使用合成浸滤剂生物学用于从人为来源回收贵重有毒金属

1.本发明涉及一种使用酶分解氰化物的方法，以及一种用于合成浸滤剂生物学的合成金属回收方法。更特定地，本发明涉及工程化细菌用于涉及生氰作用、浸取的金属离子的还原、氰解(cyanolysis)和氰化物的下游再循环的工艺中的用途。还提供用于紫色色杆菌(c.violaceum)中的转录控制的工具。


背景技术：

2.氰化物易于与大多数主要金属和痕量金属组合形成氰化物复合物，这种特性使得它可用于从矿石提取金属。氰化钠在矿区最常用，其易溶于水，得到钠离子和氰离子cn-。一些cn-会转化为氰化氢hcn，并且其相对量取决于水ph。在高于9.0的ph下，cn-是主要稳定形式。随着ph下降，转化为hcn的cn-的量将增加，hcn易于形成气体并释放至空气中。因此，大多数采矿溶液被维持在高于10.0的ph下，以防止hcn气体的形成以及矿工因吸入而意外中毒。因为氰化物是碳基的，其易于与其他碳基物质反应，从而使得它对于许多活的生物体有毒。因此，含有氰化物的废物在处置前必须进行脱毒。常规方法包括碱性氯化法，所述方法既危险有昂贵。另外，在采矿中使用的氰化物没有快速分解为无害物质时会产生问题。即使这些毒性较低的物质也会在环境中持续存在很长时间，从而可能对水生生态系统造成问题。
3.电子废物再循环工业使用造成严重的环境风险的化学工艺：用于回收贵金属(如金)和去除有毒金属(如铅和汞)的当前工艺包括火法冶金(露天燃烧等)和湿法冶金(酸浸取和工业氰化或氰化物浴)；这些方法是能量密集型的，需要另外的电解步骤进行金属分离，并且具有极高污染性(korte,f.,spiteller,m.和coulston,f.(2000)ecotoxicology and environmental safety 46,241-245；fields,s.(2001)environ health perspect 109,a474-481)。人们已经努力研究使用生物技术浸取工艺来替代工业化学工艺，使得金属回收和修复更简单、有更高成本效益并对环境友好，并且科学家和工程师，如brandl(brandl,h.,lehmann,s.,faramarzi,m.a.和martinelli,d.(2008),hydrometallurgy 94,14-17)、watling(watling,h.r.(2006),hydrometallurgy 84,81-108)和rawlings(rawlings,d.e.(2002),annual review of microbiology 56,65-91)已经对生物技术浸取领域作出了显著贡献。与通过酸溶进行贵金属回收的常规技术相比，当前在生物修复电子废物以回收贵金属(如金)方面的努力涉及使用产生浸滤剂的微生物(korte,f.,spiteller,m.和coulston,f.(2000)ecotoxicology and environmental safety 46,241-245；pham,v.和ting,y.p.(2009),advanced materials research 71,661-664；liang,g.,mo,y.和zhou,q.(2010),enzyme and microbial technology 47,322-326；chi,t.d.,lee,j.c.,pandey,b.d.,yoo,k.和jeong,j.(2011),miner eng 24,1219-1222)。在此类微生物中，金属的生物修复和回收中涉及的浸滤剂通常是氰化氢。虽然可能的氰化氢泄漏对环境造成严重威胁，但是在生物采矿工业中使用微生物限制并最小化此类问题，因为上下文中的微生物既是生氰的(能够生成氰化物等效物)也是氰解的(能够使氰化物等效物脱毒)，从
而实际上确保，在所述生物浸取工艺期间不会有大量氰化物释放至环境中。
4.与现有工艺相反，通过在温和操作条件下工作的天然存在的微生物进行生物浸取可以允许以与自然生物地球化学循环类似的过程进行金属再循环，并因此减小对资源(如矿石、能量或填埋空间)的需求(brandl,h.,lehmann,s.,faramarzi,m.a.和martinelli,d.(2008),hydrometallurgy 94,14-17)。生物浸取受到关注是因为它代表“清洁技术”。作为浸取剂，氰化氢由多种细菌(例如紫色色杆菌(chromobacterium violaceum)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)和铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))和真菌(例如硬柄小皮伞(marasmius oreades)、杯伞属(clitocybe)物种、多孢菌属(polysporus)物种)形成(pham,v.和ting,y.p.(2009),advanced materials research 71,661-664)。氰化物作为次生代谢物形成，并且在微生物的寿命中持续短持续时间。虽然在多年前就得知了微生物的氰化物产生，但是仍然缺少关于许多物种的氰化物产生的定量数据(liang,g.,mo,y.和zhou,q.(2010),enzyme and microbial technology 47,322-326)。然而，当前的生物回收和生物修复努力无法与浸取的成本效率的工业预期(有效的金属回收、短时间的生物浸取以及不依赖常规电解进行金属分离)相匹配(faramarzi,m.a.等人,(2004),journal of biotechnology 113,321-326；krebs,w.等人,(1997),fems microbiology reviews 20,605-617)，从而导致继续使用常规的湿法冶金和火法冶金方法进行金属修复。这种预期差异是由于微生物固有的次优浸滤剂代谢，并且缺乏在生物浸取后进行特定金属回收的合适的生物还原途径。
5.对开发由于再循环电子废物以保护我们的环境和保存自然资源的可持续技术存在迫切需要。本发明集中于从电子废物回收贵金属和去除有毒金属。使用强酸或氰化物的当前常规电子废物处理技术具有污染性。


技术实现要素：

6.本发明总体上涉及在金属氰化后对金属氰化物复合物进行生物还原的方法以及对氰化物进行生物水解的方法。
7.本发明允许将要容纳在合成宿主(如生氰的紫色色杆菌)内的整合的合成浸滤剂生物系统工程化，以用于电子废物的有效贵金属回收和有毒金属修复。在所述合成宿主的设计和工程化中可能存在多达四个主要组分/模块：1)合成生氰作用；2)合成金属回收；3)合成氰解；以及4)用于浸滤剂生物学的合成回路。本发明使得能构建用于浸滤剂生物学的合成回路。
8.在本发明中，发明人已经设计并构建了工具来从环境去除过量的氰化物，从而为工业提供可持续的金氰化工艺。另外，发明人已经设计并构建了用于紫色色杆菌的基因组编辑工具，用于构建合成紫色色杆菌以从电子废物回收贵重有毒金属。另外，发明人已经设计并构建了工具来将离子金(au
3
)和/或离子银(ag

)分别还原回呈金和银纳米颗粒的元素态(au)和(ag)，从而为工业提供涉及电解的常规回收步骤的替代方案。
9.根据第一方面，本发明提供一种分离的基因工程化细菌，其中所述细菌已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包含与至少一种启动子可操作地连接的异源汞(ii)还原酶(mera)基因，并且包含至少一个突变，所述突变使基因产物能够将离子金属还原为呈金属纳米颗粒的元素金属。
10.另一方面提供一种分离的基因工程化细菌，其中所述细菌已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包含与至少一种启动子可操作地连接的异源氰化氢合酶基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因。
11.在一些实施方案中，所述分离的基因工程化细菌还包含至少一种多核苷酸分子，所述至少一种多核苷酸分子从重组dna分子的n末端至c末端按顺序包含；
12.(i)与组成型启动子可操作地连接的gols转录激活基因，以及与p
golts
或p
golb
启动子可操作地连接的ph1f阻遏基因；
13.(ii)由cvir激活的启动子和phlf的操纵基因，以及
14.(iii)与所述cvir激活的启动子可操作地连接的所述异源氰化氢合酶基因和所述异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因中的一种或多种。
15.另一方面提供一种分别从离子金(au3 )回收呈金纳米颗粒的元素金或或者从离子银(ag )回收呈银纳米颗粒的元素银的工艺，所述工艺包括以下步骤：
16.a)使根据权利要求1至11中任一项所述的分离的基因工程化细菌with包含离子金(au3 )和/或离子银(ag )的浸取液接触；以及
17.b)从所述浸取液回收所述元素金纳米颗粒和/或元素银纳米颗粒。
18.根据另一优选实施方案，本发明提供一种产生分离的基因工程化细菌的方法，其中所述细菌已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包含与至少一种启动子可操作地连接的异源汞(ii)还原酶(mera)基因，并且包含一个或多个突变，所述一个或多个突变使基因产物能够将离子金(au
3
)还原为呈金纳米颗粒的元素金或者将离子银(ag

)还原为呈银纳米颗粒的元素银，所述方法包括以下步骤：
19.a)对编码汞(ii)还原酶(mera)的基因进行易错pcr；
20.i)用所述pcr的产物转化至少一种细菌；
21.ii)选择在包含au
3
