用于检测AAV脱落的试剂和方法与流程

用于检测aav脱落的试剂和方法
1.本技术通过引用并入与本技术一起以计算机可读形式提交的序列表，其具有2918p21346wo_seqlisting.txt的文件名，且大小为14.4 kb。
2.背景基因疗法领域正在以惊人的速度进展。为了促进该进展，必须满足适当的安全标准。当利用病毒载体用于递送基因疗法时，测量的关键安全变量是从患者释放和/或脱落的病毒颗粒。仍然迫切需要用于测量患者病毒脱落滴度的准确且可重复的机制。
3.概述本公开提供了适用于准确定量(例如来自受试者、例如人的样品中的)某些病毒颗粒的组合物和方法。
4.在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含引物的集合。在一些实施方案中，组合物包含引物的集合和一种或多种探针。
5.在一些实施方案中，引物的集合包含一种或多种正向引物。在一些实施方案中，至少一种正向引物具有根据seq id no:1的核苷酸序列或其活性片段。
6.在一些实施方案中，引物的集合包含一种或多种反向引物。在一些实施方案中，至少一种反向引物具有根据seq id no:11的核苷酸序列或其活性片段。
7.在一些实施方案中，至少一种探针具有根据seq id no:17的核苷酸序列或其活性片段。
8.在一些实施方案中，组合物包含引物的集合和一种或多种探针序列，其中至少一种引物具有根据seq id no:1的核苷酸序列或其活性片段，至少一种引物具有根据seq id no:11的核苷酸序列或其活性片段，且至少一种探针具有根据seq id no:17的核苷酸序列或其活性片段。
9.在一些实施方案中，组合物包含样品。在一些实施方案中，样品从已被施用病毒载体的受试者获得。在一些实施方案中，病毒载体是aav构建体。
10.在一些实施方案中，组合物包含从已被施用杜氏肌营养不良(dmd)aav构建体的受试者获得的样品。在一些实施方案中，向受试者施用的dmd aav构建体包含一个或多个调节元件和一个或多个目标治疗基因。在某些实施方案中，从已被施用dmd aav构建体的受试者获得的样品包含含有所述dmd aav构建体或其片段的核酸。在某些实施方案中，dmd aav构建体包含一个或多个调节元件，其中所述一个或多个调节元件包含增强子、启动子、聚a信号序列或其组合。在一些实施方案中，dmd aav构建体包含含有微肌营养不良蛋白的目标治疗基因。
11.在一些实施方案中，本文所述的组合物进一步包含多个扩增子。在一些实施方案中，扩增子(例如，每种扩增子)包含：(a)第一链，其包含：(i)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(ii)对应于dmd aav构建体或其片段的部分的核苷酸序列；(b)第二链，其包含：(i)所述反向引物的核苷酸序列，和(ii)与dmd aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸；或(c)其组合。在一些实施方案中，dmd aav构建体或其片段的部分包含跨越两个调节元件之间的连接、构建体和调节元件之间的连接、或调节元件和目标治疗基因之间的连接的核苷
aav构建体包含一个或多个调节元件，其中所述一个或多个调节元件包含增强子、启动子、聚a信号序列或其组合。在一些实施方案中，hem-b aav构建体包含含有因子ix的目标治疗基因。
22.在一些实施方案中，本文所述的组合物进一步包含多个扩增子。在一些实施方案中，扩增子(例如，每种扩增子)包含：(a)第一链，其包含：(i)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(ii)对应于hem-b aav构建体或其片段的部分的核苷酸序列；(b)第二链，其包含：(i)所述反向引物的核苷酸序列，和(ii)与hem-b aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸；或(c)其组合。在一些实施方案中，hem-b aav构建体或其片段的部分包含跨越两个调节元件之间的连接、构建体和调节元件之间的连接、或调节元件和目标治疗基因之间的连接的核苷酸序列。
23.在一些实施方案中，包含如本文所述的多种扩增子的组合物还包含至少一种或多种能够与扩增子杂交的探针序列或其活性片段。在一些实施方案中，包含如本文所述的多个扩增子的组合物还包含至少一种或多种探针序列。在一些实施方案中，至少一种探针序列具有根据seq id no:55的核苷酸序列或活性片段并且能够与扩增子杂交。在一些实施方案中，一种或多种探针序列易于检测。在一些实施方案中，探针或探针-扩增子杂交的水平是可定量的(例如，荧光的水平是可定量的，荧光猝灭的水平是可定量的，总扩增子量的水平是可定量的，或游离的和/或杂交探针是可定量的)。
24.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括使获得自试者的样品与如本文所述的组合物接触，其中已向所述受试者施用hem-b aav构建体，且其中所述hem-b aav构建体包含一个或多个调节元件和目标治疗基因。
25.在一些实施方案中，方法包括扩增靶序列以生成多个扩增子。在一些实施方案中，靶序列是hem-b aav构建体或其片段。在一些实施方案中，每种扩增子包含：(i)第一链，其包含：(1)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(2)与hem-b aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，hem-b aav构建体或其片段的部分包含跨越两个调节元件之间的连接、构建体和调节元件之间的连接、或调节元件和目标治疗基因之间的连接的核苷酸序列。
26.在本文所述的方法的一些实施方案中，组合物包含多种探针，每种探针具有根据seq id no:55的核苷酸序列或其活性片段。在一些实施方案中，组合物包含多种探针，且所述多种探针的至少一个子集包含根据seq id no:55的核苷酸序列或其活性片段。
27.在一些实施方案中，本文所述的方法包括检测多种探针和多种扩增子之间的杂交水平。在一些实施方案中，杂交的存在指示样品中的hem-b aav构建体。在一些实施方案中，本文所述的方法包括定量多种探针和多种扩增子之间的杂交水平。在一些实施方案中，与杂交水平相关的量指示样品中的hem-b aav构建体的量。
28.在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含引物的集合和/或引物和探针的集合，其中一种或多种正向引物、一种或多种反向引物、一种或多种探针或其组合是脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含引物的集合和/或引物和探针的集合，其中一种或多种正向引物、一种或多种反向引物、一种或多种探针或其组合是未修饰的、修饰的、合成的dna，其包含氨基修饰剂，包含结合修饰剂，包含间隔物，包含类似物，包含插入剂，包含反义部分，或其任何组合。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含
引物的集合和/或引物和探针的集合，其中一种或多种正向引物、一种或多种反向引物、一种或多种探针或其组合是rna。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含引物的集合和/或引物和探针的集合，其中一种或多种正向引物、一种或多种反向引物、一种或多种探针或其组合是未修饰的、修饰的、合成的rna，其包含氨基修饰剂，包含结合修饰剂，包含间隔物，包含类似物，包含插入剂，包含反义部分，或其任何组合。
29.在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含引物的集合和/或引物和探针的集合，其中一种或多种正向引物、一种或多种反向引物、一种或多种探针或其组合包含可检测标记物。在一些实施方案中，其中组合物包含一种或多种可检测标记物，一种或多种可检测标记物可以不包含核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种作为荧光部分的可检测标记物。在一些实施方案中，其中组合物包含可检测标记物，一种或多种探针包含所述可检测标记物。在一些实施方案中，其中组合物包含含有可检测标记物的探针，所述可检测标记物包含荧光部分。在一些实施方案中，其中组合物包含多于一种引物和/或探针，所述引物和/或探针包含作为荧光部分的可检测标记物，所述引物和/或探针可以包含相同的荧光部分。在一些实施方案中，其中组合物包含多于一种引物和/或探针，所述引物和/或探针包含作为荧光部分的可检测标记物，所述探针可以包含不同的荧光部分。在一些实施方案中，其中组合物包含一种或多种探针，所述探针包含作为荧光部分的可检测标记物，所述探针可以进一步包含一种或多种猝灭剂。在一些实施方案中，其中组合物包含一种或多种探针，所述探针包含作为荧光部分的可检测标记物，所述探针可以进一步包含多于一种猝灭剂分子，所述猝灭剂分子可以是相同的分子，或者可以是不同的分子。
30.在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其中活性片段为至少10个核苷酸的长度、至少11个核苷酸的长度、至少12个核苷酸的长度、至少13个核苷酸的长度、至少14个核苷酸的长度、至少15个核苷酸的长度、至少16个核苷酸的长度、至少17个核苷酸的长度、至少18个核苷酸的长度、至少19个核苷酸的长度、至少20个核苷酸的长度、至少21个核苷酸的长度、至少22个核苷酸的长度、至少23个核苷酸的长度、至少24个核苷酸的长度、至少25个核苷酸的长度、至少26个核苷酸的长度、至少27个核苷酸的长度、至少28个核苷酸的长度或至少29个核苷酸的长度。
31.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含一个或多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与所述目标基因对应或互补的序列，且所述第二引物包含与调节元件对应或互补的序列。
32.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括(a)使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含一个或多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与所述目标基因对应或互补的序列，且所述第二引物包含与调节元件对应或互补的序列；和(b)进行聚合酶链式反应以生成多个扩增子，其中所述靶序列是aav构建体或其片段，且每种扩增子包含：(i)第一链，其包含：(1)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(2)对应于aav构建体或其片段的部分的核苷酸序列；(ii)第二链，其包含：(1)所述反向引物的核苷酸序列，和(2)与aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸序列；或(iii)其组合。
33.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括(a)使获得自受试者的样品与包含
第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含一个或多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与所述目标基因对应或互补的序列，且所述第二引物包含与调节元件对应或互补的序列；和b)进行聚合酶链式反应以生成多个扩增子，其中所述靶序列是aav构建体或其片段，且每种扩增子包含：(i)第一链，其包含：(1)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(2)对应于aav构建体或其片段的部分的核苷酸序列；(ii)第二链，其包含：(1)所述反向引物的核苷酸序列，和(2)与aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸序列；或(iii)其组合；且其中aav构建体或其片段的部分包含跨越调节元件和目标治疗基因之间的连接的核苷酸序列。
34.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含两个或更多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与第一调节元件对应或互补的序列，且所述第二引物包含与第二调节元件对应或互补的序列。
35.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括(a)使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含两个或更多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与第一调节元件对应或互补的序列，且所述第二引物包含与第二调节元件对应或互补的序列；和(b)进行聚合酶链式反应以生成多个扩增子，其中所述靶序列是aav构建体或其片段，且每种扩增子包含：(i)第一链，其包含：(1)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(2)对应于aav构建体或其片段的部分的核苷酸序列；(ii)第二链，其包含：(1)所述反向引物的核苷酸序列，和(2)与aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸序列；或(iii)其组合。
36.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括(a)使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含两个或更多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与第一调节元件对应或互补的序列，且所述第二引物包含与第二调节元件对应或互补的序列；和(b)进行聚合酶链式反应以生成多个扩增子，其中所述靶序列是aav构建体或其片段，且每种扩增子包含：(i)第一链，其包含：(1)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(2)对应于aav构建体或其片段的部分的核苷酸序列；(ii)第二链，其包含：(1)所述反向引物的核苷酸序列，和(2)与aav构建体或其片段的部分互补的核苷酸序列；或(iii)其组合；且其中aav构建体或其片段的部分包含跨越所述第一调节元件和所述第二调节元件之间的连接的核苷酸序列。
37.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含构建体序列、一个或多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与构建体序列对应或互补的序列，且所述第二引物包含与调节元件对应或互补的序列。
38.在一些实施方案中，本公开提供了方法，其包括(a)使获得自受试者的样品与包含第一引物和第二引物的组合物接触，其中所述受试者先前已被施用包含构建体序列、一个或多个调节元件和目标基因的aav构建体，其中所述第一引物包含与构建体序列对应或互补的序列，且所述第二引物包含与调节元件对应或互补的序列；和(b)进行聚合酶链式反应以生成多个扩增子，其中所述靶序列是aav构建体或其片段，且每种扩增子包含：(i)第一链，其包含：(1)对应于所述正向引物的核苷酸序列，和(2)对应于aav构建体或其片段的部
末端至c-末端的顺序呈现。
44.施用：如本文所用，术语“施用”通常是指将组合物适用于受试者或系统以实现将药剂递送至受试者或系统。在一些实施方案中，药剂是组合物或包含在组合物中；在一些实施方案中，通过组合物或其一种或多种组分的代谢生成药剂。本领域普通技术人员将意识到在适当情况下可用于适用于受试者、例如人的各种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是全身的或局部的。在一些实施方案中，全身施用可以是静脉内的。在一些实施方案中，施用可以是局部的。局部施用可以涉及经由例如通过圆窗膜注射或注射入鼓阶、通过内淋巴、外淋巴和/或管造口术后的内淋巴中阶注射递送至耳蜗外淋巴。在一些实施方案中，施用可以仅涉及单次剂量。在一些实施方案中，施用可以涉及应用固定数量的剂量。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇性(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或周期性(例如，分开共同的时间段的单一剂量)给药的给药。在一些实施方案中，施用可以涉及持续至少选定的时间段的连续给药(例如，灌注)。
45.等位基因：如本文所用，术语“等位基因”是指特定多态基因组基因座的两个或更多个现有遗传变体之一。
46.改善：如本文所用，术语“改善”是指受试者的状态的预防、减少或缓和，或受试者的状态的改善。改善可以包括但不要求疾病、病症或病况的完全恢复或完全预防。
47.氨基酸：在其最广泛的意义上，如本文所用，术语“氨基酸”是指可以例如通过形成一个或多个肽键并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构，例如，h2n-c(h)(r)-cooh。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中通常发现的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。在一些实施方案中，与如上所示的一般结构相比，氨基酸，包括多肽中的羧基末端和/或氨基末端氨基酸，可以含有结构修饰。例如，在一些实施方案中，与一般结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如，氨基、羧酸基、一个或多个质子和/或羟基的)来修饰。在一些实施方案中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，这种修饰可以例如改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，这种修饰不会显著改变含有修饰氨基酸的多肽的相关活性。
48.扩增子：如本文所用，术语“扩增子”是指通过扩增(例如，聚合酶链式反应(pcr))或复制过程产生的多核苷酸。扩增子也可以称为“pcr产物”。扩增子可以对于特定的多核苷酸构建体、寡核苷酸引物对和/或寡核苷酸探针是特异性的。例如，“扩增子”可以是指(a)第一链，其包含(i)对应于正向引物的核苷酸序列和(ii)对应于构建体或其片段的链的一部分的核苷酸序列，和/或(b)第二链，其包含：(i)反向引物的核苷酸序列，和(ii)与构建体或其片段的链的一部分互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，“扩增子”可以是指(a)第一链，其包含(i)对应于正向引物的核苷酸序列，(ii)对应于构建体或其片段的链的一部分的核苷酸序列，和(iii)与反向引物互补的核苷酸序列；和/或(b)第二条链，其包含：(i)反向引物的核苷酸序列，(ii)与构建体或其片段的链的一部分互补的核苷酸序列，和(iii)与正向引物互补的核苷酸序列。
49.近似或约：如本文所用，术语“近似”或“约”可应用于一个或多个目标值，包括与规定的参考值相似的值。在一些实施方案中，术语“近似”或“约”是指落在规定参考值的
±
10%(大于或小于)内的值范围，除非另有说明或以其他方式从上下文显而易见(除非这种数字将超过可能值的100%)。例如，在一些实施方案中，术语“近似”或“约”可以涵盖在参考值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%1%或更低内的值范围。
50.相关的：如本文所用，术语“相关的”将两个事件或实体描述为彼此“相关的”，如果一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平和/或形式相关的话。例如，如果特定实体(例如多肽、遗传特征、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与(例如，在相关群体中)疾病、病症或病病况的发生和/或对(例如，在相关群体中)疾病、病症或病症的易感性相关，则其被认为与特定疾病、病症或病况相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使得它们彼此物理接近和/或保持物理接近，则它们彼此物理“相关”。在一些实施方案中，彼此物理相关的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，彼此物理相关的两个或更多个实体彼此不共价连接而是非共价缔合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合的方式。
