免疫细胞体外诱导扩增以及保存方法与流程

1.本发明涉及免疫细胞体外诱导扩增技术领域，尤其涉及免疫细胞体外诱导扩增以及保存方法。


背景技术：

2.生物免疫细胞治疗是通过体外培养、增殖、激活，回输体内诱导自体抗病毒免疫应答，从而使得人体抗病毒免疫被激活后源源不断地产生抗病毒的物质杀灭病毒。免疫细胞对肿瘤细胞、细菌等的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞或细菌，但不会伤及“无辜”的正常细胞，是一种十分有效的治疗方式。
3.现有的技术手段中，对于免疫细胞体外诱导扩增培养体系繁杂、免疫效果不佳，而且在实际实验操作的过程中，容易产生交叉污染，导致数据失真，存在安全上的风险。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的不足，提供了免疫细胞体外诱导扩增以及保存方法。
5.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：免疫细胞体外诱导扩增以及保存方法，该方法包含以下操作步骤：
6.s1、利用免疫抗体在在培养皿中贴壁培养，获取抗体包被培养皿；
7.s2、刺激免疫细胞，从而激活专用培养基，分离制取单个细胞核，并且容置于上述包被培养皿中，培养后制取免疫细胞；
8.s3、利用免疫细胞扩增培养基将上述单个核细胞进行一次扩增培养，得到诱导扩增的免疫细胞；
9.s4、利用免疫细胞专用诱导培养基将一次扩增的免疫细胞进行分化培养，获取分化后的免疫细胞；
10.s5、利用免疫细胞激活培养基将分化后的一次扩增免疫细胞进行二次激活和扩增培养，获得二次免疫细胞；
11.s6、利用免疫细胞冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的二次免疫细胞；将冻存的二次免疫细胞置于恒温的水浴装置中融化，并与一次免疫细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液；
12.s7、将复苏细胞混合液进行离心处理，得到复苏的免疫细胞。
13.进一步的，所述冷冻复苏液包含has、右旋糖酐40、fbs，以dmem/f12培养基为基础培养基。
14.进一步的，所述免疫细胞扩增培养基由200u/ml的il-1、350u/ml的il-2和0.01ke/ml吡柔比新构成，以optmizertmctstm无血清培养基为基础培养基。
15.进一步的，所述免疫细胞冻存液由dmso、fbs、has 、0.001g/ml的白酒草皂苷r构成，以dmem/f12培养基为基础培养基。
16.进一步的，所述水浴装置包括水浴箱，所述水浴箱内部开设有保温室，所述保温室
靠近内壁一侧设置有用于供热的电热丝，所述保温室的内部收容有培养皿，所述保温室的内部容纳有容纳腔体，用于盛放培养皿；所述水浴装置的底端设置有驱动组件，所述驱动组件的顶端延伸入保温室的内部，用于对驱动容纳腔体沿着保温室的内部轴向升降。
17.进一步的，所述容纳腔体的内底面设置有固定座，所述固定座的表面卡接有若干个培养皿，若干个所述培养皿呈阵列分布，所述固定座的顶面开设有用于容纳培养皿的固定槽，所述固定槽的内壁开设有安装槽，所述安装槽内部固定有橡胶条，所述橡胶条远离固定座的一侧抵住培养皿的表面。
18.进一步的，所述容纳腔体的底端固定连接有抬升座，所述抬升座与保温室的内底面之间设置有若干个具有弹性伸缩功能的限位组件，若干个所述限位组件沿着保温室的内底面呈阵列分布。
19.进一步的，所述限位组件包括固定连接保温室内底面的延伸管，所述延伸管的内部容纳有拉伸弹簧，所述拉伸弹簧的顶端固定有连接杆，所述连接杆的顶端与抬升座的底面固定连接，所述连接杆的底端外侧阵列分布有限位滑块，所述延伸管相对于限位滑块的内壁开设有限位滑槽，所述限位滑块沿着限位滑槽的内部滑动。
20.进一步的，所述驱动组件包括位于水浴装置的底端的减速电机，所述减速电机的顶端设置有输出动力的输出轴，所述输出轴的顶端外侧同轴转动的抬升螺杆，所述抬升螺杆的顶端贯穿水浴箱延伸至保温室的内部，所述抬升螺杆的顶端外侧螺纹旋合有抬升螺纹管，所述抬升螺纹管的顶端固定连接抬升座。
21.进一步的，所述抬升螺杆的外侧固定连接有密封环，所述水浴箱相对于密封环的内壁开设有密封槽，所述密封槽与密封环相匹配。
22.本发明的有益效果：