和/或ag 的培养基上生长的转化体；或者
22.b)通过重叠延伸pcr对编码汞(ii)还原酶(mera)的基因进行多位点饱和诱变；
23.i)用所述pcr的产物转化至少一种细菌；
24.ii)选择在包含au
3
和/或ag

的培养基上生长的转化体。
25.应理解，可以在生长培养基上使用其他形式的金，如aucl。
26.另一方面提供一种分离的基因工程化细菌，其中所述细菌已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包含与至少一种启动子可操作地连接的异源腈水解酶基因，所述基因的产物引起氰化氢的氰解。
27.在一些实施方案中，所述至少一种多核苷酸分子还包含与至少一种启动子可操作地连接的异源甲酸脱氢酶基因、异源谷氨酸脱氢酶基因和异源磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因。
28.另一方面提供一种合成氰化物浸滤剂产生工艺，所述工艺包括：使至少一种重组生氰细菌与甘氨酸接触，其中所述至少一种细菌被工程化以表达与至少一种启动子连接的异源氰化氢合酶(hcnabc)基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体(sera)基因。例子显示于图2a中。
29.在一些实施方案中，所述重组生氰细菌还包含至少一种多核苷酸分子，所述至少一种多核苷酸分子从重组dna分子的n末端至c末端按顺序包含；
30.(i)与组成型启动子可操作地连接的gols转录激活基因，以及与p
golts
或p
golb
启动子可操作地连接的ph1f阻遏基因；
31.(ii)由cvir激活的启动子和phlf的操纵基因，以及
32.(iii)与所述cvir激活的启动子可操作地连接的所述异源氰化氢合酶基因和所述异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因中的一种或多种。
33.根据另一方面，本发明提供如本文所定义的能够进行合成氰化物浸滤剂产生的至少一种分离的重组细菌。
34.根据另一方面，本发明提供一种合成氰解的工艺，所述工艺包括：使至少一种重组氰解细菌与在电子废物的生物浸取后存在的包括氰化物在内的腈接触，其中所述至少一种细菌被工程化以表达至少一种腈水解酶。
35.在一些实施方案中，所述至少一种重组氰解细菌被进一步工程化以表达甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
36.根据另一方面，本发明提供一种分离的重组dna分子，其从所述重组dna分子的n末端至c末端按顺序包含；
37.(i)与组成型启动子可操作地连接的gols转录激活基因，以及与pgolts或pgolb启动子可操作地连接的ph1f阻遏基因；
38.(ii)由cvir激活的启动子和phlf的操纵基因，以及
39.(iii)与所述cvir激活的启动子可操作地连接的一种或多种生氰基因。
40.根据另一方面，本发明提供分别在hnh核酸内切酶结构域和ruvc核酸内切酶结构域中包含突变h840a和d10a的失活的cas9和sgrna用于通过靶向紫色色杆菌基因组中的一种或多种基因的启动子区域来抑制所述一种或多种基因的转录的用途。
41.在一些实施方案中，所述一种或多种基因编码紫色杆菌素紫色素形成。
42.另一方面提供一种包含goltsb操纵子的分离的重组dna分子，其中所述操纵子从所述重组dna分子的n末端至c末端按顺序包含：与j23119启动子可操作地连接的golt、gols、与golb启动子可操作地连接的golb和报告基因如gfp。该操纵子可以用于mera金还原工程化细菌的一般筛选。
附图说明
43.图1a-图1b：图1a；显示工程化生氰菌株(synlix 3.1)产生多达80mg/l的氰化物。将synlix 3.1工程化以表达氰化氢合酶(hcnabc)和3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变体(sera)。
44.图1b；氰解和偶联过程的概览。工程化生氰菌株(synlix 3.1)可耐受ph 10.0(嗜碱性)。
45.图2显示氰解和偶联过程的概览。选择来自不同细菌的腈水解酶的四种变体；合成它们的序列并随后克隆至其相应的宿主细胞中。来自类产碱假单胞菌(pseudomonas pseudoalcaligenes)(nit)和集胞藻属(synechocystis)物种pcc 6803染色体(sc-nit)的腈水解酶、来自短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)(bp-cynd)和施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)(ps-cynd)的氰化物二水合酶。nit含有2个不同亚基，即nitb和nitc，将它们克隆至prsf-duet载体中并在大肠杆菌(e.coli)(de3)bl21宿主细胞中表达。对于其余三种变体，将它们克隆至pgm载体中，并且随后经由tn7转座系统整合至紫色色杆
菌基因组中。
46.图3显示重组紫色色杆菌宿主细胞的示意图。偶联酶包括甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。将这些酶克隆于pbbb8k-rfp(广谱宿主范围)载体中，并且随后在紫色色杆菌中表达。通过将氰解过程与下游酶偶联，副产物碳和氮可以再循环，使其成为自维持系统。
47.图4显示转录阻遏的失活的cas9机制的示意性代表图。催化失活的cas9通过sgrna(蓝色)指导至启动子序列并且以物理方式抑制rnap起始转录。启动子区域中所靶向的20个核苷酸的前间隔序列(紫色)与cas9结合至dna所需的前间隔序列邻近基序(pam)序列ngg(红色)紧邻。
48.图5显示dcas9中对紫色色杆菌中的紫色杆菌素产生的阻遏。(a)dcas9回路的示意图。(b)紫色杆菌素操纵子的被靶向区域由三个dcas9-sgrna复合物来指示，所述被靶向区域为vioa启动子、viob启动子和vioc的5'区域。(c)靶向vioa启动子的grna需要最低量的dcas9诱导(0.01％阿拉伯糖)，靶向viob启动子的grna需要略高量的dcas9诱导(0.1％阿拉伯糖)，而靶向vioc(从转录起始位点进一步向下)的grna具有与非靶向grna阴性对照相同的作用。(d)(c)中相应孔的测量的od600。
49.图6显示金传感器回路优化。金离子剂量反应和回路示意图，其中(a)原始goltsb操纵子或最小金传感器，所述最小金传感器由gols转录激活因子和(b)p
golts
或(c)p
golb
组成。
50.图7显示金突变体传感器的回路示意图。
51.图8显示gols的结构。(a)gols的n末端和c末端结构域分别由螺旋-转角-螺旋(hth)dna结合结构域和金离子结合结构域组成。(b)使用phyre2预测的与dna结合的gols同二聚体的结构(kelley,mezulis,yates,wass和sternberg,2015)。在golsmt1、golsmt2和golsmt3中，dna结合结构域处的残基(向右箭头)发生突变。golsmt2在金离子结合结构域处具有另外的突变(顶部的残基，向上箭头)。golsmt3在dna结合结构域处具有另外的突变(向左箭头残基)。
52.图9显示golsmt1a38i的突变位点。在残基38处从丙氨酸至异亮氨酸(带圆圈的)的单一突变体。两个残基都是疏水的，异亮氨酸在疏水侧链中比丙氨酸多3个碳。这可以增加疏水性和疏水核心的聚集，并且允许与dna的更强结合。
53.图10显示golsmt2 a38q n97d的突变。在残基38处从丙氨酸至谷氨酰胺(在dna结合结构域处的圆圈)和在残基97处从天冬酰胺至天冬氨酸(在离子结合结构域处的圆圈)的双重突变体。对于第一突变，丙氨酸是非极性中性氨基酸，而谷氨酰胺是具有酰胺侧链的极性中性的，谷氨酰胺的较长极性侧链可以与dna具有更好的结合。对于第二突变，天冬酰胺是极性中性的，而天冬氨酸是极性酸性的，天冬氨酸的带负电荷的侧链可以与带正电荷的金离子具有更高的亲和力或者改进二聚作用。
54.图11显示golsmt3 a38k v60l的突变。在残基38处从丙氨酸至赖氨酸(外部圆圈)和在残基60处从缬氨酸至亮氨酸(内部圆圈)的双重突变体。对于第一突变，丙氨酸是非极性中性的，而赖氨酸是极性碱性的，赖氨酸可以允许与骨架磷酸基的更好的结合。对于第二突变，缬氨酸和亮氨酸二者都是非极性中性的，并且亮氨酸在其侧链中多一个碳原子，这可以增加dna结合结构域的总体疏水性。
55.图12显示在紫色色杆菌中对金传感器突变体的诱变和选择的实验工作流。通过深度扫描诱变来创建gols转录激活因子的突变体文库的模板，其中用19种其他氨基酸来替代每种氨基酸。随后克隆突变体文库并将其转化至紫色色杆菌中。选择对金离子具有更高荧光输出和灵敏度的突变体。
56.图13显示野生型和顶部四种金传感器突变体对金离子的反应。绘制反应曲线并拟合至希尔方程中：y＝(b
max
xn)/(kn xn) c。k：在半最大rfu的激活[au
3
]阈值，n：希尔系数，c：基线rfu，b
max
：最大rfu。
[0057]
图14显示合成回路的示意图，其提供一种方式将动态调节掺入新系统中。群体(quorum)分子允许自主开启回路，而金传感器在已经从电子废物浸取到金离子时通知回路关闭。
[0058]