51.生物活性的：如本文所用，术语“生物活性的”是指由目标药剂或实体实现的可观察的生物效应或结果。例如，在一些实施方案中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施方案中，生物途径或事件的调节(例如，诱导、增强或抑制)是生物活性。在一些实施方案中，通过检测由目标生物途径或事件产生的直接或间接产物来评价生物活性的存在或程度。
52.特征性部分：如本文所用，术语“特征性部分”在最广义上是指物质的一部分，其存在(或不存在)与物质的特定特征、属性或活性的存在(或不存在)相关。在一些实施方案中，物质的特征性部分是在给定物质和共享特定特征、属性或活性的相关物质中发现、但在不共享特定特征、属性或活性的那些中没有发现的部分。在一些实施方案中，特征性部分与完整物质共享至少一个功能特征。例如，在一些实施方案中，蛋白或多肽的“特征性部分”是含有氨基酸的连续延伸段或氨基酸的连续延伸段的集合(它们一起是蛋白或多肽的特征)的蛋白或多肽的“特征性部分”。在一些实施方案中，每个此类连续延伸段通常含有至少2、5、10、15、20、50或更多个氨基酸。一般而言，物质(例如蛋白、抗体等的)的特征性部分是除了上述指定的序列和/或结构同一性以外与相关完整物质共享至少一个功能特征的部分。在一些实施方案中，特征性部分可以是生物活性的。
53.特征性序列：如本文所用，术语“特征性序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，且因此可以由本领域普通技术人员用来定义成员的家庭。
54.特征性序列元件：如本文所用，短语“特征性序列元件”是指在聚合物中(例如，在多肽或核酸中)中发现的序列元件，其代表该聚合物的特征部分。在一些实施方案中，特征性序列元件的存在与聚合物的特定活性或特性的存在或水平相关。在一些实施方案中，特征性序列元件的存在(或不存在)将特定聚合物定义为此类聚合物的特定家族或组的成员(或不是成员)。特征性序列元件通常包含至少两个单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，特征性序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施方案中，特征性序列元件包括由一个或多个间隔区隔开的至少第一和第二连续单体延伸段，所述间隔区的长度在共享
序列元件的聚合物中可以变化或可以不变化。
55.切割：如本文所用，术语“切割”是指在dna中生成断裂。例如，在一些实施方案中，切割可以是指单链断裂或双链断裂，这取决于可用于引起这种断裂的核酸酶的类型。
56.组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指其中受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，可以同时施用两种或更多种药剂。在一些实施方案中，可以依次施用两种或更多种药剂。在一些实施方案中，可以在重叠给药方案中施用两种或更多种药剂。
57.可比较的：如本文所用，术语“可比较的”是指两种或更多种药剂、实体、情况、条件集合、受试者、群体等，其可能彼此不同，但足够相似以允许在它们之间进行比较，使得本领域技术人员将理解可以基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比较的药剂、实体、情况、条件集合、受试者、群体等的集合的特征在于多个基本上相同的特征和一个或少量不同的特征。本领域普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下，两种或更多种此类药剂、实体、情况、条件集合、受试者、群体等需要什么程度的同一性才能被认为是可比较的。例如，本领域普通技术人员将理解，当特征在于足够数量和类型的基本上相同的特征时，药剂、实体、情况的集合、条件、受试者、群体等的集合与彼此可比较，以保证以下合理的结论，即在不同的环境、刺激、药剂、实体、情况的集合、条件、受试者、群体等的集合下或用不同的环境、刺激、药剂、实体、情况的集合、条件、受试者、群体等的集合获得的结果或观察到的现象的差异由不同的那些特征的变化引起或指示由不同的那些特征的变化。
58.构建体：如本文所用，术语“构建体”是指包含能够携带至少一种异源多核苷酸的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，构建体可以是质粒、转座子、粘粒、人工染色体(例如，人人工染色体(hac)、酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac))或病毒构建体，以及任何gateway
®
质粒。例如，构建体可以包括足够用于表达的顺式作用元件；其他表达元件可以由宿主灵长类动物细胞或在体外表达系统中提供。构建体可以包括当与适当的控制元件缔合时能够复制的任何遗传元件(例如，质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒构建体等)。因此，在一些实施方案中，“构建体”可以包括克隆和/或表达构建体和/或病毒构建体(例如，腺相关病毒(aav)构建体、腺病毒构建体、慢病毒构建体或逆转录病毒构建体)。
59.保守的：如本文所用，术语“保守的”是指描述保守氨基酸取代的实例，包括用具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链r基团的另一个氨基酸残基取代氨基酸残基。一般而言，保守的氨基酸取代不会实质上改变蛋白的目标功能特性，例如受体结合配体的能力。具有相似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括：脂肪族侧链，诸如甘氨酸(gly，g)、丙氨酸(ala，a)、缬氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)和异亮氨酸(ile，i)；脂肪族-羟基侧链，诸如丝氨酸(ser，s)和苏氨酸(thr，t)；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺(asn，n)和谷氨酰胺(gln，q)；芳香侧链，诸如苯丙氨酸(phe，f)、酪氨酸(tyr，y)和色氨酸(trp，w)；碱性侧链，在诸如赖氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)和组氨酸(his，h)；酸性侧链，诸如天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)；和含硫侧链，诸如半胱氨酸(cys，c)和甲硫氨酸(met，m)。保守氨基酸取代基包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸(val/leu/ile、v/l/i)、苯丙氨酸/酪氨酸(phe/tyr，f/y)、赖氨酸/精氨酸(lys/arg，k/r)、丙氨酸/缬氨酸(ala/val，a/v)、谷氨酸/天冬氨酸(glu/asp，
e/d)和天冬酰胺/谷氨酰胺(asn/gln，n/q)。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白中的任何天然残基，如在例如丙氨酸扫描诱变中所使用。在一些实施方案中，进行在gonnet, g.h. 等人, 1992, science 256:1443-1445(其通过引用以其整体并入本文)中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的保守取代。在一些实施方案中，取代是适度保守的取代，其中所述取代在pam250对数似然矩阵中具有非负值。本领域技术人员会理解，来自不同物种的相同蛋白之间不保守的氨基酸的改变(例如，取代、添加、缺失等)不太可能对蛋白的功能具有影响，并且因此，应选择这些氨基酸进行突变。不应改变(例如，缺失、添加、取代等)来自不同物种的相同蛋白之间保守的氨基酸，因为这些突变更可能导致蛋白功能的变化。
60.对照：如本文所用，术语“对照”是指本领域理解的作为针对其比较结果的标准品的“对照”的含义。通常，对照用于通过隔离变量来加强实验的完整性，以便对此类变量做出结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较物的反应或测定。例如，在一个实验中，应用“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，“对照”， 不应用所测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(例如，先前进行的测试或测定或先前已
知的量或结果的历史对照)。在一些实施方案中，对照是或包含打印的或以其他方式保存的记录。在一些实施方案中，对照是阳性对照。在一些实施方案中，对照是阴性对照。
61.确定、测量、评估、评价、测定和分析：如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评估”、“评价”、“测定”和“分析”可互换使用以指任何形式的测量，并且包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定。测定可以是相对的或绝对的。例如，在一些实施方案中，“测定
…
存在的”可以是确定某物存在的量和/或确定其是否存在。
62.编辑：如本文所用，术语“编辑(edit)”、“编辑(editing)”或“编辑的(edited)”是指通过选择性缺失特定核酸序列(例如，基因组靶序列)、通过使用外源核酸序列来给定特异性包括新序列或用外源核酸序列替换核酸序列来改变多核苷酸的核酸序列(例如，野生型天然存在的核酸序列或突变的天然存在的序列)的方法。在一些实施方案中，这种特定基因组靶标包括但可以不限于染色体区域、线粒体dna、基因、启动子、开放阅读框或任何核酸序列。
63.工程改造的：一般而言，如本文所用，术语“工程改造的”是指已被人工操纵的方面。例如，如果细胞或生物体被操纵以使得改变其遗传信息(已经引入先前不存在的新遗传物质，例如，通过转化、接合、体细胞杂交、转染、转导或其他机制，或改变或除去先前存在的遗传物质，例如通过取代或缺失突变，或通过接合方案)，则所述细胞或生物体被认为是“工程改造的”。如通常实践和本领域技术人员所理解，工程改造的多核苷酸或细胞的后代通常仍被称为“工程改造的”，即使实际操作在先前实体上进行。
64.赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于期望的稠度或稳定效果的非活性(例如，非治疗性)试剂。在一些实施方案中，合适的药物赋形剂可以包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
65.表达：如本文所用，术语核酸序列的“表达”是指从核酸序列生成任何基因产物(例如转录物，例如mrna，例如多肽等)。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下中的一种或多种：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)加工rna转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白；和/或(4)翻译后修饰多肽或蛋白。
66.功能性：如本文所用，术语“功能性”描述以某种形式存在的事物，在该形式中，其表现出它所表征的特性和/或活性。例如，在一些实施方案中，“功能性”生物分子是某种形式的生物分子，在该形式中，其表现出它所表征的特性和/或活性。在一些此类实施方案中，功能性生物分子相对于另一种非功能性生物分子的特征在于“非功能性”形式不表现出与“功能性”分子相同或等效的特性和/或活性。生物分子可能具有一种功能、两种功能(即双功能)或多种功能(即多功能)。
67.基因：如本文所用，术语“基因”是指染色体中编码基因产物(例如rna产物，例如多肽产物)的dna序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些具体实施方案中，基因可以包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列两者。在一些实施方案中，基因可以包括一种或多种调节序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列，例如，其可以控制或影响基因表达的
一个或多个方面(例如，细胞类型-特异性表达、可诱导表达等)。如本文所用，术语“基因”通常是指编码多肽或其片段的核酸部分；该术语可以任选地涵盖调节序列，这对于本领域普通技术人员来说从上下文将是清楚的。该定义并非旨在排除术语“基因”对非蛋白编码表达单元的应用，而是澄清在大多数情况下，如本文件中所用的术语是指编码多肽的核酸。在一些实施方案中，基因可以编码多肽，但该多肽可能没有功能，例如，基因变体可以编码相对于野生型基因不以相同方式发挥功能或根本不发挥功能的多肽。在一些实施方案中，基因可以编码转录物，在一些实施方案中，其可能具有超过阈值水平的毒性。在一些实施方案中，基因可以编码多肽，但该多肽可能没有功能和/或可能具有超过阈值水平的毒性。
68.基因疗法：如本文所用，术语“基因疗法”意指涉及向受试者施用生物或合成产生的组合物的疗法，所述组合物(a)在体内或离体递送核酸，诸如dna或rna，并导致由递送的dna或rna编码的rna序列和/或蛋白的瞬时或稳定表达，该表达可以来自附加体或来自已整合至基因组中的核酸，(b)递送mrna并导致从递送的mrna表达蛋白，或(c)递送任何基因编辑或碱基编辑系统，包括但不限于talens、megatal、锌指蛋白、crispr/cas9或其他基于cas的系统，这种基因编辑或碱基编辑系统的递送导致(1)向染色体序列元件引入表观遗传修饰，该表观遗传修饰改变与染色体序列元件缔合的基因的转录，或(2)缺失、插入或修饰基因组或转录组的dna或rna序列。
69.基因组编辑系统：如本文所用，术语“基因组编辑系统”是指具有dna编辑活性的任何系统。除了别的以外，dna编辑活性可以包括在基因组中缺失、替换或插入dna序列。在一些实施方案中，基因组编辑系统包含rna引导的dna编辑活性。在一些实施方案中，本公开的基因组编辑系统包括多于一种组分。在一些实施方案中，基因组编辑系统包括至少两种改编自天然存在的crispr系统的组分：指导rna (grna)和rna-指导的核酸酶。在某些实施方案中，这两种组分形成复合物，所述复合物能够与特定核酸序列缔合并编辑该核酸序列中或周围的dna，例如通过产生单链断裂(ssb或切口)、双链断裂(dsb)和/或点突变中的一种或多种。在一些实施方案中，本公开的基因组编辑系统缺乏具有切割活性的组分但维持具有dna结合活性的组分。在一些此类实施方案中，本公开的基因组编辑系统包含作为dna活性(例如，转录、翻译等)的抑制剂发挥功能的组分。在一些实施方案中，本公开的基因组编辑系统包含与调节剂融合以调节靶dna表达的组分。
70.基因组修饰：如本文所用，术语“基因组修饰”是指在细胞的基因组区域中进行的改变，其永久性地改变该细胞的基因组(例如，内源基因组)。在一些实施方案中，此类改变是体外的、离体的或体内的。在一些实施方案中，活生物体中的每个细胞都被修饰。在一些实施方案中，仅对(诸如例如特定器官中的)特定细胞组进行修饰。例如，在一些实施方案中，通过缺失、取代或添加来自一个或多个基因组区域的一个或多个核苷酸来修饰基因组。在一些实施方案中，在干细胞或未分化细胞中进行基因组修饰。在一些此类实施方案中，相对于修饰前的亲本基因组，基因组修饰的细胞或生物体的后代也将被基因组修饰。在一些实施方案中，对成熟或有丝分裂后细胞进行基因组修饰，使得不会生成后代，且因此除了在特定细胞中之外没有繁殖的基因组修饰。
71.异源：如本文所用，术语“异源”可以关于特定分子的一个或多个区域与另一个区域和/或另一个分子相比使用。例如，在一些实施方案中，异源多肽结构域是指多肽结构域不天然一起出现(例如，在相同多肽中)的事实。例如，在人工生成的融合蛋白中，来自一种
多肽的多肽结构域可以融合至来自不同多肽的多肽结构域。在这种融合蛋白中，两个多肽结构域将被认为是彼此“异源的”，因为它们不自然地一起出现。
72.同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间、例如核酸分子(例如，dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列具有至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性，则其被认为彼此“基本上相同”。两个核酸或多肽序列的百分比同一性的计算，例如，可以通过为了最佳比较目的比对两个序列(例如，可以为了最佳比对在第一和第二序列中的一个或两个中引入空位，并且为了比较目的，可以忽略不同的序列)。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或基本上100%；然后比较相应位置的核苷酸。当第一个序列中的位置被与第二个序列中的相应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，则两个分子(即第一个和第二个)在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是所比较的两个序列共享的相同位置的数量的函数，这考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入所述空位以用于两个序列的最佳比对。可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定。例如，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用meyers和miller的算法(cabios, 1989, 4: 11-17，其通过引用以其整体并入本文)确定，所述算法已并入align程序(2.0版)。在一些实施方案中，用align程序进行的核酸序列比较使用pam120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。
73.改善、增加、增强、抑制或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”、“增强”、“抑制”、“减少”或其语法等效物指示相对于基线或其他参考测量值的值。在一些实施方案中，值是与基线或其他参考测量值的统计学显著差异。在一些实施方案中，适当的参考测量值可以是或包括在特定试剂或治疗(例如，之前和/或之后)不存在或存在的其他可比较的条件下或在适当的可比较的参考试剂存在的情况下特定系统中(例如，在单个个体中)的测量值。在一些实施方案中，适当的参考测量值可以是或包括在已知或预期在相关试剂或治疗存在的情况下以特定方式响应的可比较系统中的测量值。在一些实施方案中，适当的参考是阴性参考；在一些实施方案中，适当的参考是阳性参考。
74.调节：如本文所用，术语“调节”意指与不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/或与其他方面相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者的应答水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者、优选人中有益的治疗应答。
75.核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广义上是指被或可以被并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是化合物和/或物质，其经由磷酸二酯键并入或可以并入寡核苷酸链中。如从上下文将清楚的，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含rna；在一些实施方案中，“核酸”是或包含dna。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯骨架。可替代地或另外，在一些实施方案中，核
酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、间插碱基及其组合)、包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、间插碱基及其组合)或由一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、间插碱基及其组合)。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，核酸包含一个或多个修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物如rna或蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过从天然来源分离、通过基于互补模板聚合的酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中繁殖以及化学合成中的一种或多种来制备核酸。在一些实施方案中，核酸是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基长度。在一些实施方案中，核酸是部分或全部单链的；在一些实施方案中，核酸是部分或全部双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。
