀将前交叉韧带切断。假手术组只暴露关节腔即可，不切断前交叉韧带。对小鼠的关节腔进行缝合，闭合关节腔，然后将小鼠关节外部的皮肤缝合。将小鼠分为5组，假手术组，
aclt 组，grapiprant组，celecoxib组，hl-1-148组。每组小鼠6只，做完手术第三天待关节腔出炎症消退后开始给药，其中grapiprant组剂量为30mg/kg， celecoxib组剂量为30mg/kg，hl-1-148组剂量为30mg/kg，这些药物均用羧甲基纤维素钠进行悬浮。假手术组和aclt组给予羧甲基纤维素钠，每次给药体积均为100μl，利用灌胃针进行口服灌胃给药。每天上午10点进行给药，连续给药2周、4周和8周。在第2周、第4周、第8周实验结束后，利用颈椎脱臼法处死小鼠，取出做手术的右侧腿骨，利用4％的pfa进行固定48小时，然后进行micro-ct扫描。然后脱钙处理，进行石蜡切片和染色(h&e染色、trap 染色和番红快绿染色)。其中，图9a、图9b、图9c是hl-1-148对于前交叉韧带断裂诱导的小鼠骨关节炎模型具有良好的治疗效果。
[0226]
结果与评价：结果见图9示，图9a、图9b、图9c显示hl-1-148对于前交叉韧带断诱导的小鼠骨关节炎模型具有良好的治疗效果。用micro-ct对小鼠腿骨关节处进行扫描：
[0227]
1.将小鼠腿骨股骨放在micro-ct检测室中固定，用封口膜将股骨端与固定平台缠好固定住，胫骨朝上，垂直放在micro-ct检测室中，然后关闭micro-ct舱门，使用skyscan软件进行扫描操作。检测精度为7μm，检测的时间大概为42 分钟。
[0228]
2.扫描完成后，取出腿骨，放在75％乙醇中保存，用于后续实验。
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3.在这里本发明利用dataviewer软件观察、重构获得的数据，然后再用ctan 软件对数据进行三维重构，最后用ctvol软件对数据进行图像处理。
[0230]
4.ct分析结束后，得到以下参数:骨体积/组织体积(bv/tv)，骨小梁厚度 (tb.th)，骨小梁模式因子(tb.pf)。
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结果表明，在第2周、4周和第8周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠骨赘数量明显减少，并且能够软骨下骨的稳态。h&e染色表明，在第2 周、4周和第8周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠软骨下骨的稳态没有被破坏。trap染色表明，在第2周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠软骨下骨中的破骨细胞活性显著被抑制。番红快绿染色结果表明，在第 8周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠关节软骨磨损明显减少。这表明在前交叉断裂的小鼠骨关节炎模型中，hl-1-148可以通过维持软骨下骨稳态从而抑制骨关节炎的进展。
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实施例11：衰老小鼠自发骨关节炎模型中，hl-1-148具有良好的治疗效果。原理：体内小鼠实验给予hl-1-148治疗衰老小鼠自发的骨关节炎。
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方法：将19月龄的雄性c57bl/6小鼠分为三组，对照组、grapiprant组和 hl-1-148组，每天上午10点进行给药，其中grapiprant组剂量为30mg/kg， hl-1-148组剂量为30mg/kg，对照组给予羧甲基纤维素钠，每次给药体积均为 100μl，利用灌胃针进行口服灌胃给药，grapiprant和hl-1-148均利用羧甲基纤维素钠进行悬浮。连续给药12周，在第2周实验结束后，利用颈椎脱臼法处死小鼠，取出小鼠左侧和右侧腿骨，利用4％的pfa进行固定48小时，然后进行 micro-ct扫描。然后脱钙处理，进行石蜡切片和染色(h&e染色、trap染色和番红快绿染色)。图10a是hl-1-148对于衰老小鼠自发骨关节炎具有良好的治疗效果。
[0234]
结果与评价：结果见图10示，图10a显示hl-1-148对于衰老小鼠自发骨关节炎具有良好的治疗效果。用micro-ct对小鼠腿骨关节处进行扫描，结果表明，在实验12周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠软骨下骨硬化减少。 h&e染色表明，在实验12周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠软骨下骨的稳态没有被破坏。trap染色表明，在实验12周
的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠软骨下骨中的破骨细胞活性无明显变化。番红快绿染色结果表明，在实验12周的时候和aclt组相比，hl-1-148组中的小鼠关节软骨磨损无明显变化，但关节软骨层明显增厚。这表明在衰老小鼠自发的骨关节炎模型中，hl-1-148可以通过维持软骨下骨稳态从而抑制骨关节炎的进展。
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实施例12：交叉韧带断裂的小鼠骨关节炎模型中，hl-1-148具有良好的镇痛效果。原理：体内小鼠实验给予hl-1-148抑制前交叉韧带断裂小鼠骨关节炎模型中痛觉的产生。
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方法：对实施例10中的小鼠，在第2周、第4周、第8周实验结束后，分别利用冯弗雷测痛仪和热痛测痛仪器对小鼠进行测痛。图11a是hl-1-148对前交叉韧带断裂小鼠骨关节炎模型中痛觉的抑制效果。
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结果与评价：结果见图11示，图11a显示hl-1-148可以抑制前交叉韧带断裂小鼠骨关节炎模型中痛觉的产生，不管是机械痛还是热痛，hl-1-148均有良好的抑制效果。这表明在前交叉韧带断裂小鼠骨关节炎模型中，hl-1-148具有良好的镇痛效果。
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本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。