图15显示响应于金离子的不存在和存在的可逆同步化开-关(on-off)回路的示意图。回路通过群体传感器开启(中间框)并通过金离子传感器关闭(左侧框)。所述可逆回路可以在不存在金离子的情况下通过阻遏物的稀释而再次开启。金离子传感器(左侧框)由gols转录激活因子组成，所述gols转录激活因子被金离子激活用于表达phlf阻遏物。群体传感器(中间框)利用宿主的内源cvir激活因子，所述内源cvir激活因子在高细胞密度下由ahl诱导。由rfp表示的生氰作用输出(右侧框)由此在高细胞密度下同步化，并且在金离子的存在下被抑制。
[0059]
图16显示用于响应于金离子的开-关输出的紫色色杆菌的分批培养的示意图。为了研究所述回路的开-关输出，在2ml eppendorf管中在300μl的补充有30μg/ml卡那霉素的tris基本培养基中将紫色色杆菌的小规模分批培养物在37℃下培养24小时。每次传代时进行固定相培养的1:600稀释，且在间隔传代时添加2μm aucl3。使用bd accuri c6流式细胞仪(bd biosciences，新加坡)测量终点单细胞荧光输出，其中流速为14μl/min且核心大小为10μm，每个样品收集10 000个事件。在561nm进行荧光激发并在610/620nm进行检测。用前向散射和侧向散射对细胞进行门控。从平均荧光值减去没有rfp的对照细胞的背景荧光。
[0060]
图17显示通过在存在或不存在金离子的情况下连续细胞传代，与野生型金传感器相比，使用突变体金传感器的回路的基础渗漏表达减小的图表。每次传代是前一次传代在不含au
3
以开启回路或含有2μm au
3
以关闭回路的基本培养基中的1:600稀释。
[0061]
图18显示表示在使用gols突变体(b-golsmt1、c-golsmt2、d-gols mt3)的三个开-关循环期间分离的开启群体和关闭群体的图表，而开-关群体在含有野生型金传感器的回路中融合(a)。
[0062]
图19显示构建生物传感器的示意图。沙门氏菌属(salmonella)gol操纵子由golt、gols和golb构成，它们分别编码p型atp酶、au传感器和金属结合分子伴侣。组成型大肠杆菌启动子j23119确保用于au
3
离子结合的au传感器的表达，然后所述au传感器结合au感测启动子golb并驱动gfp的表达。
[0063]
图20显示golgfp关于递增浓度的au
3
(μm)的生物灵敏度的图表。
[0064]
图21显示用于鉴定金还原突变体的筛选的示意图。
[0065]
图22显示mera蛋白中用于序列修饰以改变金属结合亲和力和/或特异性的靶位点。
[0066]
图23显示在(a)液体肉汤和(b)琼脂板中，au
3
对大肠杆菌rosetta(de3)plyss细胞
生长的作用。
[0067]
图24显示来自含有au
3
的琼脂板的表达野生型mera的大肠杆菌细胞和所有突变体的od
600
。
[0068]
图25显示由mera突变体合成的金纳米颗粒的tem图像。
[0069]
图26显示通过dm选择鉴定的突变体的au
3
还原动力学参数的比较。
●‑
dm突变体，-wt mera。对于(a)和(b)，在虚线上方的突变体显示k
cat
/km或k
cat
相对于wt mera的改进。(a)dm突变体的k
cat
/km值的比较，(b)dm突变体的kcat值的比较，(c)dm突变体的km值的比较。在虚线下方的突变体显示km相对于wt mera的改进。(d)-突变体和相关序列的表格。
[0070]
图27显示通过经由(a)wt mera(b)dm11还原aucl3回收的aunp的tem图像。
[0071]
图28显示来自aucl3和浸取液的au
3
经由(a)wt mera(b)dm11的体内还原。
[0072]
图29显示在通过dm11回收之前和之后以及在下游处理阶段时的au含量的比较。
[0073]
图30显示通过dm11从aucl3和电子废物浸取液回收的aunp的tem图像。(a)从aucl3回收的截角四面体aunp(b)从aucl3回收的截角双四面体aunp(c)从浸取液回收的截角四面体aunp。
[0074]
图31显示(a)在紫色色杆菌中的金和银生物传感器示意图，以及(b)针对基本培养基中的以下不同金属离子的突变体金传感器灵敏度的图表：aucl3(40μm)、agno3(10μm)、cdcl2(80μm)、zncl2(100μm)、hgcl2(5μm)、niso4(50μm)、cocl2(120μm)、feso4(25μm)和cuso4(35μm)。
[0075]
图32显示野生型和突变体生物传感器对基本培养基中的不同金属离子的剂量反应曲线。
[0076]
图33显示使用从电子废弃物金属浸取的金属在紫色色杆菌中进行金和银生物感测的方法的概要。
[0077]
图34显示野生型和突变体生物传感器在从电子废弃物金属(esm)浸取的金属离子混合物中感测贵金属离子的能力的图表。
[0078]
为了方便起见，将在本说明书中提及的文后参考书目以参考文献列表的形式列出并且附加在实施例的末尾处。此类文后参考书目的全部内容通过引用并入本文，但是在说明书中提及所述参考书目并非意指它们构成公知常识的一部分。
具体实施方式
[0079]
设想，在涉及生氰作用、浸取的金属离子的还原、氰解和氰化物的下游再循环的工艺中使用工程化细菌将需要使用具有单独突变体酶的细菌的单独菌株。一些菌株将选择性地还原金，而其他菌株将选择性地还原银。可能的工作流将包括：生成生物浸滤剂以氧化金属的菌株；然后菌株将使用金还原和银还原突变体选择性地还原金属，以回收金属；并且将使用菌株通过生物降解氰化物来对生物浸滤剂进行生物修复。
[0080]
在公开并描述本发明的化合物、组合物、物件、装置和/或方法之前，应理解，除非另外指定，否则它们并不限于具体合成方法或具体重组生物技术方法，或者除非另外指定，不限于特定试剂，因此当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
[0081]
定义
[0082]
为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。
[0083]
术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”在本文中用于指代一个/一种或多于一个/多于一种(即至少一个/至少一种)所述冠词的语法宾语。
[0084]
如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为指定所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由
……
组成”。词语“包含(comprising)”的变化形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”以及“包括(including)”的变化形式，例如“包括(include)”和“包括(includes)”具有相应变化的含义。
[0085]
在本文中范围可以表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解所述特定值形成另一个实施方案。应当进一步理解，每个范围的端点相对于其他端点都是重要的，并且独立于其他端点。还应理解，本文中公开了多个值，并且除了所述值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则也公开“约10”。还应理解，在公开一值时，也公开“小于或等于”所述值、“大于或等于所述值”以及值之间的可能范围，如技术人员适当地理解。例如，如果公开值“10”，则也公开“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式来提供，并且此数据代表数据点的任何组合的端点和起始点以及范围。例如，如果公开特定数据点“10”和特定数据点“15”，应理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15，以及10与15之间。还应理解，还公开两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开10和15，则也公开11、12、13和14。
[0086]
在本发明的第一方面中提供一种分离的基因工程化细菌，其中所述细菌已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包含与至少一种启动子可操作地连接的异源汞(ii)还原酶(mera)基因，并且包含一个或多个突变，所述一个或多个突变使基因产物能够将离子金属还原为呈金属纳米颗粒的元素金属。
[0087]
在一些实施方案中，mera基因包含编码氨基酸取代的一个或多个突变，其中所述氨基酸取代位于选自包含v317、y441和c464的组的位置。在其他实施方案中，mera基因突变位于选自包含以下的组的一个或多个位点：a323d、a323d(delδ324-365)、a414e、g415i、e416c、l417i、i418d和a422n。
[0088]
在一些实施方案中，所述离子金属是离子金(au
3
)，其被还原为呈金纳米颗粒的元素金，或者是离子银(ag

)，其被还原为呈银纳米颗粒的元素银。
[0089]
在一些实施方案中，在与包含未突变的mera基因的细菌相比时，所述分离的细菌具有对汞底物降低的还原能力。
[0090]
在一些实施方案中，一种分离的基因工程化细菌已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包含与至少一种启动子可操作地连接的异源氰化氢合酶基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因。在一些实施方案中，所述氰化氢合酶基因是hcnabc(seq id no:35)和/或所述3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因是sera(seq id no:36)。这些基因的存在增加氰化氢产生以从如电子废物的来源浸取贵金属。