76.可操作连接的：如本文所用，是指并列关系，其中所述的组分处于允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系。“可操作连接”至功能元件的控制元件以这样的方式缔合：在与控制元件相容的条件下实现功能元件的表达和/或活性。在一些实施方案中，“可操作连接的”控制元件与目标编码元件邻接(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件与目标功能元件反式起作用或以其他方式作用于目标功能元件。在一些实施方案中，“可操作连接的”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。在一些实施方案中，例如，功能连接可以包括转录控制。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。可操作连接的dna序列可以彼此连续，并且例如，在必需连接两个蛋白编码区的情况下，它们位于相同的阅读框中。
77.药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量的量存在，当施用至相关群体时，所述治疗方案显示实现预定治疗效果的统计学显著概率。在一些实施方案中，药物组合物可以专门配制用于以固体或液体形式施用，包括适用于例如施用的那些，例如可注射的制剂，例如水性或非水性溶液或悬浮液或设计用于注入耳道的液滴。在一些实施方案中，药物组合物可以配制用于经由注射在特定器官或隔室中(例如直接注入耳朵)或全身(例如，静脉内)进行施用。在一些实施方案中，制剂可以是或包含浸剂(水溶液或非水溶液或混悬液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂、胶囊剂、粉剂等。在一些实施方案中，活性剂可以是或包含分离、纯化或纯化合物。
78.药学上可接受的：如本文所用，例如可以关于用于配制如本文所公开的药物组合物的载体、稀释剂或赋形剂使用的术语“药学上可接受的”，意味着载体、稀释剂，或赋形剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者无害。
79.药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一个器官或身体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、复兴及或溶剂包封材料。在与制剂的其他成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须都是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；ph缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和用于药物制剂中的其他无毒相容物质。
80.多肽：如本文所用，术语“多肽”是指通常通过肽键连接的残基(例如氨基酸)的任何聚合链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有经工程改造的氨基酸序列，因为它是通过人工的作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者或由其组成。在一些实施方案中，多肽可以包括一个或多个侧基或其他修饰，例如，在多肽的n-末端、在多肽的c-末端或其任何组合修饰或附接至一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可以是乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施方案中，多肽可以含有l-氨基酸、d-氨基酸或两者，并且可以含有本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任一种。在一些实施方案中，有用的修饰可以是或包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指具有小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的长度的多肽。在一些实施方案中，蛋白是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征性部分。
81.多核苷酸：如本文所用，术语“多核苷酸”是指核酸的任何聚合链。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含rna；在一些实施方案中，多核苷酸是或包含dna。在一些实施方案中，多核苷酸是一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然
核酸残基组成。在一些实施方案中，多核苷酸是一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，多核苷酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯骨架。可替代地或另外，在一些实施方案中，多核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，多核苷酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。在一些实施方案中，多核苷酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、间插碱基及其组合)、包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、间插碱基及其组合)或由一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、间插碱基及其组合)。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，多核苷酸包含一个或多个修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，多核苷酸具有编码功能性基因产物如rna或蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过从天然来源分离、通过基于互补模板聚合的酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中繁殖以及化学合成中的一种或多种来制备多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基的长度。在一些实施方案中，多核苷酸是部分或全部单链的；在一些实施方案中，多核苷酸是部分或全部双链的。在一些实施方案中，多核苷酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补物。在一些实施方案中，多核苷酸具有酶促活性。
82.蛋白：如本文所用，术语“蛋白”是指多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白可以包括除了氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白”可以是如由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其特征性部分。普通技术人员将理解蛋白有时可以包括多于一条多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式连接。
83.重组体：如本文所用，术语“重组体”旨在指通过重组方式设计、工程改造、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达构建体表达的多
肽；从重组的组合人多肽文库分离的多肽；从动物(例如小鼠、兔、绵羊、鱼等)分离的多肽，所述动物(例如小鼠、兔、绵羊、鱼等)是一种或多种基因或基因组分转基因的或已被操纵以表达一种或多种基因或基因组分，所述一种或多种基因或基因组分编码所述多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域和/或指导所述多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达；和/或通过任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽，所述方式涉及将选定的核酸序列元件彼此剪接或连接，化学合成选定的序列元件，和/或以其他方式生成核酸，所述核酸编码多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域和/或指导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一种或多种是自然界中发现的。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一种或多种是计算机芯片上设计的。在一些实施方案中，一种或多种此类选定的序列元件来自已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)，例如来自天然或合成来源，诸如例如目标来源生物(例如，人、小鼠等的)的种系中。
84.参考：如本文所用，术语“参考”描述了相对于其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将目标试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，参考或对照与目标测试或确定基本上同时进行测试和/或确定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员将理解，在与评价的条件或环境相当的条件或环境下确定或表征参考或对照。本领域技术人员将理解何时存在足够的相似性以证明对特定可能的参考或对照的依赖和/或与其进行比较。在一些实施方案中，参考是阴性对照参考；在一些实施方案中，参考是阳性对照参考。
85.调节元件：如本文所用，术语“调节元件”或“调节序列”是指以一定方式调节一种或多种特定基因的表达的dna的非编码区。在一些实施方案中，此类基因与给定调节元件并列或“邻近”。在一些实施方案中，此类基因位于距给定调节元件相当远的位置。在一些实施方案中，调节元件损害或增强一种或多种基因的转录。在一些实施方案中，调节元件可以位于所调节基因的顺式位置。在一些实施方案中，调节元件可以位于所调节基因的反式位置。例如，在一些实施方案中，调节序列是指调节与调节序列可操作连接的基因产物的表达的核酸序列。在一些此类实施方案中，该序列可以是增强子序列和调节基因产物的表达的其他调节元件。
86.样品：如本文所用，术语“样品”通常是指从目标来源获得或衍生的材料的等分试样。在一些实施方案中，目标来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，目标来源可以是或包括细胞或生物体，诸如微生物(例如，病毒)、植物或动物(例如，人)。在一些实施方案中，目标来源是或包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物组织或流体可以是或包括羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、乳汁、脑脊液、耳垢、乳糜、chime、射精、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、外淋巴液、腹膜液、胸膜液、脓液、鼻粘膜炎、唾液、皮脂、精液、血清、阴茎垢、痰液、滑液、汗液、眼泪、尿液、阴道分泌物,玻璃体液、呕吐物和/或其组合或组分。在一些实施方案中，生物流体可以是或包括细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间质液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方案中，生物流体可以是或包括植物分泌物。在一些实施方案中，生物组织或样品可以例如通过抽吸、活检(例如，细针或组织活检)、拭子(例如，口腔、鼻腔、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、
导管、鼻腔、眼部、口腔、子宫、阴道或其他洗涤或灌洗)来获得。在一些实施方案中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当方式直接从目标来源获得的“初始样品”。在一些实施方案中，如从上下文将清楚，术语“样品”是指通过处理初始样品(例如，通过除去初始样品的一种或多种组分和/或通过向初始样品添加一种或多种试剂)而获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这种“处理的样品”可以包括例如从样品提取或通过使初始样品经受一种或多种技术诸如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化而获得的核酸或蛋白，等等。
87.受试者：如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括出生前人类形式)。在一些实施方案中，受试者患有相关疾病、病症或病况。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或病况。在一些实施方案中，受试者展现疾病、病症或病况的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不展现疾病、病症或病况的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有对疾病、病症或病况的易感性特征性的一种或多种特征或疾病、病症或病况的风险的某人。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是向其和/或已经向其施用诊断和/或疗法的个体。
88.基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出目标特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或继续完成或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕获许多生物和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。
89.靶位点：如本文所用，术语“靶位点”意指结合分子例如微rna、sirna、指导rna(“grna”)或指导rna:cas复合物将与之结合的核酸的一部分，只要存在足够的结合条件。在一些实施方案中，包含靶位点的核酸是双链的。在一些实施方案中，包含靶位点的核酸是单链的。通常，靶位点包含结合分子(例如，本文所述的grna或grna:cas复合物)与之结合和/或由于这种结合而被切割的核酸序列。在一些实施方案中，靶位点包含与本文所述的grna的靶向序列(本文也称为间隔区)结合的dna序列互补的核酸序列(本文中也称为靶序列或原型间隔区)。在rna-指导的核酸酶(例如crispr/cas核酸酶)的背景下的一些实施方案中，靶位点通常包含与rna-可编程核酸酶的grna中包含的序列(在本文中也称为靶向序列或间隔区)互补的核苷酸序列(在本文中也称为靶序列或原型间隔区)。在一些此类实施方案中，靶位点在与grna-互补序列相邻的3'末端或5'末端进一步包含原型间隔区相邻基序(pam)。对于rna-指导的核酸酶cas9，在一些实施方案中，靶序列可以是16-24个碱基对加上3-6个碱基对的pam(例如，nnn，其中n代表任何核苷酸)。rna-指导的核酸酶、诸如cas9的示例性pam序列是本领域技术人员已知的并且包括但不限于nng、ngn、nag、nga、ngg、ngag和ngcg，其中n代表任何核苷酸。此外，已经描述了来自不同物种的cas9核酸酶，例如，嗜热链球菌识别包含序列nggng的pam，且来自金黄色葡萄球菌的cas9识别包含序列nngrrt的pam。在一些实施方案中，来自金黄色葡萄球菌的cas9识别包含序列nnnrrt的pam。额外pam序列是本领域已知的，包括但不限于nnagaaw和naar(参见，例如，esvelt和wang, molecular systems biology, 9:641 (2013)，其全部内容通过引用并入本文)。例如，rna-指导的核酸酶(诸如例如cas9)的靶位点可以包含结构[nz]-[pam]，其中每个n独立地是任何核苷酸，并且z是1和50之间的整数。在一些实施方案中，z为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、
至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。在一些实施方案中，z为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一些实施方案中，z为20。
[0090]
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、消除、逆转、缓解、抑制、延迟特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状、特征和/或原因的发作，降低特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状、特征和/或原因的严重程度，和/或降低特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状、特征和/或原因的发生率。在一些实施方案中，这种治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病况的早期体征的受试者。可替代地或另外地，这种治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病况的一种或多种确立体征的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断患有相关疾病、病症和/或病况的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有一种或多种易感性因素的受试者，所述易感性因素在统计学上与给定疾病、病症和/或病况的发展风险增加相关。
[0091]
变体：如本文所用，术语“变体”是指某事物的一种版本，例如基因序列，其以某种方式不同于另一种版本。为了确定某物是否是变体，通常会选择参考版本，并且变体相对于该参考版本是不同的。在一些实施方案中，变体可以具有与野生型序列相同或不同(例如，增加或减少)的活性或功能水平。例如，在一些实施方案中，如果变体例如经密码子优化以抵抗例如通过抑制性核酸例如mirna的降解，则其与野生型序列相比可以具有改进的功能。这种变体在本文中被称为功能获得变体。在一些实施方案中，变体具有活性或功能性的降低或消除或导致负面结果的活性变化(例如，增加的电活动，其导致慢性去极化，所述慢性去极化导致细胞死亡)。这种变体在本文中被称为功能丧失变体。在一些实施方案中，功能获得变体是密码子优化的序列，其编码的转录物或多肽可能比其相应的野生型(例如，非密码子优化)版本具有改进的特性(例如，对降解的敏感性更低，例如对mirna介导的降解的敏感性更低)。在一些实施方案中，功能丧失变体具有导致转录物或多肽相对于野生型转录物和/或多肽以某种方式有缺陷(例如，功能降低、无功能)的一个或多个变化。
[0092]
附图简述图1-描绘示例性qpcr测定引物设计的示意图。该示意图展现其中引物和探针可用于qpcr测定中的不同区域。引物和探针组合被设计为对目标病毒和基因有特异性。选择重组病毒基因组(用于不同测定)中跨越人基因组或aav基因组中不以该顺序存在的靶基因特异性序列的区域。对于每个测定，为每个区域设计多种引物和探针，并针对最稳健和特异性的组合进行筛选。
[0093]
图2-描绘用于赋值的siemens储存缓冲液2 (ssb2)中的示例性dmd aav构建体的校准曲线图，如实施例1中所述。
[0094]
图3-描绘用于定量唾液、粪便、尿液和全血生物样品中的示例性dmd aav构建体的精确计算的结果，如实施例1中所述。
[0095]
图4-描绘示例性dmd aav构建体在环境温度下在唾液、粪便、尿液和全血生物样品中经48小时的稳定性。
[0096]
图5-描绘在-80℃下经9个月储存的唾液、粪便、尿液和全血生物样品中的示例性dmd aav构建体的长期稳定性。
[0097]