23.本发明在进行诱导扩增以及冻存复苏时，所需要步骤少，用到的物料有限，经济成本低，通过分化处理，所获取的免疫细胞数量更多，免疫细胞带来的免疫效果更好，而且通过利用驱动组件来驱动容纳腔体升降，便于用户取出培养皿，用户不需要将手伸入到保温室的内部，避免用户被烫伤，也避免保温室暴露内空气中的时间过长，产生交叉污染，降低实验安全风险，避免导致实验数据失真，影响试验数据的准确性。
附图说明
24.图1为本发明的水浴装置正视结构示意图；
25.图2为本发明的水浴装置的剖视结构示意图；
26.图3为本发明的培养皿处剖视结构示意图；
27.图4为本发明的图2中的a处结构放大示意图；
28.图5为本发明的图2中的b处结构放大示意图；
29.图6为本发明的制备方法流程结构示意图。
30.图中：10、水浴装置；11、保温室；12、水浴箱；13、电热丝；20、驱动组件；21、减速电机；22、输出轴；23、抬升螺杆；24、抬升螺纹管；25、密封槽；26、密封环；30、容纳腔体；31、固定座；32、安装槽；33、橡胶条；34、固定槽；35、抬升座；40、培养皿；50、限位组件；51、拉伸弹簧；52、连接杆；53、延伸管；54、限位滑块；55、限位滑槽。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
33.实施例
34.如图6所示，本实施例免疫细胞体外诱导扩增以及保存方法，包括以下步骤：
35.a、免疫细胞激活培养基的配置
36.a1、配置含400u/ml的ifn-a1型干扰素、700u/ml的il-2、0.01ke的吡柔比新、8体积百分比的fbs，以optmizertmctstm无血清培养基。
37.a2、配置含650u/ml的ifn-a1型干扰素、840u/ml的il-2、0.012ke的吡柔比新、10体积百分比的fbs，以superculturetml500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基。
38.a3、配置含700u/ml的ifn-a1型干扰素、1080u/ml的il-2、0.0144ke的吡柔比新、12体积百分比的fbs，以superculturetml500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基。
39.b、免疫细胞扩增培养基的配置
40.b1、配置含200u/ml的il-1、350u/ml的il-2和0.01ke/ml吡柔比新，以optmizertmctstm无血清培养基为基础培养基。
41.b2、配置含200u/ml的il-1、420u/ml的il-2和0.012ke/ml吡柔比新，以superculturetml500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基。
42.b3、配置含200u/ml的il-1、540u/ml的il-2和0.0144ke/ml吡柔比新，以optmizertmctstm无血清培养基为基础培养基。
43.c、免疫细胞规模化扩增培养基的配置
44.c1、配置含200u/ml的il-1、350u/ml的il-2，以optmizertmctstm无血清培养基为基础培养基。
45.c2、配置含200u/ml的il-1、420u/ml，以superculturetml500人淋巴细胞无血清培养基为基础培养基。
46.c3、配置含200u/ml的il-1、540u/ml的il-2，以optmizertmctstm无血清培养基为基础培养基。
47.d、免疫细胞冻存液的配置
48.d1、配置含有5体积％dmso 30体积％的fbs 3体积的％has 、0.001g/ml的白酒草皂苷r，以dmem/f12培养基为基础培养基。
49.d2、配置含有8体积％dmso 25体积％的fbs 5体积的％has 、0.0012g/ml的白酒草皂苷r，以dmem/f12培养基为基础培养基。
50.d3、配置含有11体积％dmso 20体积％的fbs 7体积％的has 、0.00144g/ml的白酒草皂苷r，以dmem/f12培养基为基础培养基。
51.e、冷冻复苏液的配置
52.e1、配置含有2体积％has、4体积％右旋糖酐40、13体积％fbs,以dmem/f12培养基为基础培养基。
53.e2、配置含有3体积％has、3体积％右旋糖酐40、15体积％fbs,以dmem/f12培养基为基础培养基。