[0091]
在一些实施方案中，氰化氢的产生在开/关开关的控制下，所述开关包含金离子传
感器和群体传感器(例如图15中所示)。更特定地，一旦浸取的金达到临界水平，所述金传感器关闭浸取过程。关闭回路响应于通过氰化产生的金离子，并且包含驱动gols基因的“低”组成型启动子和驱动下游阻遏基因的启动子。最小金传感器的例子包含在低组成型启动子(例如p
con6
；seq id no:37)控制下的gols转录激活基因，以及由p
golts
或p
golb
启动子驱动以产生ph1f阻遏物以阻断群体传感器中phlf的操纵基因的ph1f阻遏基因。群体传感器的开启回路响应于高细胞密度，并且包含由内源cvir(在高细胞密度下由ahl诱导)激活的启动子，以及在群体传感器启动子下游的phlf的操纵基因。在群体传感器下游且在其调节下的是一种或多种生氰作用基因，其选自如上所述的异源氰化氢合酶基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因。
[0092]
在一些实施方案中，分离的基因工程化细菌包含与开/关回路可操作地连接的异源氰化氢合酶基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因，其中关闭回路位于开启回路的上游，所述开启回路位于氰化氢合酶基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因的上游，其中所述关闭回路包含与启动子可操作地连接的异源gols基因，以及与选自p
golts
和p
golb
的启动子可操作地连接的下游异源ph1f阻遏基因，其中所述开启回路包含由内源cvir激活的启动子，以及在所述cvir激活的启动子之间的phlf的操纵基因，并且其中所述氰化氢合酶基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因与所述cvir激活的启动子可操作地连接。
[0093]
优选地，所述gols基因针对紫色色杆菌进行密码子优化，并且通过诱变优化动态范围和灵敏度(例如图12中所示)。在一些实施方案中，所述gols基因是选自以下的突变体：golsmt1_a38i、golsmt2_a38q&n97d、golsmt3_a38k&v60l和golsmt4_d33p。
[0094]
有用的金离子传感器包含goltsb操纵子，显示于图19中。
[0095]
另一方面提供一种包含goltsb操纵子的分离的重组dna分子，其中所述操纵子从所述重组dna分子的n末端至c末端按顺序包含：与j23119启动子可操作地连接的golt、gols、与golb启动子可操作地连接的golb和报告基因如gfp。该操纵子可以用于mera金还原工程化细菌的一般筛选。
[0096]
腈水解酶是一组将腈水解为氨和相应羧酸的酶。此类氰化物降解酶存在两种类型。
[0097][0098]
第一，氰化物二水合酶，包含一组细菌酶。这些酶的表现如同真正的腈水解酶，将氰化物直接转化为甲酸和氨(上图)。另一方面，具有真菌来源的氰化物水合酶将氰化物水解为甲酰胺(下图)。这些水解酶不需要另外的辅因子或底物，并且对宽底物浓度催化，使得它们成为用于氰化物的生物修复的良好候选者。
gatatacatatgcaccaccatcaccatcat-3'(seq id no:2)。
[0117]
在一些实施方案中，在部分b)中，所述pcr是用在mera蛋白的靶位点v317、y441和c464含有nnk和/或mnn的引物来进行。
[0118]
在一些实施方案中，所述选择涉及至少2种形式的选择，其中一种形式包括在包含au
3
和/或ag

的琼脂板上进行选择，并且另一种形式包括在包含au
3
和/或ag

的液体培养中进行选择。
[0119]
本发明的第四方面提供一种合成氰化物浸滤剂产生工艺，所述工艺包括：
[0120]
使重组生氰细菌与甘氨酸接触，
[0121]
其中所述细菌包含与至少一种启动子可操作地连接的异源氰化氢合酶基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因。
[0122]
在一些实施方案中，所述氰化氢合酶基因是hcnabc和/或所述3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因是sera。例子显示于图1a中，其中称为synlix 3.1的突变体在lb中生长，并且在48小时中监测氰化物产生。使用氰化物敏感的离子选择电极(ise)检测氰化物产生。
[0123]
在一些实施方案中，所述hcnabc和sera基因在诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，分离的基因工程化细菌包含与开/关回路可操作地连接的异源氰化氢合酶基因和异源3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因，其中关闭回路位于开启回路的上游，所述开启回路位于氰化氢合酶基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因的上游，其中所述关闭回路包含与启动子可操作地连接的异源gols基因，以及与选自p
golts
和p
golb
的启动子可操作地连接的下游异源ph1f阻遏基因，其中所述开启回路包含由内源cvir激活的启动子，以及在所述cvir激活的启动子之间的phlf的操纵基因，并且其中所述氰化氢合酶基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因与所述cvir激活的启动子可操作地连接。
[0124]
在一些实施方案中，所述重组生氰细菌可耐受至少约10的ph。
[0125]
在一些实施方案中，所述合成氰化物浸滤剂产生与金属一起在单一反应器中进行用于生物浸取。
[0126]
本发明的另一方面提供如本发明任一方面所定义的能够进行合成氰化物浸滤剂产生的至少一种分离的重组细菌。
[0127]
在一些实施方案中，所述重组生氰细菌选自包含紫色色杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的组。
[0128]
本发明的另一方面提供一种合成氰解的工艺，所述工艺包括：
[0129]
a)使至少一种重组氰解细菌与在电子废物的生物浸取后存在的包括氰化物在内的腈接触，
[0130]
其中所述至少一种细菌被工程化以表达至少一种腈水解酶。
[0131]
在一些实施方案中，所述至少一种腈水解酶选自包含氰化物脱水酶和氰化物水合酶的组。
[0132]
在一些实施方案中，所述至少一种重组氰解细菌被进一步工程化以表达甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
[0133]
在一些实施方案中，至少一种腈水解酶源自选自包含类产碱假单胞菌(nit)、集胞藻属物种pcc 6803染色体(sc-nit)的组的至少一个细菌物种，氰化物二水合酶源自短小芽孢杆菌(bp-cynd)和施氏假单胞菌(ps-cynd)。
[0134]
本发明的另一方面提供一种分离的重组dna分子，其从所述重组dna分子的n末端至c末端按顺序包含；
[0135]
(i)与组成型启动子可操作地连接的gols转录激活基因，以及与pgolts或pgolb启动子可操作地连接的ph1f阻遏基因；
[0136]
(ii)由cvir激活的启动子和phlf的操纵基因，以及
[0137]
(iii)与所述cvir激活的启动子可操作地连接的一种或多种生氰基因。
[0138]
在一些实施方案中，所述gols转录激活基因在低组成型启动子(如p
con6
)的控制下。
[0139]
在一些实施方案中，所述gols基因针对紫色色杆菌进行密码子优化，并且通过诱变优化动态范围和灵敏度(例如图12中所示)。在一些实施方案中，所述gols基因是选自包含以下或由以下组成的组的突变体：golsmt1_a38i、golsmt2_a38q&n97d、golsmt3_a38k&v60l和golsmt4_d33p。
[0140]
本发明的另一方面提供分别在hnh核酸内切酶结构域和ruvc核酸内切酶结构域中包含突变h840a和d10a的失活的cas9和sgrna用于通过靶向紫色色杆菌基因组中的一种或多种基因的启动子区域来抑制所述一种或多种基因的转录的用途。
[0141]
在一些实施方案中，编码失活的cas9的基因与p
arabad
启动子可操作地连接，并且编码rna指导物(sgrna)的基因与强组成型启动子(如j23119)可操作地连接。
[0142]
在一些实施方案中，所述失活的cas9靶向紫色杆菌素操纵子以防止紫色杆菌素紫色素形成，因为所述色素可能使下游处理步骤变复杂。在一些实施方案中，所述失活的cas9靶向vioa、viob和/或vioc启动子，优选地所有三种启动子。现在已经大体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，所述实施例是通过说明的方式而提供的，并不旨在限制本发明。
[0143]
实施例
[0144]
大体上遵循本领域已知的并且未具体描述的标准分子生物学技术，如green和sambrook,molecular cloning:a laboratory manual,cold springs harbor laboratory,纽约(2012)中所述。
[0145]
实施例1
[0146]
将腈水解酶整合至宿主细胞中用于氰解
[0147]