图6-描绘经多个冷冻/解冻循环的唾液、粪便、尿液和全血生物样品中的示例性dmd aav构建体的稳定性。
[0098]
图7-描绘mnase处理对唾液、尿液和粪便样品中的示例性dmd aav构建体的样品回收率的影响。
[0099]
图8-描绘mnase和dnase处理对全血样品中的示例性dmd aav构建体的样品回收率的影响。
[0100]
图9-描绘示例性定量测定用于测量血浆(小图9a)、pbmc(小图9b)、唾液(小图9c)、精液(小图9d)、粪便(小图9e)或尿液(小图9f)中的示例性hem-b aav构建体的线性和准确度。
[0101]
图10-描绘示例性定量测定用于测量来自五个独特供体的血浆(小图10a)、pbmc(小图10b)、唾液(小图10c)、精液(小图10d)、粪便(小图10e)或尿液(小图10f)中的示例性hem-b aav构建体的变异性。
[0102]
图11-描绘mnase处理对来自唾液(小图11a)、精液(小图11b)、粪便(小图11c)或尿液(小图11d)样品的示例性hem-b aav构建体样品、双链dna或单链dna的回收率的影响。
[0103]
图12-描绘mnase处理对来自唾液、精液、粪便或尿液样品的示例性hem-b aav构建体样品的回收率的影响。
[0104]
图13-描绘在环境温度下经48小时的来自三个独特供体的全血样品中的示例性hem-b aav构建体的稳定性。
[0105]
图14-描绘在环境温度下经48小时的血浆(小图14a)、pbmc(小图14b)、唾液(小图14c)、精液(小图14d)、粪便(小图14e)或尿液(小图14f)样品中的示例性hem-b aav构建体的稳定性。
[0106]
图15-描绘经多个冷冻/解冻循环在血浆(小图15a)、pbmc(小图15b)、唾液(小图15c)、精液(小图15d)、粪便(小图15e)或尿液(小图15f)样品中的示例性hem-b aav构建体的稳定性。
[0107]
图16-描绘在-80℃下储存的血浆(小图16a)、pbmc(小图16b)、唾液(小图16c)、精液(小图16d)、粪便(小图16e)或尿液(小图16f)样品中的示例性hem-b aav构建体的长期稳定性。
[0108]
图17-描绘用于定量示例性dmd aav构建体的一系列定量pcr扩增图。示例性dmd aav构建体的靶向区域1是引物和探针组合dmd-fwd-b (seq id no:3)、dmd-rev-a (seq id no:9)和dmd-探针-a (seq id no:17)(小图17a)。示例性dmd aav构建体的靶向区域2是引物和探针组合dmd-fwd-e (seq id no:63)、dmd-rev-e (seq id no:67)和dmd-探针-f (seq id no:73)(小图17b)。
[0109]
图18-描绘用于定量示例性dmd aav构建体和定量内部对照(ic)的一系列定量pcr扩增图。示例性dmd aav构建体的靶向区域3是引物和探针组合dmd-fwd-f (seq id no:69)、dmd-rev-g (seq id no:71)和dmd-探针-g (seq id no:77)(小图18a)。靶向内部对照dna的是包含cy5荧光的引物和探针(图18b)。
[0110]
图19-描绘与靶向内部对照dna合并物的引物和探针组合复用的靶向dmd的引物和探针组合的定量pcr扩增特征(诸如最大荧光、斜率和最早ct )的一系列结果(小图19a)。组1代表dmd-fwd-a (seq id no:1)、dmd-rev-b (seq id no:11)和dmd-探针-a (seq id no:
17)的组合。组2代表dmd-fwd-a (seq id no:1)、dmd-rev-b (seq id no:11)和dmd-探针-b (seq id no:21)的组合。组3代表dmd-fwd-b (seq id no:3)、dmd-rev-a (seq id no:9)和dmd-探针-a (seq id no:17)的组合。组4代表dmd-fwd-c (seq id no:5)、dmd-rev-d (seq id no:15)和dmd-探针-d (seq id no:29)的组合。组5代表dmd-fwd-d (seq id no:7)、dmd-rev-c (seq id no:13)和dmd-探针-c (seq id no:25)的组合。此外，显示多种浓度的针对dmd特异性寡核苷酸(小图19a)和ic特异性寡核苷酸(小图19b)的引物和探针的结果。
[0111]
图20-描绘用于定量示例性hem-b aav构建体的一系列定量pcr扩增图。示例性dmd aav构建体的靶向区域1是引物和探针组合hemb-fwd-a (seq id no:33)、hemb-rev-a (seq id no:39)和hemb-探针-a (seq id no:47)(小图20a)。示例性hem-b aav构建体的靶向区域2是引物和探针组合hemb-fwd-b (seq id no:35)、hemb-rev-d (seq id no:45)和hemb-探针-c (seq id no:55)(小图20b)。示例性hem-b aav构建体的靶向区域3是引物和探针组合hemb-fwd-d (seq id no:81)、hemb-rev-f (seq id no:87)和hemb-探针-e (seq id no:89)(小图20c)。
[0112]
图21-描绘靶向示例性hem-b aav构建体的引物和探针组合的定量pcr扩增特征(诸如最大荧光、斜率和最早ct)的一系列结果。组1代表hemb-fwd-b (seq id no:35)、hemb-rev-c (seq id no:43)和hemb-探针-b (seq id no:51)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为150nm。组2代表hemb-fwd-b (seq id no:35)、hemb-rev-c (seq id no:(43)和hemb-探针-b (seq id no:(51)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为200nm。组3代表hemb-fwd-c (seq id no:37)、hemb-rev-b (seq id no:41)和hemb-探针-d (seq id no:59)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为250nm。组4代表hemb-fwd-c (seq id no:37)、hemb-rev-b (seq id no:41)和hemb-探针-d (seq id no:59)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为300nm。组5代表hemb-fwd-b (seq id no:35)、hemb-rev-d (seq id no:45)和hemb-探针-c (seq id no:55)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为100nm。组6代表hemb-fwd-b (seq id no:35)、hemb-rev-d (seq id no:45)和hemb-探针-c (seq id no:55)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为150nm。组7代表hemb-fwd-e (seq id no:83)、hemb-rev-f (seq id no:85)和hemb-探针-e (seq id no:89)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为200nm。组8代表hemb-fwd-d (seq id no:81)、hemb-rev-f (seq id no:87)和hemb-探针-e (seq id no:89)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为200nm。组9代表hemb-fwd-d (seq id no:81)、hemb-rev-f (seq id no:87)和hemb-探针-e (seq id no:89)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为300nm。组10代表hemb-fwd-a (seq id no:33)、hemb-rev-a (seq id no:39)和hemb-探针-a (seq id no:47)的组合，每种寡核苷酸的最终浓度为150nm。组1-6靶向示例性hem-b aav构建体的区域2，组7-9靶向示例性hem-b aav构建体的区域3，组10靶向示例性hem-b aav构建体的区域1。
[0113]
图22-描绘用于使用引物探针组合组10(小图22a)、组6(小图22b)和组9(小图22c)定量示例性hem-b aav构建体的一系列定量pcr扩增图。
[0114]
图23-描绘以下六种组织类型中的复用的示例性hem-b aav构建体扩增和示例性内部对照扩增的定量pcr扩增结果的示例性集合：粪便、血浆、pmbc、唾液、精液和尿液。
[0115]
某些实施方案的详述基因疗法
基因疗法是指涉及引入基因或修饰基因表达以治疗、改善和/或预防疾病的技术。存在几种基因疗法的方法，包括但不限于：用健康的基因拷贝替换引起疾病的突变基因；失活或“敲除”不当地发挥功能的突变基因；和/或将基因引入体内以帮助对抗疾病。基因疗法是许多疾病(包括遗传性病症、某些类型的癌症和某些病毒感染)的有前途的治疗选项。通常，基因疗法是针对具有已知遗传关联的疾病和/或认为缺乏目前护理标准的疾病进行测试的。
[0116]
涉及基因疗法技术的临床试验受法规的约束，所述法规可能需要满足某些监测指南。涉及病毒递送方法的一种此类法规需要准确且经常连续测量病毒剂量和病毒“脱落”(通过任何机制从测试受试者释放的病毒颗粒)。本公开提供了有助于对病毒脱落进行基本监测的组合物和方法，为医生和科学家提供稳健和可靠的测量。
[0117]
示例性条件杜氏肌营养不良症杜氏肌营养不良症(dmd)是一种x-连锁的隐性疾病，其影响近似5000名活产男性中的1名(mendell等人，2012年；和moat等人，2013年；其两者均出于任何目的通过引用并入本文)。其在1860年代由法国神经学家guillaume-benjamin-amand duchenne首次详细描述(duchenne 1861，其出于任何目的通过引用并入本文)。具有杜氏肌营养不良症的患者通常在生命的前3年内表现出运动症状。最通常，他们可能具有由臀带无力导致的“蹒跚”步态，并且当他们从地板站起来时需要用其手(高尔氏动作)。
[0118]
该疾病是由于骨骼肌膜中不存在肌营养不良蛋白，并且缺乏肌营养不良蛋白的肌肉更容易受机械损伤影响。肌营养不良蛋白的不存在可以通过肌肉活检样品中肌营养不良蛋白免疫染色的不存在来证明。然而，近年来基因检测变得更容易获得，并已变为诊断证实的标准方法。通常，基因测试从通过多重连接依赖性探针扩增(mlpa)或通过微阵列分析筛选重复或缺失开始。如果重复/缺失测试为阴性，则对所有79个外显子进行测序以检测错义、无义、剪接位点和小插入缺失突变(birnkrant等人，部分3，2018；出于任何目的通过引用并入本文)。根据基因测试结果，可能得到各种基因疗法途径。
[0119]
dmd基因被认为是人基因组中最大的基因之一，并且已经报告了许多破坏性突变。从头突变似乎是常见的，其中估计范围为12%至33%的患者具有dmd (shieh, 2018；其出于任何目的通过引用并入本文)。对不同突变类型的患病率的估计不同，但报告表明，在dmd患者中，69%具有大缺失，11%具有大重复，10%具有无义突变，7%具有错义或小插入缺失，且另外3%具有内含子或其他突变(shieh, 2018；其出于任何目的通过引用并入本文)。肌营养不良蛋白的大尺寸意味着dmd的全基因替代疗法仅对大型病毒、诸如腺病毒载体可行。或者，可以采用小型化但有效形式的肌营养不良蛋白(通常称为“小肌营养不良蛋白”或“微肌营养不良蛋白”)，而不是引入整个大dmd基因。这些小型基因经常足够小，足以包装在腺相关病毒(aav)中。在过去的16年中，用aav的临床前和临床研究经验已经增长，以提供对这些病毒的安全性概况的更好理解。这种经验和知识基础已经使基因疗法的aav载体递送成为关键的临床候选者，包括通过递送微/小肌营养不良蛋白基因来治疗肌肉萎缩症。尽管基于aav的基因疗法可能是突破，但仍然迫切需要准确和可重复的材料和方法来监测使用基因疗法治疗dmd的患者中的aav脱落。
[0120]
血友病b
血友病b，也称为因子ix (fix)缺乏症或圣诞节病，是一种由凝血蛋白因子ix缺失或缺陷引起的遗传病症。尽管其从父母向下传给孩子，但约1/3的病例由从头突变引起。根据美国疾病控制和预防中心，5,000名活婴儿中近似1名中发生血友病。在美国约20,000人具有血友病。所有种族和民族都受影响。血友病b的发病率比血友病a少四倍。具有血友病b的患者的出血比其他人更长。出血可能发生在内部，关节和肌肉中，或者发生在外部，由轻微割伤、牙科手术或外伤发生。人出血的频率和出血的严重程度取决于血浆中fix的多少，血友病b使用评估凝血时间的测定法进行测试。此外，基因检测用于确定个体的血友病b的潜在分子机制，因为已知超过1100种独特的突变引起血友病b。
[0121]
治疗血友病b的主要药物是浓缩的fix产品，称为凝血因子或简称为因子。通过使用dna技术在实验室中开发的重组因子产品排除了使用人源性供体来源的血浆合并物。尽管血浆衍生的fix产品仍然可用，但近似75%的血友病社区使用重组fix产品。这些因子疗法通过手臂中的静脉或胸部中的端口静脉内输注，并且患者经常需要常规昂贵、耗时且繁重的治疗。基因疗法证明对于治疗血友病b是适合且可能高度有效的。然而，尽管基于aav的基因疗法可能是突破，但仍然迫切需要准确和可重复的材料和方法来监测使用基因疗法治疗血友病b的患者中的aav脱落。
[0122]
用于治疗用途的病毒载体除了别的之外，本公开提供了用于测量多核苷酸的组合物和方法。根据本公开的多核苷酸构建体包括本领域已知的所有那些，包括粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒构建体(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒构建体)，其并入目标多核苷酸序列或其特征性部分。
[0123]
本领域技术人员将能够选择合适的构建体用于测量。在一些实施方案中，构建体是病毒构建体。在一些实施方案中，病毒构建体是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒构建体。在一些实施方案中，构建体是腺相关病毒(aav)构建体(参见，例如，asokan等人, mol. ther. 20: 699-7080, 2012，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，病毒构建体是腺病毒构建体。在一些实施方案中，病毒构建体也可以基于或衍生自甲病毒。甲病毒包括辛德毕斯病毒(和veev)病毒、aura病毒、babanki病毒、巴马森林病毒、比巴鲁病毒、卡巴斯欧病毒、基孔肯雅病病毒、东部马脑炎病毒、everglades病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、highlands j病毒、孜拉加奇病毒、马雅罗病毒、me tri病毒、米德尔堡病毒、mosso das pedras病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、o'nyong-nyong病毒、pixuna病毒、rio negro病毒、罗斯河病毒、鲑鱼胰腺病病毒、塞姆利基森林病毒、南方象海豹病毒、图那特病毒、trocara病毒、una病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和瓦塔罗阿病毒。通常，此类病毒的基因组编码可以在宿主细胞的细胞质中翻译的非结构蛋白(例如复制子)和结构蛋白(例如衣壳和包膜)。罗斯河病毒、辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒(sfv)和委内瑞拉马脑炎病毒(veev)都已被用于开发用于编码序列递送的病毒构建体。假型病毒可以通过组合甲病毒包膜糖蛋白和逆转录病毒衣壳形成。甲病毒构建体的实例可以在美国公开号20150050243、20090305344和20060177819中找到；构建体和它们的制造方法通过引用每个出版物以其整体并入本文。
[0124]
适合于测量的构建体可能具有不同的大小。在一些实施方案中，构建体是质粒且可以包括多达约1 kb、多达约2 kb、多达约3 kb、多达约4 kb、多达约5 kb、多达约6 kb、多
达约7 kb、多达约8kb、多达约9 kb、多达约10 kb、多达约11 kb、多达约12 kb、多达约13 kb、多达约14 kb或多达约15 kb的总长度。在一些实施方案中，构建体是质粒且可以具有约1 kb至约2 kb、约1 kb至约3 kb、约1 kb至约4 kb、约1 kb至约5 kb、约1 kb至约6 kb、约1 kb至约7 kb、约1 kb至约8 kb、约1 kb至约9 kb、约1 kb至约10 kb、约1 kb至约11 kb、约1 kb至约12 kb、约1 kb至约13 kb、约1 kb至约14 kb或约1 kb至约15 kb的范围内的总长度。
[0125]
在一些实施方案中，构建体是病毒构建体且可以具有多达10 kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，病毒构建体可以具有约1 kb至约2 kb、1 kb至约3 kb、约1 kb至约4 kb、约1 kb至约5 kb、约1 kb至约6 kb、约1 kb至约7 kb、约1 kb至约8 kb、约1 kb至约9 kb、约1 kb至约10 kb、约2 kb至约3 kb、约2 kb至约4 kb、约2 kb至约5 kb、约2 kb至约6 kb、约2 kb至约7 kb、约2 kb至约8 kb、约2 kb至约9 kb、约2 kb至约10 kb、约3 kb至约4 kb、约3 kb至约5 kb、约3 kb至约6 kb、约3 kb至约7 kb、约3 kb至约8 kb、约3 kb至约9 kb、约3 kb至约10 kb、约4 kb至约5 kb、约4 kb至约6 kb、约4 kb至约7 kb、约4 kb至约8 kb、约4 kb至约9 kb、约4 kb至约10 kb、约5 kb至约6 kb、约5 kb至约7 kb、约5 kb至约8 kb、约5 kb至约9 kb、约5 kb至约10 kb、约6 kb至约7 kb、约6 kb至约8 kb、约6 kb至约9 kb、约6 kb至约10 kb、约7 kb至约8 kb、约7 kb至约9 kb、约7 kb至约10 kb、约8 kb至约9 kb、约8 kb至约10 kb或约9 kb至约10 kb的范围内的核苷酸总数。
[0126]
在一些实施方案中，构建体是慢病毒构建体且可以具有多达8 kb的核苷酸总数。在一些实例中，慢病毒构建体可以具有约1 kb至约2 kb、约1 kb至约3 kb、约1 kb至约4 kb、约1 kb至约5 kb、约1 kb至约6 kb、约1 kb至约7 kb、约1 kb至约8 kb、约2 kb至约3 kb、约2 kb至约4 kb、约2 kb至约5 kb、约2 kb至约6 kb、约2 kb至约7 kb、约2 kb至约8 kb、约3 kb至约4 kb、约3 kb至约5 kb、约3 kb至约6 kb、约3 kb至约7 kb、约3 kb至约8 kb、约4 kb至约5 kb、约4 kb至约6 kb、约4 kb至约7 kb、约4 kb至约8 kb、约5 kb至约6 kb、约5 kb至约7 kb、约5 kb至约8 kb、约6 kb至约8kb、约6 kb至约7 kb或约7 kb至约8 kb的核苷酸总数。
[0127]
在一些实施方案中，构建体是腺病毒构建体且可以具有多达8 kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，腺病毒构建体可以具有约1 kb至约2 kb、约1 kb至约3 kb、约1 kb至约4 kb、约1 kb至约5 kb、约1 kb至约6 kb、约1 kb至约7 kb、约1 kb至约8 kb、约2 kb至约3 kb、约2 kb至约4 kb、约2 kb至约5 kb、约2 kb至约6 kb、约2 kb至约7 kb、约2 kb至约8 kb、约3 kb至约4 kb、约3 kb至约5 kb、约3 kb至约6 kb、约3 kb至约7 kb、约3 kb至约8 kb、约4 kb至约5 kb、约4 kb至约6 kb、约4 kb至约7 kb、约4 kb至约8 kb、约5 kb至约6 kb、约5 kb至约7 kb、约5 kb至约8 kb、约6 kb至约7 kb、约6 kb至约8 kb或约7 kb至约8 kb的范围内的核苷酸总数。
[0128]
用于治疗用途的aav先前的研究已将腺相关病毒(aav)鉴定为合适的载体，用于将治疗性寡核苷酸递送至有此需要的受试者。
[0129]