54.e3、配置含有4体积％has、4体积％右旋糖酐40、17体积％fbs,以dmem/f12培养基为基础培养基。
55.操作步骤f1
56.s1、用cd16-2抗体在玻璃培养皿中贴壁培养，制取抗体包被培养皿；
57.s2、按照a1所配置的用注射过未灭活的ifn-a1型干扰素刺激的b型免疫细胞激活培养基，将经过分离制得的自然杀伤细胞的单个核细胞置于包被培养皿中，进行免疫细胞激活培养24h，制得激活的免疫细胞；
58.s3、利用实施例b1中所制取的免疫细胞扩增培养基对激活的免疫细胞进行诱导扩增培养，制得诱导扩增的免疫细胞；
59.s4、当诱导扩增的免疫细胞的cd56 cd16抗体的表达超过60％时，进行分化培养，制得分化的免疫细胞；
60.s5、当分化的免疫细胞的cd56 cd17抗体的表达超过80％时，利用实施例c1配置的免疫细胞规模化扩增培养基对分化的免疫细胞进行扩增培养，制得规模化扩增的免疫细胞，保持免疫细胞数量大于4.5x106个，每2天传代一次。
61.操作步骤f2
62.s1、用cd16-2抗体在玻璃培养皿中贴壁培养，制取抗体包被培养皿；
63.s2、按照a2所配置的用注射过未灭活的ifn-a1型干扰素刺激的b型免疫细胞激活培养基，将经过分离制得的树突状细胞的单个核细胞置于包被培养皿中，进行免疫细胞激活培养30h，制得激活的免疫细胞；
64.s3、利用实施例b2中所制取的免疫细胞扩增培养基对激活的免疫细胞进行诱导扩增培养，制得诱导扩增的免疫细胞；
65.s4、当诱导扩增的免疫细胞的cd56 cd16抗体的表达超过65％时，进行分化培养，制得分化的免疫细胞；
66.s5、当分化的免疫细胞的cd56 cd16抗体的表达超过84％时，利用实施例c2配置的免疫细胞规模化扩增培养基对分化的免疫细胞进行扩增培养，制得规模化扩增的免疫细胞，保持免疫细胞数量大于5.5x106个，每2.5天传代一次。
67.操作步骤f3
68.s1、用cd16-2抗体在玻璃培养皿中贴壁培养，制取抗体包被培养皿；
69.s2、按照a3所配置的用注射过未灭活的ifn-a1型干扰素刺激的b型免疫细胞激活培养基，将经过分离制得的自然杀伤细胞的单个核细胞置于包被培养皿中，进行免疫细胞激活培养36h，制得激活的免疫细胞；
70.s3、利用实施例b3中所制取的免疫细胞扩增培养基对激活的免疫细胞进行诱导扩增培养，制得诱导扩增的免疫细胞；
71.s4、当诱导扩增的免疫细胞的cd56 cd16抗体的表达超过70％时，进行分化培养，制得分化的免疫细胞；
72.s5、当分化的免疫细胞的cd56 cd17抗体的表达超过88％时，利用实施例c3配置的免疫细胞规模化扩增培养基对分化的免疫细胞进行扩增培养，制得规模化扩增的免疫细胞，保持免疫细胞数量大于6.5x106个，每3.0天传代一次。
73.操作步骤f4
74.在f1的基础上，s5之后还包括：
75.s6、将规模化扩增的免疫细胞按照0.8x107个/ml的数量添加入实施例d1配置的免疫细胞冻存液中冻存；
76.s7、向免疫细胞冻存液中加入免疫细胞冻存液重量3倍实施例e1制备的冷冻复苏液，然后置于37.3℃的恒温水浴中保温。
77.操作步骤f5
78.在f2的基础上，s5之后还包括：
79.s6、将规模化扩增的免疫细胞按照0.8x108个/ml的数量添加入实施例d2配置的免疫细胞冻存液中冻存；
80.s7、向免疫细胞冻存液中加入免疫细胞冻存液重量4倍实施例e2制备的冷冻复苏液，然后置于39.3℃的恒温水浴中保温。
81.操作步骤f6
82.在f3的基础上，s5之后还包括：
83.s6、将规模化扩增的免疫细胞按照0.8x109个/ml的数量添加入实施例d3配置的免疫细胞冻存液中冻存；
84.s7、向免疫细胞冻存液中加入免疫细胞冻存液重量5倍实施例e2制备的冷冻复苏液，然后置于41.3℃的恒温水浴中保温。
85.对上述步骤进行简化：
86.步骤一：利用免疫抗体在在培养皿中贴壁培养，获取抗体包被培养皿；
87.步骤二：刺激免疫细胞，从而激活专用培养基，分离制取单个细胞核，并且容置于上述包被培养皿中，培养后制取免疫细胞；
88.步骤三：利用免疫细胞扩增培养基将上述单个核细胞进行一次扩增培养，得到诱导扩增的免疫细胞；
89.步骤四：利用免疫细胞专用诱导培养基将一次扩增的免疫细胞进行分化培养，获取分化后的免疫细胞；
90.步骤五：利用免疫细胞激活培养基将分化后的一次扩增免疫细胞进行二次激活和扩增培养，获得二次免疫细胞；