选择来自不同细菌的腈水解酶的四种变体；合成它们的序列并随后克隆至其相应的宿主细胞中。来自类产碱假单胞菌(nit)(seq id no:11)和集胞藻属物种pcc 6803染色体(sc-nit)(seq id no:12)的腈水解酶、来自短小芽孢杆菌(bp-cynd)(seq id no:13)和施氏假单胞菌ps-cynd)(seq id no:14)的氰化物二水合酶。nit含有2个不同亚基，即nitb(seq id no:15)和nitc(seq id no:16)，将它们克隆至prsf-duet载体中并在大肠杆菌(de3)bl21宿主细胞中表达。对于其余三种变体，将它们克隆至pgem载体中，并且随后经由tn7转座系统整合至紫色色杆菌基因组中(图2和图3)。
[0148]
偶联酶包括甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。将这些酶克隆于pbbb8k-rfp(广谱宿主范围)载体中，并且随后在紫色色杆菌中表达。通过将氰解过程与下游酶偶联，副产物碳和氮可以再循环，使其成为自维持系统(图3)。
[0149]
测试紫色色杆菌的氰解菌株从细胞外环境去除氰化物的能力。在100mg/l氰化钾
的存在下，工程化的氰解紫色色杆菌菌株能够在24小时内完全去除外源氰化物。
[0150]
实施例2
[0151]
使用紫色色杆菌中的dcas9的基因组转录控制工具的开发。
[0152]
crispr-cas9作为许多生物体中的基因组编辑工具被广泛采用。其主要用于真核生物中，包括哺乳动物、昆虫和酵母细胞。crispr-cas系统源自细菌的适应性免疫系统，其中它将侵入的噬菌体dna的小片段插入其宿主基因组中作为记忆，以用于监督未来可能的由相同dna片段组成的噬菌体侵入。来自酿脓链球菌(streptomyces pyogenes)的crispr-cas9系统由cas9核酸内切酶组成，所述cas9核酸内切酶与rna指导物一起结合至与所述rna指导物同源的dna序列，并且使cas9核酸内切酶切割侵入噬菌体的双链dna。在用作基因组编辑工具时，cas9核酸内切酶与rna指导物一起表达，所述rna指导物由与靶dna互补的20个核苷酸的间隔子和之后的接触所述cas9核酸内切酶的76bp支架组成。在被通过所述rna指导物的20bp间隔子指导至靶dna后，cas9核酸内切酶引起宿主染色体中的双链断裂。宿主针对被切割染色体激活dna修复机制，从而导致所引入dna片段在dna靶位点中的插入、缺失或同源重组。由于rna指导的机制的容易性和模块性，crispr-cas9基因组编辑方法快速地在许多生物体中被采用。
[0153]
已经使得crispr-cas适应于许多其他应用中。由于rna对dna序列识别的容易性和特异性，cas9的许多应用和变化形式已经应用于靶向特定基因组基因座。靶向基因转录的crispri(crispr-干扰)和crispra(crispr-激活)是对crispr/cas遗传工具的两个增加。crispri(图4)是由失活的cas9(dcas)(seq id no:17)介导，所述失活的cas9在hnh核酸内切酶结构域和ruvc核酸内切酶结构域中分别具有突变h840a和d10a，其经由与启动子区域结合的rna聚合酶的位阻来抑制基因转录。crispra是经由dcas与激活因子之间的融合蛋白来实现，所述激活因子募集rna聚合酶，从而增强基因转录。尽管已经显示crispra将靶基因的表达增加3倍[bikard,d.等人,nucleic acids res,41(15),7429-7437(2013)]，但crispri已经更广泛地应用于属于埃希菌属(escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)、分枝杆菌属(mycobacterium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、梭菌属(clostridium)和芽孢杆菌属(bacillus)的属中，从而将基因表达抑制高达300倍[cho,s.等人,int j mol sci,19(4).doi:10.3390/ijms19041089(2018)；qi等人,2013]。将在紫色色杆菌中探索crispri工具，其用于染色体基因表达的转录抑制。
[0154]
crispr/cas基因组编辑工具已经是用于真核细胞的有力工具，然而，因为双链dna切割在原核生物中的致死性，crispr/cas的使用在原核生物中更受限。原核生物中的dna修复机制不足以拯救细胞，从而在采用crispr/cas时导致细菌死亡。
[0155]
然而，使用在催化结构域中具有d10a突变和h840a突变的失活的cas9(dcas9)已经适应于阻断靶基因的转录(图5)。在此项研究中，使用dcas9靶向紫色杆菌素操纵子的启动子区域，从而防止形成紫色杆菌素紫色素(图5b)。所述阻遏在靶向第一基因(vioa)启动子(seq id no:18)时最有效，仅需要0.01％的阿拉伯糖。此后是viob启动子(seq id no:19)，其需要更高量的0.1％阿拉伯糖诱导dcas9表达以用于紫色杆菌素阻遏。在操纵子更下游对vioc(seq id no:20)的抑制对紫色杆菌素转录阻遏几乎没有影响。od的略微下降应该不是由于dcas表达的代谢负荷所致。主要原因之一可能是由于紫色杆菌素的吸收光谱重叠所致，其最大吸光度在od
570
处[swem,l.r.等人,mol cell,35(2),143-153(2009)]。光学密度
略微下降的另一个原因可能是由于在没有完全阻遏紫色杆菌素色素时细胞发生丛聚所致(图5c)。
[0156]
迄今尚未报道过紫色色杆菌的染色体转录控制。内源基因的控制将可用于代谢工程化，尤其用于代谢通量的控制中，从而快速有效地敲低基因表达。因为多路复用简单直接，可以有效且快速地一次性敲低多种基因[cobb,r.e.等人,acs synth biol,4(6),723-728(2014)；cress等人,2015]。另外，dcas9可以与其他蛋白质(包括用于单一核苷酸突变的胞苷脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶)融合[arazoe,t.等人,biotechnology journal,13(9):e1700596(2018)；komor,kim,packer,zuris和liu,2016]，从而为扩增紫色色杆菌遗传工具箱提供极好的机会。
[0157]
用于紫色色杆菌的dcas的克隆和表达
[0158]
在cas9中经由突变引物和gibson组装引入两个催化突变d10a和h840a。随后在p
arabad
(seq id no:21)的控制下克隆dcas。使用强组成型启动子j23119(seq id no:22)驱动靶向vioa启动子、viob启动子、vioc的5'端和两个非靶向序列的sgrna的表达(图5a)。将紫色色杆菌的过夜培养物以1:100稀释至96深孔块(nunc，丹麦)中，并且通过添加0.01％阿拉伯糖、0.1％阿拉伯糖或1％阿拉伯糖诱导dcas，或者不诱导作为对照。使培养物在37℃、280rpm下生长过夜，之后将培养物转移至96深孔板中以用于紫色杆菌素产生的可视化和od600测量。
[0159]
实施例3
[0160]
在紫色色杆菌中从天然金操纵子构建金传感器
[0161]
用于金生物浸取回路的重要的传感器是金传感器。所浸取的金的量将能够向回路提供动态反馈，并且每当金离子浓度达到临界水平时停止浸取工艺。到目前为止唯一显示的金生物传感器是来自肠道沙门氏菌(salmonella enterica)鼠伤寒(typhimurium)血清型lt2菌株的goltsb操纵子(seq id no:23)。其含有gols(seq id no:24)，显示gols是唯一的merr家族转录调节因子，被报道能够区分金离子与铜和银离子[cerminati,s.等人,biotechnol bioeng,108(11),2553-2560(2011)]。尽管先前仅在大肠杆菌和肠道沙门氏菌中显示此金生物传感器，但是在此报告中首次将其在紫色色杆菌中进行优化，以实现大动态范围。
[0162]
首先在荧光蛋白输出的上游克隆整个goltsb操纵子，以用于表征所述金传感器。然而，所述荧光输出在0.001μm至10μm的au
3
浓度下具有低输出动态范围(图6a)。此低动态范围是由于在不存在au
3
的情况下14842rfu的高渗漏表达所致(图6a)。另外，在自1μm向上的高au
3
浓度下，细胞密度显著下降。对细胞的毒性可能是由于golt的过表达所致，golt是一种跨膜外排p型atp酶，其如果过表达可能破坏细胞膜的完整性。金传感器在紫色色杆菌中的此低动态范围和细胞毒性导致随后在goltsb操纵子中进行优化。
[0163]
为了降低由于gols所致的渗漏激活，将p
golts
用弱组成型启动子替代来驱动gols表达，从而降低启动子强度并消除正反馈环(图6b)。另外，去除golt和golb以构建最小金传感器并将对细胞生长的可能的有害影响降至最低。随后用驱动输出荧光蛋白的p
golts
(seq id no:25)或p
golb
(seq id no:26)测试构建体(图6b和图6c)。在0与10μm au
3
之间，最大动态范围对于pgolts是151倍变化(min 110rfu max 16416rfu)，且对于pgolb是113倍变化(min 50rfu max 1648rfu)。
[0164]
在0与1μm au
3
之间，还存在pgolts与pgolb相比更高的变化倍数，其中没有观察到对紫色色杆菌的毒性。从0至1μm au
3