基因疗法正在迅速进化以用于治疗遗传病症，并且对于许多患者，这些疗法的成功是他们治愈的唯一希望(angeula & high 2019; 和carlton 2018)。在基因疗法期间，引起疾病的基因的健康拷贝经由病毒载体递送至患者(angeula & high, 2019; 和carlton, 2018)。许多监管机构(ema、fda等)要求监测脱落的病毒作为基因疗法临床试验的一部分
(fda，2015；ich，2009；gtwp、bwp和swp，2008；以及bubela等人，2019)。体液中的病毒的检测对于理解环境后果或潜在的长期影响可能至关重要，所述潜在的长期影响可能导致社会中针对腺相关病毒的中和抗体(nab)增加(bubela等人, 2019; 和rodrigues等人, 2018)。
[0130]
最常见的基因疗法载体之一是腺相关病毒(aav)。使用aav是因为它明显缺乏发病机制和复制能力(angeula & high 2019; 和carlton 2018)。经历重组aav (raav)基因疗法治疗的患者被注射高滴度的raav。经历这种治疗的患者通过称为脱落的过程清除过多的病毒。脱落是指基于载体的基因疗法产品从患者的排泄物(粪便)、分泌物(尿液、唾液和精液)或血液产品(全血、血浆或pbmc)排出或释放(fda，2015；ich，2009；gtwp、bwp和swp，2008；和bubela等人，2019)。即使aav不是致病性的，但脱落给遇到经历基因疗法治疗的患者的人带来可能的风险。暴露于病毒的风险可能导致社会中针对aav和基于raav的疗法的中和抗体增加(bubela等人，2019；和rodrigues等人，2018)。监测脱落患者样品中的病毒浓度对于理解可能的媒介传播模式是必要的，并且是多个监管机构的要求。
[0131]
对于开发脱落测定存在两个关键要求：该测定必须针对多种样品类型开发，并且必须是定量的(fda，2015)。本文描述了包含特异性引物的新型组合物，用于定量患者样品中的病毒dna(图1)。这些组合物适用于定量聚合酶链式反应(qpcr)以用于定量样品中的病毒dna(图1)。一个挑战是从各种复杂基质持续纯化病毒dna的能力。因此，需要可以从脱落的样品产生可重现、有效和可扩展的病毒dna提取和定量的材料和方法。
[0132]
本文描述了用于监测来自许多不同体液(包括精液、唾液、尿液、全血、pbmc、血浆和粪便)的病毒脱落dna的新组合物和方案。呈现的数据代表来自各种脱落隔间群组的优化定量方案，以建立一致和可重现的脱落测定。
[0133]
病毒脱落现有的dna定量和/或测序材料以及用于准确检测、鉴定和定量外来和/或治疗性寡核苷酸的方法经常被发现不足。具体而言，目前用于定量临床样品和/或从患者脱落的基因疗法构建体的材料和方法经常不能准确且可重现地将脱落构建体和/或基因组滴度定量至由适当的监管和/或咨询机构(例如，gtwp、bwp、swp和/或fda)描述的水平。
[0134]
在一些实施方案中，本文所述的材料和方法可以检测和定量发现为未结合和/或游离寡核苷酸的基因疗法构建体。在一些实施方案中，本文所述的材料和方法可以检测和定量与病毒颗粒相关的基因疗法构建体。如本文所述，存在许多合适的可以容纳基因疗法寡核苷酸的基因疗法载体(例如，病毒颗粒)，其容易使用本文所述的材料和方法进行定量。在某些实施方案中，检测和定量的基因疗法构建体是与重组腺相关病毒(raav)颗粒相关的寡核苷酸。
[0135]
先前的测定没有表明足够的性能，无法在临床实验室中被广泛接受，并且也没有提交用于监管批准。由于这些性能限制，大多数被用作研究测定或当地自制实验室开发的测试。先前的测定设计没有解决这些限制。
[0136]
相反，本公开导致独特高性能测定设计原型。性能最佳的设计符合用已知的全局序列变体成功扩增》95%的ivd商业化标准。该性能标准先前已被证明表明遗传变体间足够的灵敏度，以便在国际研究中对样品实施常规临床使用。
[0137]
从生物来源测量病毒相关的寡核苷酸构建体滴度在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于检测和定量由raav颗粒递送
的寡核苷酸构建体。在一些实施方案中，检测和定量是对从患者获得的样品进行的并且是病毒脱落的测量值。在一些实施方案中，从患者脱落的病毒相关寡核苷酸构建体可以针对特定基因疗法构建体，诸如但不限于用于治疗杜氏肌营养不良症和/或血友病b的构建体。
[0138]
扩增寡核苷酸序列和引物组在一些实施方案中，本文所述的组合物包含对于已知基因疗法构建体的扩增和随后定量合适和特异性的正向和反向寡核苷酸。在一些实施方案中，包含正向和反向扩增寡核苷酸的组合物可以额外包含适用于实时定量扩增子产物的序列特异性探针。在一些实施方案中，序列特异性探针可以是为使用taqman
tm
定量聚合酶链式反应(qpcr)方案进行扩增子定量而设计的探针。
[0139]
在一些实施方案中，定量探针和引物可以被设计为与对非天然存在的构建体特异性连接特异性的序列杂交。在一些实施方案中，连接可以跨越构建体至调节元件，(例如，跨越raav反向末端重复序列至启动子和/或3' utr区)。在一些实施方案中，连接可以跨越调节至调节元件，(例如，跨越启动子至增强子连接，和/或跨越3' utr至聚a信号序列)。在一些实施方案中，连接可以跨越调节至有效负载元件(例如，跨越启动子和/或3' utr区至基因疗法特异性有效负载序列，即肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白和/或因子ix)。在一些实施方案中，连接可以跨越构建体至有效载荷元件(例如，跨越raav反向末端重复序列至基因疗法特异性有效载荷序列)。
[0140]
在一些实施方案中，可以筛选引物和/或探针以确定适合于多重化的引物和/或探针的总合并物。在一些实施方案中，一种或多种引物和/或一种或多种探针可用于多重测定中。在某些实施方案中，针对串扰和/或不期望的寡核苷酸相互作用筛选引物和/或探针。在一些实施方案中，测试引物和/或探针以评估它们在额外暴露于背景基因组dna时的特异性。在一些实施方案中，进一步优化候选引物和/或探针以包括添加、截短和/或核苷酸修饰以增加测定性能。在某些实施方案中，以多种不同浓度(例如，100nm、200m、300nm、400nm和/或500nm)测试引物和/或探针以增加测定性能。在一些实施方案中，可以利用特异性引物和/或探针组合来增加测定性能。在一些实施方案中，本文所述的任何或所有因素可用于确定适当的引物和/或引物和探针组以准确扩增和/或定量aav构建体。
[0141]
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸的活性片段至多是特定引物和/或探针的长度减去一个核苷酸。在一些实施方案中，活性片段是最多29个核苷酸、最多28个核苷酸、最多27个核苷酸、最多26个核苷酸、最多25个核苷酸、最多24个核苷酸、最多23个核苷酸、最多22个核苷酸、最多21个核苷酸、最多20个核苷酸、最多19个核苷酸、最多18个核苷酸、最多17个核苷酸、最多16个核苷酸、最多15个核苷酸、最多14个核苷酸、最多13个核苷酸、最多12个核苷酸、最多11个核苷酸或最多10个核苷酸。
[0142]
在一些实施方案中，引物组合和/或引物和探针组合可以与额外的引物和/或引物和探针组多重化。在一些实施方案中，引物组合和/或引物和探针组合的灵敏度可以通过多重化而改变(例如，如果单一测定的ct比多重测定中出现得早得多，则多重测定可能具有抑制作用并且这可能改变总体灵敏度)。在一些实施方案中，引物组合和/或引物和探针组合的特异性可以通过多重化而改变(例如，如果在其中引物和/或引物和探针组合被给予多个靶dna群体作为一个模板的多重测定中，特定的引物组合和/或引物和探针组合在其靶dna群体不存在的情况下可能不会产生信号，如果存在信号，特异性可能低于额外dna群体不存
在的情况下)。
[0143]
用于dmd aav特异性定量的寡核苷酸序列以下引物序列各自以5'至3'顺序提供；本领域技术人员将认识到，在某些实施方案中，多核苷酸可以是rna分子或dna分子。在某些实施方案中，初始筛选包括对37种引物组合和9种不同探针的评估，最终产生40种不同的引物-探针组合。
seq id no:17
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dmd-探针-g.0
(seq id no:13)。在一些实施方案中，包含dmd-fwd-d (seq id no:7)和dmd-rev-c (seq id no:13)的引物组合与探针序列dmd-探针-c (seq id no:25)偶联。
[0154]
用于hem-b aav特异性定量的寡核苷酸序列以下引物序列各自以5'至3'顺序提供；本领域技术人员将认识到，在某些实施方案中，多核苷酸可以是rna分子或dna分子。在某些实施方案中，初始筛选包括对72种引物组合和5种不同探针的评估，最终产生47种不同的引物-探针组合。
seq id no:47
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seq id no:62
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hemb-探针-e.0seq id no:92
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hemb-探针-e.0.u。
[0155]
用于hem-b aav特异性定量的寡核苷酸组合在一些实施方案中，引物组合可用于准确和特异性hem-b aav定量。
[0156]
在一些实施方案中，引物的组合可以包含一种或多种正向引物。在一些实施方案中，引物的组合可以包含一种或多种反向引物。在一些实施方案中，一种或多种正向引物可以包含seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84或其组合，或由其组成。
sons: secaucus, nj)。
[0166]
在一些实施方案中，寡核苷酸可以通过本领域众所周知的化学技术制备，包括例如基于模板的化学合成和聚合，如例如narang等人, meth. enzymol. 68:90-98 (1979); brown等人, meth. enzymol. 68: 109-151 (1979); belousov等人, nucleic acids res. 25:3440-3444 (1997); guschin等人, anal. biochem. 250:203-211 (1997); blommers等人, biochemistry 33:7886-7896 (1994); frenkel等人, free radic. biol. med. 19:373-380 (1995); 和美国专利号4,458,066中所述。
[0167]
在一些实施方案中，寡核苷酸可以使用基于亚磷酰胺方法的自动化固相程序来制备。在此类方法中，每个核苷酸被单独添加至正在生长的寡核苷酸链的5'-末端，其在3'-末端附接至固体支持物。添加的核苷酸呈三价3'-亚磷酰胺的形式，其在5'-位处被二甲氧基三基(或dmt)基团保护免于聚合。在碱基诱导的亚磷酰胺偶联后，温和的氧化以得到五价磷酸三酯中间体和dmt除去为寡核苷酸延伸提供新位点。然后将寡核苷酸从固体支持物切下，并且磷酸二酯和环外氨基用氢氧化铵脱保护。这些合成可以在寡核苷酸合成仪(诸如从perkin elmer/applied biosystems, inc. (foster city, ca)、dupont (wilmington, de)或milligen (bedford, ma)商购的那些)上进行。或者，寡核苷酸可以从本领域众所周知的各种商业来源定制和订购，包括例如midland certified reagent company (midland, tx)、expressgen, inc. (chicago, il)、operon technologies, inc. (huntsville, al)和许多其他。
[0168]
在必要或期望的情况下，寡核苷酸的纯化可以通过本领域众所周知的各种方法中的任一种来实施。例如，寡核苷酸的纯化通常通过天然丙烯酰胺凝胶电泳、通过阴离子交换hplc (例如参见pearson和regnier, j. chrom. 255:137-149 (1983))或通过反相hplc (例如参见mcfarland和borer, nucleic acids res. 7:1067-1080 (1979))实施。
[0169]
寡核苷酸的序列可以使用任何合适的测序方法验证，包括但不限于化学降解(例如参见maxam和gilbert, methods of enzymology, 65:499-560 (1980))、基质辅助的激光吸附电离飞行时间(maldi-tof)质谱法(例如参见pieles等人, nucleic acids res. 21:3191-3196 (1993))、碱性磷酸酶和核酸外切酶消化的组合后的质谱法(例如参见wu和aboleneen, anal. biochem. 290:347-352 (2001))。
[0170]
本公开涵盖这些寡核苷酸的修饰形式，其根据本公开的方法作为这些寡核苷酸的等效物进行。可以使用本领域已知的几种方法中的任一种来制备这些修饰的寡核苷酸。此类修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸以及核苷酸间修饰，诸如例如具有不带电荷的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些。修饰的寡核苷酸也可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯键来衍生。此外，本公开的寡核苷酸也可以用标记物修饰。
[0171]
寡核苷酸的标记在一些实施方案中，所述引物在用于扩增/检测测定中之前用可检测试剂或部分标记。可检测试剂的作用是允许扩增的序列的可视化和检测。优选地，选择可检测试剂，使得其生成信号，所述信号可测量并且其强度与所分析样品中的扩增产物的量相关(例如，成比例)。
[0172]
寡核苷酸和可检测试剂之间的缔合可以是共价的或非共价的。可通过并入可检测部分或缀合至可检测部分来制备标记的检测引物。标记物可以直接或间接(例如，通过接头)附接至核酸序列。各种长度的接头或间隔臂是本领域已知的并且是可商购的，并且可以被选择以减少空间位阻，或赋予所得标记分子的其他有用或期望的特性，例如参见mansfield等人, mol. cell probes 9:145-156 (1995)。
[0173]
用于标记核酸分子的各种方法是本领域已知的。对于标记方案、标记检测技术和本领域中的最新发展的综述，参见例如，kricka, ann. clin. biochem. 39:114-129 (2002); van gijlswijk等人, expert rev. mol. diagn. 1:81-91 (2001); 和joos等人, j. biotechnol. 35:135-153 (1994)。标准核酸标记方法包括：放射性试剂的掺入、荧光染料(smith等人, nucl. acids res. 13:2399-2412 (1985))或酶(connoly和rider, nucl. acids. res. 13:4485-4502 (1985))的直接附接；核酸分子的化学修饰(使其通过免疫化学或其他亲和反应可检测)(例如参见broker等人, nucl. acids res. 5:363-384 (1978); bayer等人, methods of biochem. analysis 26:1-45 (1980); langer等人, proc. natl. acad. sci. usa 78:6633-6637 (1981); richardson等人, nucl. acids res. 11:6167-6184 (1983); brigati等人, virol. 126:32-50 (1983); tchen等人, proc. natl. acad. sci. usa 81:3466-3470 (1984); landegent等人, exp. cell res. 15:61-72 (1984); 和hopman等人, exp. cell res. 169:357-368 (1987))；和酶介导的标记方法，诸如随机引发、切口平移、pcr和用末端转移酶加尾。对于酶促标记的综述，参见例如temsamani和agrawal, mol. biotechnol. 5:223-232 (1996)。最近开发的核酸标记系统包括但不限于：uls(通用连接系统)，其基于单反应性顺铂衍生物与dna中鸟嘌呤部分的n7位的反应(heetebrij等人, cytogenet. cell. genet. 87:47-52 (1999))，补骨脂素-生物素，其嵌入核酸中并在紫外线照射后变得与核苷酸碱基(levenson等人, methods enzymol. 184:577-583 (1990); 和pfannschmidt等人, nucleic acids res. 24:1702-1709 (1996))、光反应性叠氮衍生物(neves等人, bioconjugate chem. 11:51-55 (2000))和dna烷化剂(sebestyen等人, nat. biotechnol. 16: 568-576 (1998))共价键合。
[0174]
应理解，可以在本公开的实践中使用各种各样可检测试剂中的任一种。合适的可检测试剂包括但不限于各种配体、放射性核素(诸如例如，
32
p、
35
s、3h、
14
c、
125
i、
131
i等)；荧光染料(诸如例如fam、yakima yellow
®
、sun
™
、hex、cy
®ꢀ
3、texas red
®‑
x和/或cy
®ꢀ
5)；荧光染料猝灭剂(诸如例如，zen、iowa black
™ꢀ
fq、iowa black rq和/或tao)、化学发光剂(诸如例如，吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)；光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜和铂)或纳米簇；酶(诸如例如，用于elisa的那些，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；比色标记物(诸如例如，染料、胶体金等)；磁性标记物(例如dynabeads
tm
)；和其抗血清或单克隆抗体可用的生物素、异羟基洋地黄毒苷(dioxigenin)或其他半抗原和蛋白。
[0175]
也可以添加正常或修饰的核苷酸的“尾部”来标记寡核苷酸，用于可检测性目的。在一些实施方案中，可以添加m13标签序列。
[0176]
从生物样品提取和制备病毒寡核苷酸在一些实施方案中，本公开的材料和方法可以包括从生物样品提取和制备的寡核
苷酸。在一些实施方案中，用于提取寡核苷酸的合适生物样品包括但不限于：尿液、精液、血浆、粪便、全血和/或唾液。从生物样品提取和制备寡核苷酸通过本领域通常已知的方法(例如，versant
®ꢀ
kpcr样品制备1.0和/或1.2)进行。
[0177]
扩增方法和反应在一些实施方案中，本公开提供了使用上述寡核苷酸作为扩增引物来扩增特定aav构建体的区域、特别是在天然aav中没有发现并且对某些治疗性aav特异性的区域的方法。如下文更详细讨论，在一些实施方案中，所述引物用于定量pcr方法中以用于扩增和检测特定aav构建体。
[0178]
本公开的寡核苷酸序列作为引物在测试样品中扩增aav靶序列的用途不限于任何特定核酸扩增技术或其任何特定修饰。事实上，本发明的寡核苷酸序列可用于本领域众所周知的各种核酸扩增方法中的任一种中(参见例如kimmel和berger, methods enzymol. 152: 307-316 (1987); sambrook等人,
ꢀ“
molecular cloning: a laboratory manual”, 1989, 第2版, cold spring harbour laboratory press: new york, ny;
ꢀ“
short protocols in molecular biology”, ausubel (ed.), 2002, 第5版, john wiley & sons: secaucus, nj)。
[0179]
此类核酸扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(或pcr，描述于例如“pcr protocols: a guide to methods and applications”, innis (编), 1990, academic press: new york;
ꢀ“
pcr strategies”, innis (编), 1995, academic press: new york;
ꢀ“
polymerase chain reaction: basic principles and automation in pcr: a practical approach”, mcpherson等人(编), 1991, irl press: oxford; saiki等人, nature 324:163 (1986); 和美国专利号4,683,195、4,683,202和4,889,818 (其各自都通过引用以其整体并入本文))；和逆转录酶聚合酶链式反应(或rt-pcr，描述于例如美国专利号5,322,770和5,310,652)。