91.步骤六：利用免疫细胞冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的二次免疫细胞；将冻存的二次免疫细胞置于恒温水浴装置10中融化，并与一次免疫细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液；
92.步骤七：将复苏细胞混合液进行离心处理，得到复苏的免疫细胞。
93.参考图1以及图2，水浴装置10包括水浴箱12，水浴箱12内部开设有保温室11，保温室11靠近内壁一侧设置有用于供热的电热丝13，保温室11的内部收容有培养皿40，保温室11的内部容纳有容纳腔体30，用于盛放培养皿40；水浴装置10的底端设置有驱动组件20，驱动组件20的顶端延伸入保温室11的内部，用于对驱动容纳腔体30沿着保温室11的内部轴向
升降。
94.使用时，当需要取出位于容纳腔体30内部的培养皿40时，启动驱动组件20，驱动容纳腔体30带动培养皿40沿着保温室11的内部轴向升降，直至容纳腔体30处于合适的高度时，从水浴装置10的内部取出培养皿40。
95.通过利用驱动组件20来驱动容纳腔体30升降，便于用户取出培养皿40，用户不需要将手伸入到保温室11的内部，避免用户被烫伤，也避免保温室11暴露内空气中的时间过长，导致遭到污染，影响试验数据的准确性。
96.参考图2，容纳腔体30的内底面设置有固定座31，固定座31的表面卡接有若干个培养皿40，若干个培养皿40呈阵列分布。
97.使用时，利用固定座31与培养皿40卡接在一起，能够使固定座31与培养皿40之间相固定，提高培养皿40的稳定性。
98.参考图3，固定座31的顶面开设有用于容纳培养皿40的固定槽34，固定槽34的内壁开设有安装槽32，安装槽32内部固定有橡胶条33，橡胶条33远离固定座31的一侧抵住培养皿40的表面。
99.使用时，将培养皿40容纳于固定槽34的内部，直至橡胶条33抵住培养皿40的表面时，培养皿40的位置被固定，橡胶条33具备弹性，在培养皿40受到震动时，能对培养皿40起到缓震的作用，提高培养皿40的稳定性。
100.参考图2，容纳腔体30的底端固定连接有抬升座35，抬升座35与保温室11的内底面之间设置有若干个具有弹性伸缩功能的限位组件50，若干个限位组件50沿着保温室11的内底面呈阵列分布。
101.使用时，通过在固定座31与保温室11之间安装若干个限位组件50，使容纳腔体30能够沿着保温室11的内部做轴向升降，对容纳腔体30起到限位作用。
102.参考图5，限位组件50包括固定连接保温室11内底面的延伸管53，延伸管53的内部容纳有拉伸弹簧51，拉伸弹簧51的顶端固定有连接杆52，连接杆52的顶端与抬升座35的底面固定连接。
103.使用时，当需要对容纳腔体30进行升降时，容纳腔体30带动连接杆52上移，连接杆52上移的过程中，拉伸弹簧51逐渐拉伸，当容纳腔体30进行下移时，容纳腔体30推动连接杆52下移，拉伸弹簧51逐渐收缩。
104.参考图5，连接杆52的底端外侧阵列分布有限位滑块54，延伸管53相对于限位滑块54的内壁开设有限位滑槽55，限位滑块54沿着限位滑槽55的内部滑动。
105.使用时，利用限位滑块54与限位滑槽55相匹配，可以对连接杆52起到限位作用，避免连接杆52的产生转动。
106.参考图2以及图4，驱动组件20包括位于水浴装置10的底端的减速电机21，减速电机21的顶端设置有输出动力的输出轴22，输出轴22的顶端外侧同轴转动的抬升螺杆23，抬升螺杆23的顶端贯穿水浴箱12延伸至保温室11的内部，抬升螺杆23的顶端外侧螺纹旋合有抬升螺纹管24，抬升螺纹管24的顶端固定连接抬升座35。
107.使用时，启动减速电机21，在减速电机21的作用下,输出轴22与抬升螺杆23同步转动，在螺纹驱动作用下，抬升螺纹管24推动抬升座35逐步上升,当抬升螺杆23反转时，抬升螺纹管24带动抬升座35下降。
108.参考图5，抬升螺杆23的外侧固定连接有密封环26，水浴箱12相对于密封环26的内壁开设有密封槽25，密封槽25与密封环26相匹配。
109.通过利用密封槽25与密封环26相匹配，能够对保温室11起到密封作用。
110.需要说明的是，在本文中，如若存在第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
111.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。