，对于pgolb存在基因表达的动态范围的38倍变化(min 50max 1887rfu)(图6b)，并且对于pgolts存在基因表达的动态范围的62倍变化(min 110max 6737rfu)(图6c)。随后选择pgolts构建体作为金传感器，因为其动态范围更高。
[0165]
通过诱变改进金传感器在紫色色杆菌中的动态范围和灵敏度
[0166]
在优化金传感器的回路和调节机构之后，接下来对gols转录激活因子进行深度扫描诱变，以进一步增加金传感器的灵敏度和动态范围。尽管尚未解析出gols蛋白的结构，但gols属于具有螺旋-转角-螺旋dna结合结构域和金离子结合结构域的merr蛋白家族(图8a)[checa,s.k.等人,mol microbiol,63(5),1307-1318(2007)]。使用由低组成型表达的gols和驱动rfp的p
golts
组成的优化回路(图7)，筛选并选择与gols野生型相比具有宽动态范围和高灵敏度的gols突变体(图12)。选择并表征四种突变体；golsmt1(a38i)；golsmt2(a38q和n97d)；golsmt3(a38k和v60l)；以及golsmt4(d33p)。野生型gols以及突变体golsmt1、golsmt2和golsmt3的结构分别显示于图8至图11中。
[0167]
与迄今为止报道的野生型金传感器相比，所述金传感器突变体具有增加的灵敏度和动态范围(表1)。b
max
值以野生型b
max
值的3.5倍的最大变化倍数增加。包括k、n和c在内的其他参数变化不超过2倍，表明其他特征保持相对类似。
[0168]
表1：来自金传感器突变体的拟合反应曲线的参数值。
[0169] k(μm)nb
max
cr2seq idgols-mt12.25
±
0.191.07
±
0.0745088
±
167251
±
2250.99827gols-mt21.36
±
0.151.12
±
0.1036074
±
161154
±
3700.99628gols-mt31.48
±
0.141.23
±
0.1141388
±
164697
±
3920.99629gols-mt44.05
±
0.871.15
±
0.1343451
±
435678
±
2340.99830gols-wt5.51
±
3.331.15
±
0.2912811
±
382547
±
1110.99424
[0170]
灵敏度是传感器的关键参数，决定其在系统中的功能性。所获得的结果表明，金传感器突变体对金离子的灵敏度是野生型金传感器的至少两倍。对于金传感器突变体，在8nm金离子下存在至少三倍诱导的可检测变化倍数，而对于野生型金传感器不存在可检测的变化倍数(表2)。
[0171]
表2：对于野生型和顶部三种金传感器突变体，随着au
3
的浓度递增，在开启与关闭状态之间输出的变化倍数。
[0172][0173]
对于在大肠杆菌生物传感器中检测，该值比所报告的33nm金离子更灵敏，以2.3倍诱导作为阈值[cerminati,s.等人,biotechnol bioeng,108(11),2553-2560(2011)]。金传
感器突变体在仅80nm au
3
下实现超过10倍的输出变化，而野生型金传感器在该金离子浓度下仅具有3倍诱导，对金离子的灵敏度为4.5rfu nm-1
。在野生型和突变体金传感器二者中还存在关闭状态的低渗漏表达。关闭状态较低，其中所有输出都低于100rfu。(golsmt1-51rfu，golsmt2-54rfu，golsmt3-97rfu，wt-47rfu)。在达到金离子的毒性水平之前，金传感器突变体还能够产生比野生型金传感器更高的最大输出，其具有超过100倍的变化(golsmt1-45 088rfu，golsmt2-36 074rfu，golsmt3-41 388rfu，wt-12 811rfu)。
[0174]
所有突变体都在螺旋-转角-螺旋dna结合结构域中发生突变(向左和向右箭头，图8b)，表明转录激活因子的增加的输出可能是由于与启动子区域更好的结合以及随后对启动子区域的激活所致，从而导致金传感器突变体的更高的最大输出(图13)。激活因子突变体还具有对金离子结合增加的亲和力，这由金反应函数向左位移来支持(图13)。同时，未发现渗漏基础表达，表明所述突变没有增加非诱导激活因子的激活。总之，金感测转录激活因子突变体的增加的转录输出、增加的对金离子的亲和力以及紧密表达可以用作未来金离子感测应用的有用工具。
[0175]
金传感器的诱变
[0176]
通过quikscan-19创建gols突变体文库并使用quikchange-ht试剂盒(agilent technologies，圣克拉拉)来建立。将每个氨基酸用19种其他氨基酸反复替代，从而对于用于quikchange反应中的gols中的每个氨基酸要得到19种诱变定制寡聚物。对于154个aa的gols，除了第一个氨基酸甲硫氨酸外，总计会生成153x 19＝2907种可能的单氨基酸突变体。根据制造商的方案在蛋白质中生成总计6个文库，每个文库跨越大约25个氨基酸突变区域。随后将每个文库转化为感受态紫色色杆菌并铺板于含有30μg/ml卡那霉素和2μm aucl3的tris基本培养基1.5％细菌学琼脂上。通过在蓝光下观察针对与野生型gols相比更高的rfp输出来选择菌落，并将其接种至96孔板中以供生长，并且随后用biotek synergy h1微量板读取器进行荧光定量。
[0177]
用于群体和金传感器表征的荧光测量
[0178]
对于金传感器表征，使细胞从lb培养基中的冷冻原液在96深孔块(nunc，丹麦)中在37℃下生长过夜。将细胞以1:200稀释于含有0.001μm至10μm氯化金(iii)(sigma aldrich)的96孔板(costar，肯纳邦克)中的tris基本培养基(ph 7.5)中，所述培养基含有80mm nacl、50mm tris、22mm葡萄糖、20mm kcl、20mm nh4cl、3mm na2so4、1mm盐酸硫胺素、0.5g/l酵母提取物、1mm mgcl2、0.65mm na2hpo4和0.1mm cacl2。
[0179]
随后使稀释的细胞在biotek synergy h1微量板读取器中在37℃下生长过夜。每10分钟以在530nm下激发、在600nm下发射(增益50)测量红色荧光，持续14-20小时。通过在600nm下的吸光度测量光学密度。以不含细胞的仅培养基的od
600
和荧光值作为空白。
[0180]
实施例4
[0181]
经由合成回路并入动态调节和生物传感器用于稳健的微生物细胞工厂
[0182]
在金生物浸取微生物细胞工厂中，两种主要成分是目的元素金和氰化物，所述氰化物是将固体金氧化为水性金离子所需的浸取剂。这可能对活微生物细胞工厂造成挑战，因为金离子和氰化物二者都对微生物有高毒性。金离子毒性源自诱导氧化应激的au(i)-s复合物的积累[reith,f.等人,proc natl acad sci u s a,106(42),17757-17762(2009)]，同时氰化物通过与细胞色素氧化酶中的金属结合而抑制呼吸过程[knowles,
c.j.bacteriol rev,40(3),652-680(1976)；knowles,c.j.和bunch,a.w.adv microb physiol,27,73-111(1986)]。显示金离子在低至0.35μm的浓度下对细菌有毒[shareena dasari,t.p.等人,biochem pharmacol(los angel),4(6),199(2015)]，同时氰化物对细菌的毒性低至0.4μm[liu,w.等人,chinese journal of chemistry,25(2),203-207(2007)]。尽管在紫色色杆菌中存在许多氰化物脱毒机制[brysk,m.m.等人,j bacteriol,97(1),322-327(1969)；brysk,m.m.和ressler,journal of biological chemistry,245(5),1156-1160(1970)；ressler,c.等人,biochemistry,12(26),5369-5377(1973)]以保护其自身免受其自有的氰化物产生伤害，但是在金生物浸取工艺期间，金离子毒性将是对无经验的紫色色杆菌的新的紧迫挑战。因此，构建动态开-关回路，以仅在高细胞密度下开启氰化物产生，并在感测到毒性金离子时关闭回路(图14)。
[0183]
将内源群体感测系统添加至所述回路中将确保，仅在细胞密度足够高时激活输出(图15)。因为启动合成回路的负反馈环的金传感器是激活因子，必须在下游引入阻遏物以介导阻遏。在金传感器的下游添加已表征的tetr家族的强阻遏物，其介导phlf(seq id no:31)的基因表达高达193倍的变化[stanton,b.c.等人,nat chem biol,10(2),99-105(2014)]，用于输出的转录阻遏。在群体感测启动子的下游添加phlf(seq id no:32)的操纵基因，用于对转录过程中的rnap的物理抑制(图15)。通过金传感器提供的负反馈环将对生物浸取工艺提供实时反馈，并且在生氰作用过程已经通过氰化产生高浓度的金离子时抑制所述工艺。一旦表达阻遏物，所述阻遏物随后将结合至生氰作用基因的启动子区域。这意味着，在检测到高浓度的金离子时，将不会发生生物浸取酶的进一步表达。
[0184]
在连续分批培养中测试回路，其中从前一次传代以1:600稀释。使培养物在2μm au
3
的存在下生长以关闭回路，或者在不存在金离子的情况下生长以开启回路(图16)。在我们的研究中，使用2μm金离子诱导关闭状态，因为其已经在10μm下观察到金离子毒性之前导致最高阻遏。然而，关闭回路意味着应存在低渗漏表达或者完全不存在渗漏表达。含有野生型金传感器的回路在关闭状态下的基础表达水平随着循环而增加。关闭输出从第一循环中的245rfu分别增加至第二和第三循环的765rfu和1047rfu(图17)。这与具有金传感器突变体的回路相反，所述回路的关闭状态输出在所有三个循环中始终维持低于250rfu(图17)。