[0180]
pcr(或聚合酶链式反应)技术是本领域众所周知的并且已经公开于例如mullis和faloona, methods enzymol., 155:350-355 (1987)。以其最简单的形式，pcr是一种用于使用两个引物酶促合成特定dna序列的体外方法，所述引物与相反链杂交并侧接靶dna中的目标区域。多个反应循环(每个循环包括：变性步骤、退火步骤和聚合步骤)导致特定dna片段的指数积累，参见例如，“pcr protocols: a guide to methods and applications”, innis (编), 1990, academic press: new york;
ꢀ“
pcr strategies”, innis (编), 1995, academic press: new york;
ꢀ“
polymerase chain reaction: basic principles and automation in pcr: a practical approach”, mcpherson等人(编), 1991, irl press: oxford; saiki等人, nature 324:163-166 (1986)。扩增片段的末端被定义为引物的5'末端。能够在pcr反应中产生扩增产物的dna聚合酶的实例包括但不限于：大肠杆菌dna聚合酶i、dna聚合酶i的klenow片段、t4 dna聚合酶、从水生栖热菌(taq)分离的热稳定dna聚合酶(其可以得自各种来源(例如perkin elmer))、嗜热栖热菌(united states biochemicals)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bio-rad)或海滨嗜热球菌(“vent”聚合酶, new england biolabs)。rna靶序列可以通过将mrna逆转录成cdna且然后进行pcr (rt-pcr)来扩增，如上所述。或者，可以将单一酶用于两个步骤，如美国专利号5,322,770中所述。
[0181]
pcr循环的每个步骤的持续时间和温度以及循环数，通常根据有效的严格性要求
进行调整。退火温度和时机均通过预期引物与模板退火的效率和待耐受的错配程度来确定。优化反应循环条件的能力完全在本领域普通技术人员的知识范围内。尽管反应循环数可能根据所进行的检测分析而不同，但其通常为至少15，更通常至少20，并且可能高达60或更高。然而，在许多情况下，反应循环数通常范围为约20至约40。
[0182]
pcr循环的变性步骤通常包括将反应混合物加热至升高的温度，并将混合物在升高的温度下维持足以使反应混合物中存在的任何双链或杂交核酸解离的时间段。对于变性，反应混合物的温度通常升高至并维持在范围为约85℃至约100℃、通常约90℃至约98℃且更通常约90℃至约94℃的温度的范围为约3至约120秒、通常约5至约30秒的时间段。在一些实施方案中，第一循环之前是延长的变性步骤，其范围为约1至10分钟，通常为约2至5分钟。
[0183]
在变性后，使反应混合物经受足以使引物与混合物中存在的模板dna退火的条件。通常选择为了达到这些条件而降低反应混合物的温度以提供最佳的效率和特异性，并且通常范围为约45℃至约75℃、通常约50℃至约70℃且更通常约53℃至约55℃。退火条件通常维持范围为约15秒至约30分钟、通常为约30秒至约1分钟的时间段。
[0184]
在引物与模板dna退火后或在引物与模板dna退火期间，使反应混合物经受足以提供使用与其杂交的dna作为模板使核苷酸以使得引物在5'至3'方向延伸的方式聚合至引物的末端的条件(即，足以酶促产生引物延伸产物的条件)。为了达到引物延伸条件，通常将反应混合物的温度升高至范围为约65℃至约75℃、通常约67℃至约73℃的温度，并在该温度下维持范围为约15秒至约20分钟、通常约30秒至约5分钟的时间段。在一些实施方案中，最终延伸步骤之后是延长的延伸步骤，范围为约1至10分钟、通常约2至5分钟。
[0185]
可以使用通常称为热-循环仪或热循环仪的自动化装置进行上述变性、退火和聚合的循环。可以利用的热循环仪描述于美国专利号5,612,473；5,602,756；5,538,871；和5,475,610。热循环仪可商购自例如perkin elmer-applied biosystems (norwalk, ct)、biorad (hercules, ca)、roche applied science (indianapolis, in)和stratagene (la jolla, ca)。
[0186]
在一些实施方案中，pcr反应中的一种或多种是“动力学pcr”(kpcr)或“动力学rt-pcr”(krt-pcr)，其也分别称为“实时pcr”和“实时rt-pcr”。这些方法涉及经由探针检测pcr产物，所述探针提供与样品中扩增产物的量相关的信号(通常是荧光信号)。kpcr和krt-pcr中通常使用的探针的实例包括以下探针：taqman
®
探针、molecular beacon探针、scorpion
®
探针和sybr
®ꢀ
green探针。简而言之，taqman
®
探针、molecular beacon和scorpion
®
探针各自具有附接至探针的5'末端的荧光报告染料(也称为“荧光剂”)和偶联至探针的3'末端的猝灭剂部分。在未杂交状态下，荧光和猝灭分子的接近阻止来自探针的荧光信号的检测。在pcr期间，当聚合酶复制其上结合探针的模板时，聚合酶的5'-核酸酶活性切割探针，因此随着每个复制循环增加荧光。sybr
®ꢀ
green探针结合双链dna，并在激发后发光；因此随着pcr产物积累，荧光增加。
[0187]
在一些实施方案中，pcr反应用于“单重”pcr测定中。“单重”是指不与任何其他测定同时进行的单一测定。单重测定包括按依次实施的单个测定。
[0188]
在一些实施方案中，pcr反应用于“多重”pcr测定中。术语“多重”是指同时实施的多个测定，其中检测和分析步骤通常并行进行。在本公开的上下文中，多重测定将包括使用
单独或与鉴定例如内部对照或hcv病毒变体以及一种或多种额外的hcv变体或其他病毒的额外引物组合的引物。
[0189]
在一些实施方案中，第一扩增步骤扩增靶基因的区域。在一些实施方案中，扩增产物为小于约1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、250、225、200、175、150、125、100或75个核苷酸长。
[0190]
扩增产物的检测可以使用本领域已知的各种方法检测使用本公开的寡核苷酸和方法产生的扩增产物。
[0191]
在一些实施方案中，扩增产物可以简单地使用琼脂糖凝胶电泳和通过溴化乙锭染色和暴露于紫外(uv)光的可视化来检测。
[0192]
在一些实施方案中，特定基因型的存在可以通过限制酶分析显示。例如，特定的核苷酸多态性可以导致包含限制性位点的核苷酸序列，所述限制性位点在另一个等位基因变体的核苷酸序列中不存在。另外或替代地，特定的核苷酸多态性可以导致包含限制性位点的核苷酸序列的消除，所述限制性位点在另一个等位变体的核苷酸序列中不存在。
[0193]
用于检测两种核酸之间至少一个核苷酸的差异的技术的实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸探针，其中将已知的多态性核苷酸置于中心，且然后在仅当发现完美匹配时才允许杂交的条件下与靶dna杂交，例如参见saiki等人, nature 324:163 (1986); saiki等人, proc. natl acad. sci usa 86:6230 (1989); 和wallace等人, nucl. acids res. 6:3543 (1979)。此类特异性寡核苷酸杂交技术可用于同时检测dna的不同多态性区域中的几个核苷酸变化。例如，具有特定等位基因变体的核苷酸序列的寡核苷酸附接至杂交膜，且然后该膜与标记的样品核酸杂交。然后对杂交信号的分析将揭示样品核酸的核苷酸的身份。或者，未标记的样品核酸可以固定并与标记的寡核苷酸接触，所述标记的寡核苷酸与特定的等位基因变体选择性杂交。
[0194]
实时焦磷酸dna测序是检测多态性和多态性变体的又另一种方法，例如，参见alderborn等人, genome research, 10(8):1249-1258 (2000)。额外的方法包括，例如，pcr扩增与变性高效液相色谱法(dhplc)的组合，例如参见underhill等人, genome research, 7(10):996-1005 (1997)。
[0195]
在一些实施方案中，本领域已知的各种测序反应中的任一种可用于直接对扩增的dna的至少一部分进行测序并检测等位基因变体。可以将所述序列与已知等位基因变体的序列进行比较，以确定样品中存在哪些等位基因变体。示例性测序反应包括基于maxam和gilbert, proc. natl. acad. sci usa, 74:560 (1977)或sanger, proc. nat. acad. sci 74:5463 (1977)开发的技术的那些。还考虑在进行主题测定时可以利用各种自动测序程序中的任何一种，例如参见venter等人, science, 291:1304-1351 (2001); lander等人, nature, 409:860-921 (2001)，包括通过质谱测序，例如参见美国专利号5,547,835和pct专利公开号wo 94/16101和wo 94/21822；美国专利号5,605,798和pct专利申请号pct/us96/03651；cohen等人, adv. chromatogr. 36:127-162 (1996); 和griffin等人, appl. biochem. biotechnol. 38:147-159 (1993)。对于本领域技术人员来说显而易见的是，对于一些实施方案，在测序反应中需要确定所述核酸碱基中的仅一个、两个或三个的出
现。还有其他测序方法公开于例如在美国专利号5,580,732；5,571,676；4,863,849；5,302,509；pct专利申请号wo 91/06678和wo 93/21340; canard等人, gene 148:1-6 (1994); metzker等人, nucleic acids research 22:4259-4267 (1994) 和美国专利号5,740,341和6,306,597。
[0196]
在一些实施方案中，使用实时pcr进行扩增子的检测。已经开发了实时pcr以定量pcr反应期间的扩增产物。实时pcr基于这样的原理：可以检测来自直接或间接与新合成的扩增子形成或引物与dna模板退火相关的染料的荧光发射，并且与每个pcr循环中的扩增子的量成正比。实时pcr以闭管形式实施并且是定量的。几种方法目前可用于进行实时pcr，诸如利用taqman探针(美国专利号5,210,015和5,487,972，以及lee等人, nucleic acids res. 21:3761-6, 1993)、分子信标(us专利号5,925,517和6,103,476，以及tyagi和kramer, nat. biotechnol. 14:303-8, 1996)、自探测扩增子(scorpions)(美国专利号6,326,145和whitcombe等人, nat. biotechnol. 17:804-7, 1999)、amplisensor (chen等人, appl. environ. microbiol. 64:4210-6, 1998)、amplifluor (美国专利号117,635, 和nazarenko等人, nucleic acids res. 25:2516-21, 1997)、置换杂交探针(li等人, nucleic acids res. 30:e5, 2002)、dzyna-pcr (todd等人, clin. chem. 46:625-30, 2000)、荧光限制性酶检测(cairns等人 biochem. biophys. res. commun. 318:684-90, 2004)和相邻杂交探针(美国专利号6,174,670和wittwer等人, biotechniques 22:130-1, 134-8, 1997)。这些探针中的大多数由一对染料(报告染料和受体染料)组成，所述染料参与荧光共振能量转移(fret)，其中受体染料猝灭报告染料的发射。通常，荧光标记的探针增加扩增子定量的特异性。
[0197]
在一些实施方案中，使用与taqman测定联用的实时pcr进行扩增子的检测。美国专利号5,210,015和5,487,972描述了5'核酸酶测定法，也称为taqman测定法。taqman测定法利用taq dna聚合酶的5'核酸酶活性在pcr期间切割taqman探针。taqman探针含有在探针的5'末端的报告染料和在探针的3'末端的猝灭染料。在反应期间，探针的切割将报告染料和猝灭染料分开，导致报告的荧光增加。通过监测报告染料的荧光的增加直接检测pcr产物的积累。当探针完整时，报告染料与猝灭染料的紧密接近导致主要通过f
ö
rster型能量转移的报告荧光的抑制(f
ö
rster, 1948; lakowicz, 1983)。在pcr期间，如果存在目标靶标，则探针在正向和反向引物位点之间特异性退火。只有当探针与靶标杂交时，taqdna聚合酶的5'至3'核酸水解活性才在报告子和猝灭剂之间切割探针。然后探针片段从靶标移开，并且链的聚合继续。探针的3'末端被阻断以防止探针在pcr期间延伸。该过程发生在每个周期中，并且不干扰产品的指数累积。
[0198]
组合物和试剂盒在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含可用于根据本文描述的方法扩增和检测或测序特定aav构建体的材料。本发明的试剂盒可以被诊断实验室、实验实验室或从业者使用。
[0199]
可用于根据本公开的特定aav构建体的检测或测序的材料和试剂可以在试剂盒中组装在一起。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含至少一种本发明的引物组，以及任选地逆转录和/或扩增反应试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含使程序特异性的试剂。因此，旨在用于检测具体特定aav构建体变体的试剂盒优选包含本文所述的引物组，其可用于扩
增具体特定的目标aav构建体靶序列。旨在用于多重检测多种特定aav构建体靶序列和/或其他病毒的试剂盒优选包含本文所述的多个引物组(任选地在单独的容器中)，其可用于扩增本文所述的特定aav构建体靶序列。
[0200]
可以包括在本发明的试剂盒中的合适的逆转录/扩增反应试剂包括，例如，以下中的一种或多种：缓冲液；具有逆转录酶和/或聚合酶活性的酶；酶辅助因子，诸如镁或锰；盐；烟酰胺腺苷双核酸酶(nad)；和脱氧核苷三磷酸(dntp)，诸如例如脱氧腺苷三磷酸；脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸、生物素化的dntp，其适合于实施扩增反应。
[0201]
取决于程序，所述试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂以及检测手段。试剂盒中包括的缓冲液和/或试剂优选针对试剂盒所预期的特定扩增/检测技术进行优化。用于使用这些缓冲液和试剂来进行程序的不同步骤的方案也可以包括在试剂盒中。
[0202]
此外，所述试剂盒可以提供有内部对照，以检查扩增程序并防止由于扩增程序失败而出现假阴性测试结果。以使得其不与扩增反应中的靶核酸序列竞争的方式选择最佳对照序列(如上所述)。
[0203]
试剂盒还可以含有用于在扩增之前从生物样本分离核酸和/或用于在核酸提取之前纯化或分离aav颗粒的试剂。
[0204]
所述试剂可以固体(例如，冻干的)或液体形式提供。本公开的试剂盒任选地包括用于每种单独的缓冲液和/或试剂的不同容器(例如，小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)。每种组分通常适合在其各自的容器中等分或以浓缩形式提供。也可以提供适合于进行扩增/检测测定的某些步骤的其他容器。试剂盒的各个容器优选地保持在密闭空间中用于商业销售。
[0205]
所述试剂盒还可以包含用于使用根据本公开的扩增反应试剂和引物组或引物/探针组的说明书。根据本公开的一种或多种方法使用试剂盒的说明书可以包含用于处理生物样品、提取核酸分子和/或进行测试的说明书；用于解释结果的说明书以及由监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构(例如，fda)规定的形式的通知。
[0206]
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本公开。提供这些实施例仅用于举例说明的目的，并且不旨在限制，除非另有指明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
[0207]
例如，也可以根据本公开使用其他测定，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些。
[0208]
实施例用于直接实施例的试剂、设备、方法和消耗品-试剂
设备和消耗品
描述供应商部件号单通道可调节的移液器(l10、l20、l200和l1000)mlsn/a冰箱(
−
10
°
c至-30
°
c)mlsna漂白剂，无香味(0.5%次氯酸钠)mlsna培养箱mlsnalts20
µ
l滤芯吸头rainin17014961lts200
µ
l滤芯吸头rainin17014963lts1000
µ
l滤芯吸头rainin17014967具有包封的中性帽的3.5mlsarstedt管vwr101093-666微量离心管(0.5、1.5或2.0ml)mlsna琥珀色微量离心管(2.0ml)mlsnamicroamp
®
optical96-孔快速反应板，0.1ml,applied4346907microamp
®
光学胶粘膜，各100applied4311971专用的单通道可调节的移液器(p2、p10、p20、p200和p1000)mlsna多通道移液器(p10、p20)mlsna个人保护设备(ppe)mlsna具有紫外光的静气罩mlsna微型离心机mlsna旋涡混合器mlsnaallegra25r离心机,60hz,208vbeckmancoulter 具有96-孔fastblock的quantstudio
™
7flex实时或dxpcr系统thermofisher 用于具有微板载体的96-孔板的s5700swingingbucketrotorbeckmancoulter369434,368954冰箱(2
°
c至8
°
c)mlsnasub-freezer(
−
60
°
c至
−
90oc)mlsnaversant
®
kpcr分子系统样品制备模块(sp模块)shdina生物安全柜mlsnasp1.0试剂槽(200ml&50ml)shdismn104890081000
‑µ
l移液器吸头shdismn10282929300
‑µ
l移液器吸头shdismn10282930
96-孔，2-ml无核酸酶，无菌深孔板shdismn10283255条形码化的96-孔半有缘的聚丙烯板，用于shdismn10282998kpcrpcr适配板shdi96067-01蓝色吸收垫(工作台保护垫)mlsna70%乙醇mlsna漂白剂，无味mlsnamicrocidesqshdismn10361387去离子水内部的 hamilton吸头处置袋(200ea.)shdismn10282938
[0209]
实施例1：一般方法本实施例提供了在样品制备和定量期间利用的许多可概括的测定和/或处理的概述。
[0210]
mnase处理
ꢀ‑ꢀ
mnase处理程序在样品提取之前进行，并符合制造商推荐。
[0211]
通过qpcr对aav脱落测定的定量
ꢀ‑ꢀ
使用5μl dna提取物在qpcr反应中测试提取的dna。样品中aav病毒dna的浓度通过将它们的ct值针对从已知浓度的缓冲液中提取的aav病毒校准物获得的ct值作图来确定。quantstudio
™ꢀ
7 flex或dx实时pcr系统用于qpcr分析。血浆、尿液、精液和唾液样品中aav病毒dna的浓度报告为病毒基因组数(vg)/ml，并且pbmc样品中aav病毒dna的浓度报告为病毒基因组数(vg)/1
ꢀµ
g基因组dna。
[0212]
用于aav脱落测定的样品制备
ꢀ‑ꢀ
根据versant
®ꢀ
kpcr分子系统-独立样品制备模块(sasp)，利用病毒dna提取和纯化过程制备样品。根据制造商指示，分离和纯化病毒dna样品以用于扩增程序中。
[0213]
实施例2：鉴定和优化用于杜氏肌营养不良aav基因疗法脱落定量的引物。
[0214]
本实施例表明利用本文所述的寡核苷酸序列进行的测定的效用、准确度、灵敏度和精确度。这种脱落测定检测和定量从尿液、全血、粪便和唾液提取的示例性病毒dna(例如，示例性dmd aav构建体)。示例性dmd aav构建体是编码微型肌营养不良蛋白的腺相关病毒。
[0215]
使用5
µ