[0185]
gols突变体的降低的基础表达通过连续细胞培养导致增加的表达动态范围。wt金传感器的动态范围从第一循环中的15倍分别下降至第二和第三循环中的仅5倍和4倍动态范围，而含有gols突变体的回路在所有三个循环中维持动态范围高于10倍(图17)。在含有gols突变体的回路中的高动态范围的这种维持将给予金浸取微生物细胞因子经历多个开-关循环的稳健性和增加的功能性。
[0186]
gols突变体回路增加的稳健性进一步由在连续循环期间维持的分离的开-关群体支持，如从代表性流式细胞仪直方图可见(图18)，其中(a)是wt；(b)golsmt1；(c)golsmt2；以及(d)gols mt3。在wt金传感器中观察到的关闭细胞群体的铺展(图18a)表明，细胞群体表达的增加的异质性是回路的动态范围降低的主要原因。含有金传感器突变体的回路的更强关闭状态维持可以归因于所述金传感器对金离子增加的灵敏度以及增加的动态范围。即使随着细胞传代增加，在2μm au
3
的相同诱导下phlf阻遏物的更高表达可以导致更好地阻遏群体感测启动子。
[0187]
另一观察是，两种gols突变体(图18c的golsmt2和图18d的golsmt3)具有增加的群
体在三个循环期间保持在关闭状态中，从而导致动态范围略微降低。这可能是由于phlf阻遏物在循环中的稀释不足所致，其导致小细胞群体保持在关闭状态中。尽管gols突变体允许增加的phlf阻遏物表达以更好地维持关闭状态输出，但其可能过强而使得phlf阻遏物的细胞稀释不足以将回路转换回开启状态。这表明，golsmt2和golsmt3可能不如金传感器适合于在金生物浸取合成回路中进行稳健的连续开-关循环。
[0188]
金传感器突变体增加回路在三个开-关循环(由六次细胞传代组成)中的稳健性(图16至图18)。这对金生物浸取微生物细胞工厂的开发作出了显著贡献，因为金离子对细胞的毒性将意味着需要许多个金浸取循环。
[0189]
实施例5
[0190]
汞(ii)还原酶针对金还原的定向进化
[0191]
au(iii)的最小抑制浓度的确定
[0192]
已知au(iii)对许多细菌细胞是有毒的，这是由于其对硫醇基(-sh)具有高亲和力，并且因此可能影响许多在代谢上重要的酶和膜结合蛋白。表达具有改进的金还原活性的mera突变体酶的大肠杆菌细胞可以潜在地展现对在培养基中补充的毒性水平的au(iii)的更高抗性。
[0193]
对于肉汤方法，将连接混合物转化至大肠杆菌rosetta(de3)plyss感受态细胞中，将所述细胞铺板于正常lb琼脂板上。对于肉汤培养基，将5ml补充有相同抗生素和不同浓度的aucl3的tris缓冲的低磷酸盐培养基用单一菌落在37℃下接种24h。然后测量od
600
以比较细胞生长。将完全阻止生长的重金属的最低浓度定义为mic。在图23a中显示，在大于140μm的au
3
浓度下，细胞无法生长。
[0194]
对于板方法，将表达野生型mera的大肠杆菌细胞培养、稀释并铺板于补充有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素、0.1mm iptg和不同浓度的aucl3的tris缓冲的低磷酸盐琼脂培养基(tris 6.06g/l、nacl 4.68g/l、kcl 1.49g/l、nh4cl 1.07g/l、na2so
4 0.43g/l、mgcl2.6h2o 0.2g/l、cacl2.2h2o 0.03g/l、na2hpo4.12h2o 0.23g/l、葡萄糖5.0g/l、酵母提取物0.5g/l和琼脂15g/l)上，并在37℃下生长24h。结果显示，随着au
3
浓度增加，在板上观察到更少的菌落。在au
3
浓度达到160μm时，细胞生长完全被抑制(图23b)。
[0195]
金的毒性可能是由于其对存在于许多代谢上重要的酶和膜结合蛋白中的硫醇基(-sh)的高亲和力所致。在与金离子结合时，这些蛋白质不再是其天然生物相关金属离子可及的。与板方法相比，肉汤方法展现的最小抑制浓度略微更低。此差异可能源于au
3
离子在板与液体肉汤之间的不同分布模式。
[0196]
定向进化文库构建
[0197]
使用限制性内切酶ndei和xhoi将编码汞(ii)还原酶(mera)的合成的密码子优化的基因与n末端6x his标签同框克隆至表达载体pet20b(novagen)中。为了进化出具有改进的金还原活性的mera，使用易错pcr和位点饱和诱变构建突变体文库。
[0198]
用genemorph ii随机诱变试剂盒(agilent technologies)根据制造商的方案对mera基因(seq id no:33；seq id no:34)进行mera基因的易错pcr，在所述pcr反应中用50-100ng靶dna实现中等突变频率(4.5-9个突变/kb)，并通过对几个随机挑选的菌落进行测序加以确认。使用以下引物：eppcr-fw：5'-gtggtggtggtggtgctcgagtta-3'(seq id no:1)和eppcr-rv：5'-gatatacatatgcaccaccatcaccatcat-3'(seq id no:2)。热循环程序由以下组
成：首先在95℃下变性2min，进行在95℃下变性30s、在55℃下复性30s并在72℃下延伸1.5min的30个循环，在最后一个循环后在72℃下延伸10min。然后用dpni处理pcr产物用于模板降解，并使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)进行纯化。将纯化的dna片段用ndei和xhoi进行双重消化，并且纯化并连接至pet20b载体。
[0199]
通过重叠延伸pcr使用在靶位点v317、y441、c464和c465'的含有nnk的简并引物进行多位点饱和诱变。这些位置与mera的活性位点内潜在的金结合位点紧密接触(图22)。氧化还原活性半胱氨酸c136和c141保持不变，以防止可能的氧化还原活性丧失。所用引物列于表3中。
[0200]
表3：用于位点饱和诱变的引物的序列
[0201][0202]a简并性字母表：n＝(a、t、c、g)；k＝(t、g)；m＝(a、c)
[0203]
用以下引物对进行pcr反应：t7-fw/v317nnk-rv、v317nnk-fw/y441nnk-rv、y441nnk-fw/c464nnk-rv和c464nnk-fw/t7-rv，以生成部分重叠的dna片段。将总体积50μl的含有50ng的pet20bmera质粒、500nm的每种引物和1x primestar max预混合物(clontech)的反应混合物孵育98℃持续10s、55℃持续5s和72℃持续10s的30个循环。纯化pcr产物并且将等摩尔量的每个片段在1x primestar max预混合物中混合用于短重叠延伸反应(98℃持续10s、55℃持续5s、72℃持续10s的5个循环)，并且使用1μl反应混合物作为模板使用引物eppcr-fw和eppcr-rv来扩增全长mera突变基因。将pcr产物纯化、用ndei和xhoi消化，并且连接至pet20b载体中。
[0204]
对金耐受性突变体的选择
[0205]
使用来自易错pcr或位点饱和诱变的连接混合物来转化大肠杆菌rosetta(de3)plyss感受态细胞，并将转化体铺板于补充有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素、0.1mm iptg和250μm aucl3的tris缓冲的低磷酸盐琼脂培养基(tris 6.06g/l、nacl 4.68g/l、kcl 1.49g/l、nh4cl 1.07g/l、na2so
4 0.43g/l、mgcl2.6h2o 0.2g/l、cacl2.2h2o 0.03g/l、na2hpo4.12h2o 0.23g/l、葡萄糖5.0g/l、酵母提取物0.5g/l和琼脂15g/l)上，并且在37℃下生长24h。然后挑选菌落并在补充有100μg/ml氨苄青霉素、34μg/ml氯霉素、0.1mm iptg和300μm aucl3的tris缓冲的低磷酸盐液体培养基中生长。在几轮选择后，获得在毒性水平的au
3
(300μm)下显示显著更好的细胞生长的10种突变体，在所述毒性水平的au
3
下，表达野生型mera的细胞可能几乎不生长(图24)。值得提及的是，在两次选择后存活的所有菌落都来自位点饱和文库，表明这种半理性设计的文库而不是通过随机诱变生成的文库可能有更高机会含有功能上改进的变体。与野生型相比改进的耐受性可能来自两个来源：1)通过酶
促减少au
3
离子的mera脱毒，以及2)通过与au
3
结合的mera隔离au
3
。
[0206]
产生从aucl3合成金纳米颗粒的mera突变体，如tem图像中所示(图25)。通过我们的定向进化方法，已经鉴定增强的金还原酶，即mera突变体v317s。这种突变体具有表5中列出的动力学参数。增强的金还原酶在将au
3
还原为元素金(au0)方面的催化效率具有67倍的增加。
[0207]
表5：增强的金还原酶的动力学参数
[0208][0209]
进一步改进的突变体
[0210]
先前已经用9.1
±
3.2
×
101m-1
s-1
的催化效率确立了mera的金还原能力。使用定向进化与理性设计方法的组合来生成改进的au
3
还原mera突变体的文库。超过50％的分离的突变体显示改进的活性，其中改进最高的突变体展示催化效率高达15倍的改进(图26)。由于更新率(k
cat