l dna提取物在qpcr反应中测试提取的dna。通过将缓冲液中提取的示例性dmd aav构建体病毒校准物的ct值针对其已知浓度(对数转换的，参见图2)作图，生成线性回归曲线。通过在该模型中拟合它们的ct值来测定样品中示例性dmd aav构建体病毒dna的浓度。尿液、全血和唾液样品中示例性dmd aav构建体病毒dna的浓度报告为病毒基因组数(vg)/ml，且粪便样品示例性dmd aav构建体病毒dna的浓度报告为vg/mg。
[0216]
目前的fda指南要求qpcr能够以95%置信度检测《50个拷贝载体/1μg基因组dna。使用一组线性化质粒确定qpcr定量限值，所述线性化质粒包含掺入人基因组dna中的示例性dmd aav构建体病毒基因组。为25个拷贝载体/1μg基因组dna选择n=444，以确保可以实现具有足够置信度的95%检测率(如下概述)。
[0217]
示例性引物和/或探针的初始筛选设计靶向示例性dmd aav构建体的选定区域的引物(参见图1)。在完成寡核苷酸表征之前，筛选至少一种或多种正向引物、至少一种或多种反向引物以及至少一种或多种探针的特征，诸如多重容量、最大荧光、斜率、最小ct、tm、寡核苷酸交叉反应性和/或在背景基因组dna存在的情况下对dmd aav构建体的特异性。
[0218]
确定某些引物和探针组合在测试的测定条件下工作良好。如附图所示以及本文进
一步所示，某些引物和探针组合提供了期望的概况。然而，可以如所示筛选替代的引物和/或探针组合以确定用于其他条件、样品等的期望概况，并且本公开认识到多种引物和/或探针组合可能适用于准确和可靠的检测和/或定量。数据还证实，所选引物和探针组合在(例如，与内部对照引物和探针组合)多重化时工作良好。在一些实施方案中，本领域技术人员将理解某些特征可能或多或少是期望的，并且对于特定应用的一组引物和探针的选择可能取决于权衡某些特征，诸如多重化能力、最大荧光、斜率、最小ct、tm、寡核苷酸交叉反应性、在背景基因组dna存在的情况下对dmd aav构建体的特异性或所有或这些因素中的全部或任意的任何组合。尽管如此，本文提供的数据确立了，所公开的引物和/或探针对于检测生物样品中的aav构建体工作良好。发现至少一种或多种正向引物、至少一种或多种反向引物和至少一种或多种探针适用于一种或多种初始筛选标准(参见例如表1、表2和图17-19)。
[0219]
表1
ꢀ‑ꢀ
靶向替代示例性dmd aav构建体区域的某些寡核苷酸组合的初始筛选
[0220]
表1 (续)
测定62500个拷贝15625个拷贝3906.25个拷贝976.56个拷贝斜率扩增效率119.5021.4823.4825.77-3.4594.8219.6221.5523.7725.73-3.4196.3319.3121.3823.3525.32-3.3299.9419.3621.3823.4125.57-3.4395.7516.9719.2721.1023.51-3.5690.90
[0221]
表2
ꢀ–ꢀ
用于示例性dmd aav构建体的某些多重测定的初始筛选
测定dna来源fwd-prev-p检测扩增子大小[bp]1示例性dmdaav构建体dmd-fwd-f(seqidno:65)dmd-rev-g(seqidno:71)dmd-探针-g(seqidno:77)702icic-fic-ric-p-[0222]
表2 (续) 测定62500个拷贝15625个拷贝3906.25个拷贝976.56个拷贝488.28个拷贝斜率扩增效率118.7220.8523.4725.0127.02-3.5790.66217.5619.4821.8423.8825.37-3.5491.72
[0223]
数据计算和报告观察的数据用如下的非线性回归模型拟合：精确度=β
0 β1×e(β2
×
log10(观察浓度)) ε其中β0、β1和β2是模型的系数，并且ε是随机误差项。jmp (14.1版，sas institute)
用于用指数3p拟合曲线模型进行计算。
[0224]
使用精确度曲线方法的定量下限(lloq)被计算为在20% cv处拟合曲线的95%置信上限处的浓度。
[0225]
基于≥95%检测、≤20%变异性和与目标值差异在0.125log内的标准，qpcr的定量下限(lloq)被确定为50个病毒基因组拷贝/1
µ
g基因组dna，超过fda指南要求。
[0226]
脱落测定检测范围概述如下。如果滴度被检测为高于定量上限，则将样品报告为alq(高于定量限值)；如果滴度被确定为低于定量下限，则将样品报告为blq(低于定量限值)；并且如果滴度在定量范围内，则报告数字浓度。
[0227]
使用quantstudio
™ꢀ
7 flex和quantstudio
™
软件v1.1确定示例性dmd aav构建体全血、唾液、粪便和尿液的原始信号。使用线性回归曲线计算示例性dmd aav构建体的浓度，所述线性回归曲线通过将缓冲液中的提取的示例性dmd aav构建体病毒校准物的ct值针对其已知浓度(对数转换)作图而生成。通过在该模型中拟合ct值来确定样品中示例性dmd aav构建体病毒dna的浓度。这在microsoft excel、microsoft office 363 pro版本1909中完成。对于表格，最终浓度以病毒基因组(vg)/ml报告，除了粪便，其以vg/mg报告，至少为三个有效数字。精确度(%cv)被报告为最接近的0.1%。
[0228]
统计分析准确度
ꢀ‑ꢀ
滴度数据被认为是对数正态分布的，并在log10转换后进行分析。示例性dmd aav构建体脱落测定准确度使用下面分析灵敏度部分中描述的相同组确定。通过对数转换后的观察值和预期值的差值来计算准确度，并且目标要求在定量范围内的预期值的
±
0.5对数偏差内。下面概述每种样品类型的示例性dmd aav构建体脱落测定线性和准确度。
[0229]
线性
ꢀ‑ꢀ
通过如下拟合线性回归模型来评价测定线性log10(定量) = β0 β1
×
log10(输入物浓度) ε其中β0是截距，β1是斜率，且ε是随机误差项。基于该模型计算决定系数r2。如果r2高于0.95，则建立线性。使用r(版本3.5.1 2018-07-02，https://cran.rproject.org/)进行准确度和线性分析。
[0230]
精确度
ꢀ–ꢀ
对于每个浓度水平，使用以下的方差分量模型估计实验室内测定的重现性或精确度，定量=截距 仪器 运行 运行内(误差)其中仪器、运行和运行内误差被视为随机效应。经由随机效应模型估计方差分量。考虑所有仪器间、运行间和运行内效应的总方差δ2被估计为各个方差分量的总和。再现性的量度是变异的百分比系数(%cv)，或总方差除以平均值。方差分量在jmp(版本13.1，sas institute)中使用reml(限制最大似然)模型(https://www.jmp.com/support/help/14-2/restricted-maximumlikelihood-reml-model.shtml)进行分析。
[0231]
特异性
ꢀ‑ꢀ
测定特异性被计算为鉴定的阴性样品与所有未掺入(真阴性)样品的比率。示例性dmd aav构建体脱落的测定特异性用20-24个生物学重复(对于唾液、粪便和尿液为20个，且对于全血为24个)，使用没有任何病毒掺入的正常人唾液、粪便、尿液和全血样品确定。在测试的所有样品类型中，特异性均高于95%。
[0232]
分析灵敏度
ꢀ‑ꢀ
为了测量分析灵敏度，观察的数据用如下非线性回归模型进行拟
合：精确度=β0 β1×
e^((β2×
log10(观察浓度))) ε其中β0、β1和β2是模型的系数，且ε是随机误差项。jmp(版本14.1，sas institute)用于用指数3p拟合曲线模型进行计算。
[0233]
使用精确度曲线法的定量下限(lloq)被计算为在30% cv下拟合曲线的95%置信上限的浓度。
[0234]
分析灵敏度以两步法确定。在步骤1中，对于唾液、粪便和尿液，在两个不同的versant kpcr提取系统上测试多达12-重复组，以估计定量下限(lloq)，对于血液，仅使用一个versant kpcr提取系统来各自测试至少6次重复。在步骤2中，利用接近估计lloq水平的多达36个生物学重复来进一步细化所有样品类型的lloq。在30% cv和
±
0.5log偏差内的拟合曲线的95%置信上限处的浓度被确定为该样品类型的lloq。下面概述了每种样品类型的示例性dmd aav构建体脱落测定分析灵敏度。
[0235]
结果：脱落测定性能概述
ꢀ‑ꢀ
脱落测定提供了唾液、粪便、尿液和全血样品在相应测定范围内的定量结果。脱落测定检测范围概述于表3中。如果滴度被监测为高于定量上限，则样品报告为aql(高于定量限值)；如果滴度被确定为低于定量下限，则将样品报告为bql(低于定量限值)；且如果滴度在定量范围内，则报告数字浓度。
[0236]
表3：性能评估概述基质定量下限(lloq)定量上限(uloq)唾液3.67e 03vg/ml9.84e 08vg/ml粪便3.90e 01vg/mg1.28e 07vg/mg尿液4.26e 03vg/ml1.14e 09vg/ml全血8.45e 03vg/ml7.63e 08vg/ml
[0237]
dnase处理性能概述
ꢀ‑ꢀ
选择mnase处理作为用于dnase处理评价的核酸酶。mnase是一种dna和rna核酸内切酶，并且能够切割双链dna (dsdna)、单链dna (ssdna)和rna。mnase比dnasei具有更高的活性(2,000,000单位/ml的mnase和2,000单位/ml的dnasei可通过new england biolabs商购)。在反应缓冲系统中用dnasei (多达250单位，受储备浓度限制)观察到未受保护的dna的不完全消化。相比之下，在所有测试的样品类型中，用4,000单位的mnase处理消除未受保护的脱氧核酸(dsdna和ssdna两者)，并且没有降低示例性hem-b aav构建体从完整病毒颗粒的回收率(参见接下来的实施例3)。
[0238]
在除了全血以外的所有样品类型中，在接近lloq的浓度，评价mnase处理对完整示例性dmd aav构建体病毒dna回收率的影响，最少重复12次。对于所有样品类型，在mnase处理或未处理的样品之间未观察到显著差异(参见下表4和图7)。所有测量的差异都在 /-0.5 log的测定准确度内，并且%变化在可接受的测定变化范围内。线性化质粒的mnase处理导致dna的完全丢失(ct未确定)。mnase处理不适用于作为样品类型的全血，因为mnase缓冲液使血液凝固(参见图8)。dnasei确实适用于在柠檬酸钠收集管中收集的全血，但对已经开发的校准系统具有强烈的负面影响。由于全血不被认为是频繁脱落的体液，因此没有寻求重新开发用于dnase i处理的全血的校准系统。
[0239]
表4
ꢀ‑ꢀ
mnase处理概述
基质未处理的(vg/ml)n=36mnase处理的(vg/ml)n=12log差异%丢失唾液3.45e 032.92e 03-0.07315.39%尿液4.85e 035.15e 030.026-6.10%粪便4.06e 033.41e 03-0.07616.05%线性化质粒1.06e 050na100%
[0240]
qpcr性能
ꢀ–ꢀ
fda指南要求qpcr能够以95%置信度检测《50个拷贝载体/1μg基因组dna。使用一组线性化质粒确定qpcr定量限值，所述线性化质粒包含掺入人基因组dna中的示例性dmd aav构建体病毒基因组。为25个拷贝载体/1μg基因组dna选择n=444，以确保可以实现具有足够置信度的95%检测率(概述于图3以及表5和6中)。
[0241]
表5
ꢀ–ꢀ
分析灵敏度结果概述(lloq)
[0242]
表6
ꢀ–ꢀ
qpcr检测限值
预期值(vg/1
µ
ggdna)观察值(vg/1
µ
ggdna)重复数检测数运行数检测率2527.24444443100.0%
[0243]
准确度
ꢀ‑ꢀ
滴度数据被认为是对数正态分布的，并在log10转换后进行分析。示例性dmd aav构建体脱落测定准确度使用上面对于分析灵敏度描述的相同样品组确定。通过对数转换后的观察值和预期值的差值来计算准确度，并且目标要求在定量范围内的预期值的
±
0.5对数偏差内。概述每种样品类型的示例性dmd aav构建体脱落测定线性和准确度，并且呈现于表7-10中。
[0244]
表7
ꢀ‑ꢀ
唾液中示例性dmd aav构建体的脱落测定的准确度评价
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)9.8e 088.998.99120.019.6e 066.976.98120.011.0e 054.965.00120.041.2e 044.124.0710-0.069.2e 033.953.96120.016.5e 033.783.81360.046.3e 033.793.80120.005.0e 033.733.7012-0.033.8e 033.553.58120.033.4e 033.533.54360.011.8e 033.273.2436-0.03
[0245]
表8
ꢀ‑ꢀ
粪便中示例性dmd aav构建体的脱落测定的准确度评价*
浓度(vg/mg)观察的logqty(logvg/mg)预期的logqty(logvg/mg)重复数log差异(logobs-logexp)1.28e 076.997.11110.121.40e 054.985.15120.17
1.35e 032.973.13120.161.29e 021.972.11100.149.86e 011.951.99350.056.70e 011.671.83120.164.91e 011.621.69360.074.25e 011.571.63110.064.06e 011.531.61360.083.63e 011.511.56350.053.07e 011.371.49120.122.08e 011.151.32120.17
*粪便在提取前悬浮于10个体积(w/v)的1x pbs中。
[0246]
表9
ꢀ–ꢀ
尿液中示例性dmd aav构建体的脱落测定的准确度评价
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)1.1e 099.009.06120.061.2e 076.987.07120.081.1e 054.985.05120.071.8e 044.154.26120.111.2e 043.974.07120.108.7e 033.883.94120.066.6e 033.753.82120.074.9e 033.673.69360.014.1e 033.583.61110.033.9e 033.633.5936-0.033.3e 033.553.5136-0.04
[0247]
表10
ꢀ–ꢀ
全血中示例性dmd aav构建体的脱落测定的准确度评价
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)7.63e 089.008.886-0.127.80e 067.016.898-0.111.25e 055.035.10360.078.95e 045.004.959-0.051.67e 044.214.22360.021.32e 044.194.129-0.079.93e 034.034.0035-0.047.89e 034.013.909-0.126.70e 033.923.839-0.096.47e 033.943.8135-0.123.68e 033.793.578-0.232.26e 033.623.358-0.26
[0248]
特异性
ꢀ‑ꢀ
测定特异性被计算为鉴定的阴性样品与所有未掺入(真阴性)样品的比率。示例性dmd aav构建体脱落的测定特异性用20-24个生物学重复(对于唾液、粪便和尿液为20个，且对于全血为24个)，使用没有任何病毒掺入的正常人唾液、粪便、尿液和全血样品确定。在测试的所有样品类型中，特异性均高于95%。
[0249]
分析灵敏度
ꢀ–ꢀ
分析灵敏度以两步法确定。在步骤1中，对于唾液、粪便和尿液，在两个不同的versant kpcr提取系统上测试多达12-重复组，以估计定量下限(lloq)，对于血液，仅使用一个versant kpcr提取系统来各自测试至少6次重复。在步骤2中，利用接近估计lloq水平的多达36个生物学重复来进一步细化所有样品类型的lloq。在30% cv和
±
0.5log
偏差内的拟合曲线的95%置信上限处的浓度被确定为该样品类型的lloq。每种样品类型的示例性dmd aav构建体脱落测定分析灵敏度概述于下表11-14中。
[0250]
表11-人唾液中示例性dmd aav构建体的分析灵敏度和特异性
[0251]
表12-人粪便中示例性dmd aav构建体的分析灵敏度和特异性**粪便在提取前悬浮于10个体积(w/v)的1x pbs中。
[0252]
表13-人尿液中示例性dmd aav构建体的分析灵敏度和特异性
[0253]
表14-人全血中示例性dmd aav构建体的分析灵敏度和特异性
[0254]
pbmc、唾液、尿液和粪便的环境温度、反复冷冻/解冻和长期-80℃储存稳定性
‑ꢀ
评价在环境温度下储存、在-80℃下长期储存长达6个月和冻融循环的pbmc、唾液、粪便和尿液中示例性dmd aav构建体病毒的稳定性。以1.0e 05 vg/ml掺入合并样品(之后的pbmc的5e 6个细胞/ml悬浮液和粪便的1:10 (w:v)悬浮液)，并在指定时间点测试每种条件的三个生物学重复。示例性dmd aav构建体病毒基因组滴度在时间0测定的滴度的
±
0.5log内，持续长达6个月。长期-80℃储存稳定性结果概述于图5和表15中。环境温度稳定性概述于图4中。冷冻/解冻评价概述于图6中。
[0255]
表15
ꢀ‑ꢀ
在-80℃下储存和冷冻的示例性dmd aav构建体的长期稳定性
基质时间点(月)重复数log平均滴度[logvg/ml]距t0的log平均差异cv[%]回收率[%]唾液036.20na1.43na 136.02-0.123.7775.90 236.17-0.033.6293.44 336.10-0.101.6479.46 636.200.019.99101.39 936.03-0.173.3668.29粪便035.85na5.66na 135.860.0138.87103.46 235.81-0.049.6491.11 335.81-0.049.8991.09 635.79-0.0613.6387.68 935.72-0.136.1273.84尿液036.24na0.80na 136.20-0.030.2992.95 236.260.021.11105.56 336.16-0.073.5384.58 636.19-0.053.5089.03 936.18-0.052.4588.11全血035.72na3.68na 135.720.0011.22100.05
ꢀ
235.770.054.61112.44 335.730.0113.01103.47 635.58-0.1316.6173.59 935.760.057.55111.52
[0256]
实施例3：鉴定和优化用于示例性血友病b aav基因疗法脱落定量的引物。
[0257]
本实施例表明利用本文所述的寡核苷酸序列进行的测定的效用、准确度、灵敏度和精确度。这种脱落测定检测和定量从尿液、血浆、精液、全血、粪便和唾液提取的示例性病毒dna(例如，示例性hem-b aav构建体)。示例性hem-b aav构建体是编码因子ix的腺相关病毒。使用5
µ
l dna提取物在qpcr反应中测试提取的dna。通过将缓冲液中提取的示例性hem-b aav构建体病毒校准物的ct值针对其已知浓度(对数转换的，参见图9)作图，生成线性回归曲线。通过在该模型中拟合它们的ct值来测定样品中示例性hem-b aav构建体病毒dna的浓度。尿液、血浆、精液、全血和唾液样品中示例性hem-b aav构建体病毒dna的浓度报告为病毒基因组数(vg)/ml，且粪便样品示例性hem-b aav构建体病毒dna的浓度报告为vg/mg。
[0258]
fda指南要求qpcr能够以95%置信度检测《50个拷贝载体/1μg基因组dna。使用一组线性化质粒确定qpcr定量限值，所述线性化质粒包含掺入人基因组dna中的示例性hem-b aav构建体病毒基因组。用不同数量的重复测试不同浓度的线性化质粒，以评价定量限值。选择n=75用于最低浓度，以确保95%检测率与足够的置信度。基于≥95%检测、≤20%变异性和与目标值差异在0.125log内的标准，qpcr的定量下限(lloq)被确定为31个病毒基因组拷贝/1
µ
g基因组dna(下面概述)。
[0259]
本实施例表明利用本文所述的寡核苷酸序列进行的测定的效用、准确度、灵敏度和精确度。
[0260]
示例性引物和/或探针的初始筛选设计靶向示例性hemb aav构建体的选定区域的引物(参见图1)。在完成寡核苷酸表征之前，筛选至少一种或多种正向引物、至少一种或多种反向引物以及至少一种或多种探针的特征，诸如多重容量、最大荧光、斜率、最小ct、tm、寡核苷酸交叉反应性和/或在背景基因组dna存在的情况下对hemb aav构建体的特异性。
[0261]