)和结合亲和力(km)二者的改进，突变体dm11(g415i)(seq id no:48)展示催化效率的最大改进(15倍增加)。所有突变体的动力学参数可以参见表6。
[0211]
这种催化效率的改进也反映在进行还原后形成的金纳米颗粒(aunp)的复杂度方面。如与mera相比，dm11产生尺寸更大且复杂度更高的aunp(图27)。这种催化效率的改进也反映在如与wt mera相比，通过dm11从电子废物浸取液对金的改进的还原和回收方面(图28)。dm11在从aucl3溶液(67％)和电子废物浸取液(67％)回收au
3
方面同样有效(图29)。
[0212]
表6：通过dm选择鉴定的突变体的动力学参数。二聚化区域(dm10-15)和残基位置323(dm4和dm5)中的突变体显示催化效率的最大增加。*(delδ324-365)
[0213][0214]
然而，对于从aucl3还原，可以观察到复杂度增加的aunp，而对于从浸取液还原，可以观察到复杂度有限的aunp(图30)。这可能是由于浸取液中au
3
的量总体较低所致。据信，如果可以克服这种限制，可以观察到金回收的更大改进。mera是细菌耐汞系统中的必需酶。基于其反应机制和可得的晶体结构，设想也可以对其进行工程化用于有效的金还原。为此，建立高通量选择程序，所述程序涉及毒性琼脂板选择和之后更严格的液体培养选择。通过易错pcr和多位点饱和诱变二者构建突变体文库，并使所述文库经历此两步式选择。作为结果，已经鉴定出具有增强的金还原/金回收特性的mera突变体。这构成合成浸滤剂生物学的合成金属回收部分。
[0215]
蛋白质表达和纯化
[0216]
使用t7表达系统表达重组蛋白。用质粒转化rosetta(de3)plyss，并且在含有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的lb琼脂板上进行选择。将单一菌落挑选至5ml的含有两种抗生素的lb培养基中并在37℃下生长过夜。进行100倍稀释，并使培养物在37℃下生长直至od
600
达到0.6。然后通过以0.1mm的终浓度添加异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)来诱导蛋白质表达。在诱导后，使细胞在16℃下再生长18h。通过超声处理裂解细胞，并在镍螯合柱(qiagen)上从澄清的裂解物纯化带his标签的蛋白质。将洗脱液(500mm咪唑、50mm tris-cl ph 7.5、300mm nacl)中的蛋白质样品通过amicon ultra离心过滤器(millipore)浓缩并针对20mm磷酸钠(ph 7.4)透析。
[0217]
金还原测定
[0218]
在25℃下在20mm磷酸钠、ph 7.4、200μm nadph、100μm aucl3中进行酶测定。以分光光度法在340nm下跟踪nadph的氧化。将酶活性单位定义为每分钟催化1.0μmol nadph发生au依赖性氧化的酶的量。
[0219]
实施例6
[0220]
通过mera进行金还原的动力学参数
[0221]
针对底物aucl3使用连续分光光度法测定来确定纯化的汞还原酶(mera)的动力学参数(方案1)。
[0222]
方案1：经由340nm下的吸光度变化监测mera活性的测定。m是指hg
2
或au
3
，则x对应于gsh-或cl。
[0223][0224]
天然底物au
3
还原为au0与nadph氧化为nadp

偶联。通过测量340nm下吸光度的变化来观察nadph的氧化。50μl反应混合物含有100mm pipes(ph7.0)、400μm nadph、17.9μm mera和变化量的au
3
。还使用所述测定使用底物hg(gsh)2来观察mera的天然底物hg
2
还原为hg0。
[0225]
使用hg(gsh)2和aucl3确定mera的动力学参数(表4)。
[0226]
表4：纯化的mera的动力学参数
[0227][0228]
关于汞底物，如与文献报道的10.7μm相比，mera显示96.3
±
57.6μm的较高km。如与所报道的9.43s-1
的发现相比，14.6
±
5.1s-1
的kcat值略快，但是所述差异不显著。与8.8x 105m-1
s-1
的文献发现相比时，1.5
±
0.7x 105m-1
s-1
的总催化效率(k
cat
/km)值比预期低六倍(moore,m.j.,miller,s.m.,walsh,c-terminal cysteines of tn501 mecuric ion reductase(1992)biochemistry 31(6):1677-85)。关于aucl3，未能获得公开数据。在与天然底物hg(gsh)2相比时，使用aucl3的k
cat
/km低四个量级。因此，所述测定能够用于确定mera关于不同底物的还原能力。
[0229]
通过用金感测生物传感器筛选来鉴定改进的金还原mera突变体。从肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型分离的goltsb操纵子与作为报告物的绿色荧光蛋白(gfp)共同起生物传感器的作用(zammit等人,2013)(图19)。这种生物传感器处于gols调节因子的控制下，所述gols调节因子是在au

/au
3
复合物的存在下诱导的。在au

/au
3
离子与gols调节因子相互作用时，所述gols调节因子与其靶启动子序列golb结合。此诱导gols/golb复合物的构象变化，从而促进gfp报告物的转录。我们提出如先前所示将此回路整合至大肠杆菌染色体中[cerminati,s.等人,biotechnol bioeng,108(11),2553-2560(2011)]，并且使用此大肠杆菌菌株进行金还原能力的内源报告。
[0230]
将生物传感器克隆至prsfduet-1载体中，并测试其对金底物的反应性。针对激发和发射波长分别使用485_20和528_20nm过滤器进行荧光测量。还测量每个样品在600nm下的最终光学密度(od
600
)。根据下式(式1)将荧光测量(fs)归一化。
[0231][0232]
其中rfu
样品
是荧光(以仪器的任意相对荧光单位来测量)，
[0233]
并且是针对从传感器细菌获得的每个样品确定的最终光学密度，并且rfu
prsf
和是针对携带pprsfduet-1载体的菌株确定的相同参数。计算诱导系数(ic)，其中是暴露于金属的传感器细菌的归一化荧光值，并且是在不添加金属的情况下培养的生物传感器的归一化荧光(背景荧光)。
[0234]
荧光随着au
3
浓度的递增浓度而增加，直至100μm(图20)。在较高浓度下，荧光急剧减少，可能是由于大肠杆菌对金属毒性的敏感性所致。对于传感器，确定au
3
检测的限值(即，与背景相比产生可检测的荧光增加的最低和最高金浓度)是100nm至100μm。因此，已经证实所述传感器能够区分au
3
的不同浓度，并且将用于筛选最佳金还原mera突变体。
[0235]
对最佳金还原mera突变体的筛选是基于对荧光下降的观察，其对应于细胞内存在的au
3
离子的下降，因此起金还原活性的间接报告物的作用(图21)。在金离子和控制质粒的存在下，将诱导生物传感器，从而产生强荧光信号，但是在金还原mera突变体的存在下，金离子将被还原，从而导致缺少荧光。
[0236]
实施例7
[0237]
紫色色杆菌中的金生物传感器对银离子灵敏。
[0238]
测试图31a中所示生物传感器对基本培养基中不同金属离子的灵敏度。所述生物传感器感测金离子和银离子，但是对其他金属(包括钙、锌、汞、镍、钴、铁和铜离子)没有高反应(图31b)。剂量反应显示，突变体生物传感器对金离子和银离子比野生型生物传感器更灵敏，具有更大动态范围(图32)。
[0239]
实施例8
[0240]
通过紫色色杆菌从电子废物浸取的贵金属离子的感测
[0241]
将紫色色杆菌与电子废物一起孵育并培养6天，以将贵金属从电子废物浸取至水性培养物中。在培养6天后，将紫色色杆菌细胞离心沉降，并将用过的培养基添加至含有实施例7中所用生物传感器的紫色色杆菌(图33)。在含有浸取的esm的用过的培养基而非对照培养基中激活转录因子生物传感器(图34)。响应于含有浸取的esm的第6天用过的培养基，突变体生物传感器荧光输出是2515rfu，而野生型生物传感器是1101rfu。icp分析显示，在6天用过的培养物中，在用过的培养基中存在1.1ppm(5.6μm)金离子、0.34ppm(3.2μm)银离子和12.3ppm(193.2μm)铜离子。这显示，紫色色杆菌中的生物传感器在来自浸取的电子废物培养基的金离子和银离子的存在下被激活。这在激活紫色色杆菌中的其他合成回路模块时将是有用的。
[0242]
总结
[0243]
1.针对本发明，已经使用汞还原酶(mer)系统实现了金属氰化后金属氰化物复合物的生物还原。
[0244]
2.针对本发明，工具将允许构建用于浸滤剂生物学的合成回路，并且涉及用于有效金属回收的相应生物系统的连续且适当的表达和激活，并且包括以下特征：
[0245]
a.在将电子废物添加至生物反应器后，合成生氰作用模块的调节的诱导型表达。这使得能及时产生氰化物浸滤剂用于金属生物浸取。
[0246]
b.在检测到相应金属氰化物复合物后，合成金属回收模块的特异性短暂表达。由于电子废物的异质性，不同浓度的金属(和相关金属离子)使得需要暂时去除相应金属；这将通过对金属离子价和身份具有特异性的工程化mer系统的选择性表达来实现。
[0247]
c.在金属回收后合成氰解模块的调节的诱导型表达，以代谢过量氰化物浸滤剂，从而将氰化物的碳和氮原子输送回中心代谢途径中。
[0248]
参考文献
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