确定某些引物和探针组合在测试的测定条件下工作良好。如附图所示以及本文进一步所示，某些引物和探针组合提供了期望的概况。然而，可以如所示筛选替代的引物和/或探针组合以确定用于其他条件、样品等的期望概况，并且本公开认识到多种引物和/或探针组合可能适用于准确和可靠的检测和/或定量。数据还证实，所选引物和探针组合在(例如，与内部对照引物和探针组合)多重化时工作良好。在一些实施方案中，本领域技术人员将理解某些特征可能或多或少是期望的，并且对于特定应用的一组引物和探针的选择可能取决于权衡某些特征，诸如多重化能力、最大荧光、斜率、最小ct、tm、寡核苷酸交叉反应性、在背景基因组dna存在的情况下对hemb aav构建体的特异性或所有或这些因素中的全部或任意的任何组合。尽管如此，本文提供的数据确立了，所公开的引物和/或探针对于检测生物样品中的aav构建体工作良好。发现至少一种或多种正向引物、至少一种或多种反向引物和至少一种或多种探针适用于一种或多种初始筛选标准(对于某些结果，参见例如表16-18和图20-23)。
[0262]
表16
ꢀ‑ꢀ
靶向替代示例性hem-b aav构建体区域的某些寡核苷酸组合的初始筛选
[0263]
表16 (续)
测定62500个拷贝15625个拷贝3906.25个拷贝976.56个拷贝斜率扩增效率122.624.626.728.6-3.32100.1223.125.227.229.1-3.31100.5324.126.128.230.1-3.3598.9423.225.127.329.2-3.3399.8523.025.126.829.2-3.3698.6
[0264]
表17
ꢀ‑ꢀ
示例性hem-b aav构建体的某些多重测定结果的初始筛选
[0265]
表17 (续) 测定组62500个拷贝15625个拷贝3906.25个拷贝976.56个拷贝244.1个拷贝斜率扩增效率122.424.526.929.030.6-3.594.1219.221.223.325.327.5-3.496.5322.124.226.428.430.5-3.593.3419.021.123.225.227.2-3.497.0522.024.126.428.530.3-3.593.96n/an/an/an/an/an/an/a7n/an/an/an/an/an/an/a819.621.523.525.527.4-3.3102.2
922.124.325.828.530.5-3.594.61019.521.523.525.427.7-3.498.7
[0266]
表18
ꢀ‑ꢀ
用于扩增和定量示例性hem-b aav构建体的某些引物/探针组
示例性hem-baav构建体区域测定引物/探针组斜率荧光ctn区域1组10(seqidno:33、39和47)-3.24.024.810区域2组6(seqidno:35、45和55)-3.374.422.810区域3组9(seqidno:81、87和89)-3.314.523.210
[0267]
统计分析准确度
ꢀ‑ꢀ
测定准确度通过计算平均对数回收率来确定，所述平均回收率被定义为观察到的平均对数定量和测试水平的对数输入物浓度(预期)之间的平均差异。
[0268]
线性
ꢀ‑ꢀ
通过如下拟合线性回归模型来评价测定线性log10 (定量) = β0 β1
×
log10 (输入物浓度) ε其中β0是截距，β1是斜率，且ε是随机误差项。基于该模型计算决定系数r2。如果r2高于0.95，则建立线性。使用r(版本3.5.1 2018-07-02，https://cran.rproject.org/)进行准确度和线性分析。
[0269]
精确度
ꢀ–ꢀ
对于每个浓度水平，使用以下的方差分量模型估计实验室内测定的重现性或精确度，定量=截距 仪器 运行 运行内(误差)其中仪器、运行和运行内误差被视为随机效应。经由随机效应模型估计方差分量。经由随机效应模型估计方差分量。考虑所有仪器间、运行间和运行内效应的总方差δ2被估计为各个方差分量的总和。再现性的量度是变异的百分比系数(%cv)，或总方差除以平均值。方差分量在jmp(版本13.1，sas institute)中使用reml(限制最大似然)模型(https://www.jmp.com/support/help/14-2/restricted-maximumlikelihood-reml-model.shtml)进行分析。
[0270]
特异性
ꢀ‑ꢀ
测定特异性被计算为1减去假阳性样品与所有未掺入(阴性)样品的比率。
[0271]
分析灵敏度
ꢀ‑ꢀ
定量下限(lloq)是满足上述所有标准且检测率至少为95%的最低输入物浓度。
[0272]
结果：qpcr性能概述
ꢀ‑ꢀ
qpcr的定量下限(lloq)是在1 μg基因组dna的背景下31个拷贝的示例性hem-b aav构建病毒dna。
[0273]
脱落测定性能概述
ꢀ‑ꢀ
脱落测定提供了血浆、pbmc、唾液、精液、粪便和尿液样品在相应测定范围内的定量结果。脱落测定检测范围概述于表19中。如果滴度被监测为高于定量上限，则样品报告为aql(高于定量限值)；如果滴度被确定为低于定量下限，则将样品报告为bql(低于定量限值)；且如果滴度在定量范围内，则报告数字浓度。
[0274]
表19
ꢀ–ꢀ
脱落测定检测范围概述样品类型定量下限(lloq)定量上限(uloq)血浆1440vg/ml1.0e 08vg/mlpbmc316vg/1
µ
g基因组dna4.7e 07vg/1
µ
g基因组dna唾液6172vg/ml1.3e 09vg/ml
精液6037vg/ml1.5e 09vg/ml粪便25vg/mg1.4e 07vg/mg粪便尿液5494vg/ml1.4e 09vg/ml
[0275]
dnase处理性能概述
ꢀ‑ꢀ
mnase是选择用于dnase处理的核酸酶。mnase充当有效的dna和rna核酸内切酶，切割双链dna (dsdna)、单链dna (ssdna)和rna。已知mnase比dnasei更有效(2,000,000单位/ml的mnase和2,000单位/ml的dnasei可通过new england biolabs商购)。在反应缓冲系统中用dnasei (多达250单位，受储备浓度限制)观察到未受保护的dna的不完全消化。相比之下，在所有测试的样品类型中，用4,000单位的mnase处理消除未受保护的脱氧核酸(dsdna和ssdna两者)，并且没有降低示例性hem-b aav构建体从完整病毒颗粒的回收率。
[0276]
qpcr性能
ꢀ–ꢀ
fda指南要求qpcr能够以95%置信度检测《50个拷贝载体/1μg基因组dna。通过使用不同浓度的一组线性化质粒确定qpcr定量限值，所述线性化质粒包含掺入人基因组dna中的示例性hem-b aav构建体病毒基因组。用不同数量的重复测试不同浓度的线性化质粒，以评价定量限值。选择n=75用于最低浓度，以确保95%检测率与足够的置信度。基于≥95%检测、≤20%变异性和与目标值差异在0.125log内的标准，qpcr的定量下限(lloq)被确定为31个病毒基因组拷贝/1
µ
g基因组dna (概述于表20中，超过fda指南要求。
[0277]
表20
ꢀ–ꢀ
性能评估报告概述
观察值(vg/1
µ
ggdna)预期值(vg/1
µ
ggdna)重复数检测数检测率准确度(logobs-logexp,
±
0.125log内)精确度(《20%cv)4555002222100.0%-0.04110.10B501212100.0%-0.07514.131(lloq)37.51919100.0%-0.08114.74.425.07575100.0%-0.11020.47%
[0278]
独立的样品制备1.0 (siemens healthineers sasp1.0)系统是一种可扩展、自动化和优化的多样品类型制备系统，其允许对样品和对照进行条形码跟踪。与sasp 1.2试剂盒相比，sasp 1.0试剂盒对精液样品具有增加的精确度，并且优化的系统允许在同一运行内对所有六种生物样品类型进行批处理，实现脱落测定的高度协同作用。
[0279]
特异性
ꢀ‑ꢀ
使用没有任何病毒掺入的正常人血浆、pbmc、尿液、唾液、精液和粪便样品，使用各32个生物学重复测定示例性hem-b aav构建体脱落测定的特异性。在所有样品类型中，32/32次重复均低于定量限值，并且在测试的所有样品类型中特异性为100%。
[0280]
分析灵敏度
ꢀ‑ꢀ
在赋值过程期间，线性化质粒作为标准品，与在病毒储存缓冲液中稀释的病毒材料的平行使用，通过提取和qpcr处理。基于线性化质粒标准，病毒储备物滴度被确定为1.53e 13 vg/ml。性能评估以两步进行。在步骤1中，对于每种样品类型，测试12次重复组以估计定量下限(lloq)；在步骤2中，利用接近估计lloq水平的多达36个生物学重复来进一步细化lloq。证明具有≤30% cv且在偏差的
±
0.5log内的最低样品浓度被确定为该样品类型的lloq。每种样品类型的示例性hem-b aav构建体脱落测定分析灵敏度概述于下表21-26中。
[0281]
表21
‑ꢀ
血浆中的分析灵敏度
[0282]
表22
‑ꢀ
pbmc中的分析灵敏度**将pbmc以5e 6个细胞/ml的浓度重新悬浮于细胞冷冻介质中。
[0283]
表23
‑ꢀ
唾液中的分析灵敏度
[0284]
表24
‑ꢀ
精液中的分析灵敏度
[0285]
表25
‑ꢀ
粪便中的分析灵敏度****粪便在提取前悬浮于10个体积(w:v)的1x pbs中。
†ꢀ
1个样品由于阻塞而丢失。
[0286]
表26
‑ꢀ
尿液中的分析灵敏度
[0287]
准确度
ꢀ‑ꢀ
滴度数据被认为是对数正态分布的，并在log10转换后进行分析。示例性hem-b aav构建体脱落测定准确度使用上面对于分析灵敏度描述的相同样品组确定。通过对数转换后的观察值和预期值的差值来计算准确度，并且目标要求在定量范围内的预期值的
±
0.5对数偏差内。概述每种样品类型的示例性hem-b aav构建体脱落测定线性和准确度，并且呈现于表27-32和图9中。
[0288]
表27
‑ꢀ
血浆中的准确度
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)1.0e 099.008.99120.01
1.1e 077.067.00120.061.2e 055.085.00120.091.4e 03(lloq)3.162.99360.171.1e 033.032.88360.151.1e 033.022.99120.036.9e 022.842.73360.105.3e 022.722.64360.095.1e 022.712.7912-0.083.4e 022.542.46120.088.4e 011.921.52120.416.8e 011.831.22120.61
[0289]
表28
‑ꢀ
pbmc中的准确度
浓度(vg/1
µ
ggdna)观察的logqty(logvg/
µ
ggdna)预期的logqty(logvg/
µ
ggdna)重复数log差异(logobs-logexp)4.7e 077.677.50120.175.0e 055.695.50120.205.5e 033.743.48120.265.3e 022.732.49360.244.5e 022.652.48120.173.2e 02(lloq)2.502.27360.231.4e 022.151.97360.199.4e 011.971.79360.177.3e 011.861.67360.196.2e 011.791.66120.133.4e 011.531.39120.141.3e 011.110.86120.259.8e 000.990.55120.44
*将pbmc以5e 6个细胞/ml的浓度重新悬浮于细胞冷冻介质中。
[0290]
表29
‑ꢀ
唾液中的准确度
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)1.3e 099.119.01120.091.4e 077.157.01120.141.5e 055.164.99120.172.0e 044.314.18360.132.0e 044.294.17120.121.3e 044.124.00360.121.1e 044.043.90120.159.6e 033.983.85360.136.2e 03(lloq)3.793.70360.092.0e 033.303.24360.061.2e 033.083.00120.084.2e 022.622.16120.472.6e 022.421.84120.57
[0291]
表30
‑ꢀ
精液中的准确度
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)1.5e 099.178.94120.221.4e 077.156.93120.221.4e 055.164.91120.252.3e 044.364.10120.262.3e 044.353.97360.392.0e 044.313.86360.45
1.8e 044.243.79360.451.6e 044.203.71330.496.0e 03(lloq)3.783.49120.294.2e 033.623.18120.441.8e 033.252.73120.521.3e 033.132.42120.71
[0292]
表31
‑ꢀ
粪便中的准确度
浓度(vg/mg)观察的logqty(logvg/mg)预期的logqty(logvg/mg)重复数log差异(logobs-logexp)1.4e 077.147.02120.111.5e 055.165.02120.141.4e 033.153.01120.141.4e 022.142.0111
†
0.143.9e 011.591.48360.112.5e 01(lloq)1.41.3120.102.4e 011.381.31360.072.0e 011.291.18360.111.4e 011.141.01120.131.3e 011.111.01360.106.6e 000.820.65120.173.3e 000.520.35120.17
**粪便在提取前悬浮于10个体积(w:v)的1x pbs中。
†ꢀ
1个样品由于阻塞而丢失。
[0293]
表32
‑ꢀ
尿液中的准确度
浓度(vg/ml)观察的logqty(logvg/ml)预期的logqty(logvg/ml)重复数log差异(logobs-logexp)1.4e 099.159.02120.131.4e 077.147.01120.131.5e 055.184.99120.191.1e 044.063.91360.151.1e 044.043.90120.145.5e 03(lloq)3.743.61360.134.1e 033.613.48360.132.8e 033.453.31360.152.3e 033.363.30120.061.3e 033.103.00120.106.2e 022.792.55120.245.9e 022.772.25120.52
[0294]
精确度
ꢀ‑ꢀ
实验室内测定的精确度使用分析灵敏度中描述的相同组(如上所述)来确定。使用两台仪器在多天用相同的试剂批次测试每个组。在整个定量范围内，目标要求是≤30% cv。概述每种样品类型的示例性hem-b aav构建体脱落测定实验室内精确度，并且呈现于表33-38中。
[0295]
表33
ꢀ–ꢀ
血浆组的变异组分
[0296]
表34
ꢀ–ꢀ
pbmc*组的变异组分*将pbmc以5e 6个细胞/ml的浓度重新悬浮于细胞冷冻介质中。
[0297]
表35
ꢀ‑ꢀ
唾液组的变异组分
[0298]
表36
ꢀ–ꢀ
精液组的变异组分
[0299]
表37
ꢀ–ꢀ
粪便**组的变异组分**粪便在提取前悬浮于10个体积(w:v)的1x pbs中。
†ꢀ
1个样品由于阻塞而丢失。
[0300]
表38
ꢀ–ꢀ
尿液组的变异组分
[0301]
个体变异性
ꢀ‑ꢀ
用5个不同的供体对每种样品类型评价个体变异性，每种样品类型掺入1.0e 07 vg/ml示例性hem-b aav构建体(之后的pbmc的5e 6个细胞/ml悬浮液和粪便的1:10 (w:v)悬浮液)。为了评价进行每种条件的三个生物学重复。观察到个体变异性在相同的测定重现性/精确度范围内(%cv ≤30%和
±
0.5log差异内)，数据呈现于表39和图10中。
[0302]
表39
ꢀ–ꢀ
个体变异性
* 来自不同样品类型的供体不匹配；每种样品类型具有不同的供体。
[0303]
dnase处理
ꢀ‑ꢀ
mnase是用于dnase处理的选定核酸酶。为了评价核酸酶活性的效率，唾液、精液、尿液和1x pbs悬浮粪便中掺入三种类型的脱氧核酸模板：未受保护的双链dna (dsdna-aavr)、单链dna (ssdna-gfp)和封装的病毒dna (raav-示例性hem-b aav构建体)。dsdna-aavr和ssdna-gfp与raav示例性hem-b aav构建体平行掺入，浓度均为1.0e 07拷贝/ml，以评价核酸酶活性的效率。在37℃下，每个样品用4,000单位mnase进行mnase处理，重复3次，持续30min，并通过添加edta来终止。siemens储存缓冲液(ssb2)以相同方式掺入，不进行mnase处理，以充当回收率计算的基线。在mnase反应完成后，根据本领域已知的方法进行dna提取。
[0304]
在pbs悬浮粪便样品中观察到对未受保护的脱氧核酸(dsdna和ssdna两者)的强内源性核酸酶活性。在唾液中也观察到对ssdna的适度内源性核酸酶活性，并且在精液和尿液样品中的程度较低。所有样品类型中的mnase处理都耗尽未受保护的dsdna和ssdna模板(减少》97.5%)，而不会降低raav回收率。示例性hem-b aav构建体mnase处理结果概述于图11和表40中。
[0305]
在所有样品类型中，在接近lloq的浓度，进一步评价mnase处理对完整病毒dna回收率的影响，最少重复12次。对于所有样品类型，在mnase处理或未处理的样品之间未观察到显著差异，结果概述于图12和表41中。
[0306]
表40
ꢀ‑ꢀ
测试样品类型中用或不用mnase处理的raav、dsdna和ssdna百分比回收率的概述nd = 通过qpcr未检测到。
[0307]
表41
ꢀ‑ꢀ
lloq附近的每种样品类型中用或不用mnase处理的示例性hemb aav构建体回收率的概述
[0308]
分析物稳定性
ꢀ‑ꢀ
在不同条件下，在未处理的全血和处理的样品
ꢀ‑ꢀ
血浆、pbmc、尿液、唾液、精液和粪便中分析示例性hem-b aav构建体的稳定性。
[0309]
未处理样本
ꢀ‑ꢀ
全血的室温稳定性
ꢀ‑ꢀ
使用从3个个体供体新鲜抽取并掺入1.0e 07 vg/ml的示例性hem-b aav构建体的血液测定在rt储存的全血中示例性hem-b aav构建体的稳定性。在室温下将全血储存指定时间后分离血浆并保持在-80℃，直到收集最后一个时间点用于血浆脱落测定分析。对于每种条件测试三个生物学重复。观察到个体间的变异性；所述供体之一在24小时rt孵育后显示0.3-0.7 log降低。稳定性结果概述于图13和表42中。
[0310]
表42
ꢀ‑ꢀ
在rt储存的全血中示例性hemb aav构建体的稳定性
[0311]
未处理样本
ꢀ‑ꢀ
血浆、pbmc、唾液、精液、尿液和粪便的室温稳定性
ꢀ‑ꢀ
在不同时间点评价储存在rt的血浆、pbmc、唾液、精液、粪便和尿液中示例性hem-b aav构建体病毒的稳定性。用1.0e 05 vg/ml示例性hem-b aav构建体掺入从五个供体合并的样品(之后的pbmc的5e 6个细胞/ml悬浮液和粪便的1:10 (w:v)悬浮液)，并在所示时间点测试每种条件的三个生物学重复。示例性hem-b aav构建体病毒基因组滴度在时间0测定的滴度的
±
0.5log内，持续长达48小时，除了粪便，其稳定长达24小时。参见图14和表43中的结果概述。
[0312]
表43
ꢀ–ꢀ
在rt储存的稳定性样品
[0313]
血浆、pbmc、唾液、精液、尿液和粪便的冷冻/解冻稳定性
ꢀ‑ꢀ
评价血浆、pbmc、尿液、唾液、精液和粪便中示例性hem-b aav构建体病毒持续长达4个冷冻/解冻循环的稳定性。以1.0e 05 vg/ml掺入从五个供体合并的样品(之后的pbmc的5e 6个细胞/ml悬浮液和粪便的1:10 (w:v)悬浮液)，并测试每种条件的三个生物学重复。示例性hem-b aav构建体病毒基因组滴度在起始条件的
±
0.5log内，长达4个冷冻/解冻循环。参见图15和表44中的结果概述。
[0314]
表44
ꢀ–ꢀ
样品冷冻/解冻稳定性的概述
使用sasp1.2试剂盒进行提取，并用1个冷冻/解冻循环，在精液样品中观察到相对高的变异。
[0315]
血浆、pbmc、唾液、精液、尿液和粪便的长期-80℃储存稳定性
ꢀ‑ꢀ
评价储存在-80℃的血浆、pbmc、唾液、精液、粪便和尿液中示例性hem-b aav构建体病毒的稳定性，持续长达6个月。以1.0e 05 vg/ml掺入合并样品(之后的pbmc的5e 6个细胞/ml悬浮液和粪便的1:10 (w:v)悬浮液)，并在指定时间点测试每种条件的三个生物学重复。示例性hem-b aav构建体病毒基因组滴度在时间0测定的滴度的
±
0.5log内，持续长达6个月。长期-80℃储存稳定性结果概述于图16和表45中。
[0316]
表45
ꢀ‑ꢀ
长期-80℃储存的样品稳定性的概述
* 使用sasp1.2试剂盒进行提取，并用在2周和6个月时间点的精液样品中观察到相对高的变异。
[0317]
参考文献本文提及的所有出版物、专利和专利申请在此以其整体通过引用并入，如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，将以本技术，包括本文的任何定义，为准。