鸭坦布苏病毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA

鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a检测系统及rpa引物对和crrna
技术领域
1.本发明涉及鸭坦布苏病毒核酸技术领域，更具体地说，它涉及一种鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a检测系统及rpa引物对和 crrna。


背景技术：

2.鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus，dtmuv)属于黄病毒科 (fiaviviridae)、黄病毒属(flavivirus)、恩塔亚病毒群(ntaya virusgroup)，与登革热病毒(denv)、西尼罗河病毒(wnv)、日本脑炎病毒(jev)以及寨卡病毒(zakv)为同一病毒属成员。鸭坦布苏病毒可引起种鸭和蛋鸭产蛋量大幅度下降，从产蛋高峰或高产蛋率迅速下降至20％～30％，严重的于发病后7天左右停产。因此，快速及时的检测出病原是减少其传播扩散的有效手段。
3.目前，对于dtmuv的检验通常采用病理学显微镜观察、免疫学试验、细胞培养和pcr检测等，这些方法耗时、耗力、操作复杂且需要使用昂贵的仪器设备，仅限于实验室诊断使用，很难适应现场快速、准确检测的需要。因此，建立灵敏、特异、易用、快速、无需大型设备即可实现的检测方法对于基层快速筛查十分必要。


技术实现要素：

4.为了获得检测操作简便快速，适合现场检测，特异性强，检测灵敏度高，准确率高的鸭坦布苏病毒核酸检测系统，本发明提供了一种鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a检测系统及rpa引物对和crrna。
5.第一方面，本发明提供一种采用crispr-cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的rpa引物对，采用如下的技术方案：
6.采用crispr-cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的rpa引物对，所述的rpa引物对选自以下5对引物对中的任意一对：
7.(1)由rpa f1和rpa r1组成的引物对，其中：
8.rpa f1的核苷酸序列为：
9.gaaattaatacgactcactataggggaagctgaaaggaat gacctacccgatgt；
10.rpa r1的核苷酸序列为：
11.tgactgttatcaagcgtccaactggtgtc；
12.(2)由rpa f2和rpa r2组成的引物对，其中：
13.rpa f2的核苷酸序列为：
14.gaaattaatacgactcactataggggttgctttgggtgaca ctgcatgggattt；
15.rpa r2的核苷酸序列为：
16.ttcctcctacgactagaaaggtcatagaaatgg；
17.(3)由rpa f3和rpa r3组成的引物对，其中：
18.rpa f3的核苷酸序列为：
19.gaaattaatacgactcactatagggggcaatggctgtggct tgtttggaaaggg；
20.rpa r3的核苷酸序列为：
21.ggcgttatcacgaatctagcggcatgttt；
22.(4)由rpa f4和rpa r4组成的引物对，其中：
23.rpa f4的核苷酸序列为：
24.gaaattaatacgactcactatagggcgctgaaacatgccgc tagattcgtgataa；
25.rpa r4的核苷酸序列为：
26.aacaagccagctctttgtattcatggtga；
27.(5)由rpa f5和rpa r5组成的引物对，其中：
28.rpa f5的核苷酸序列为：
29.gaaattaatacgactcactatagggtggaaggaggctcatg cgtgactatta；
30.rpa r5的核苷酸序列为：
31.tatgtattcagcataagttgccttgggat。
32.优选的，所述rpa引物优选由rpa f2和rpa r2组成的引物对，其中：
33.rpa f2的核苷酸序列为：
34.gaaattaatacgactcactataggggttgctttgggtgaca ctgcatgggattt；
35.rpa r2的核苷酸序列为：
36.ttcctcctacgactagaaaggtcatagaaatgg。
37.第二方面，本发明提供一种采用crispr-cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的crrna，采用如下的技术方案：
38.采用crispr-cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的crrna，所述crrna为crrna1、crrna2、crrna3、crrna4或crrna5中的任意一种；
39.所述的crrna1的核苷酸序列为：
40.gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaactgtc ggtaggattcttcactagggaaaa；
41.所述的crrna2的核苷酸序列为：
42.gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacccaa aaacctgatgaatgcctttcccaa；
43.所述的crrna3的核苷酸序列为：
44.gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacaaac tgcaacttcaaactggacatttt；
45.所述的crrna4的核苷酸序列为：
46.gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacttcg agtgtgacggtgccataatcctcc；
47.所述的crrna5的核苷酸序列为：
48.gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacctca caaccgctaattccgtagcctcca。
49.优选的，所述crrna优选crrna2，其核苷酸序列为：
50.gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacccaa aaacctgatgaatgcctttcccaa。
51.优选的，所述rpa引物对应用于制备检测鸭坦布苏病毒核酸试剂。
52.优选的，所述crrna应用于制备检测鸭坦布苏病毒核酸试剂。
53.申请人通过对上述5对引物对搭配各自的crrna进行显色反应的视觉效果来筛选出最佳预扩增引物及相应的crrna，结果发现引物 rpa f2和rpa r2搭配crrna2在侧向流动检测条的测试线的显色效果最佳，且阴性对照成立。
54.第三方面，本发明提供一种鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a 检测试剂盒，采用如下的技术方案：
55.一种鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a检测试剂盒，所述试剂盒包括：rpa引物对、crrna、cas13a蛋白、ntp buffer mix、t7 rnapolymerase mix、rnase inhibitor、rna reporter和鸭坦布苏病毒质粒标准品。
56.综上所述，本发明具有以下有益效果：
57.1、为了在不具备仪器设备操作条件的室外使用，本发明建立了鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a横向流动检测系统，进一步对本发明构建的crispr-cas13a横向流动检测的特异性，灵敏性进行验证，结果显示该方法特异性良好，且最低检测限为1.0
×
100copies/反应，敏感性高；经临床样品检测试验验证可知，该方法适用于快速定性检测dtmuv，有效地证明了crispr-cas13a横向流动检测系统可以通过视觉观察检测dtmuv，经临床验证后反应效果良好。
58.2、本发明建立了一种基于crispr-cas13a横向流动检测系统的鸭坦布苏病毒快速临床检测系统，能够对临床样品中的核酸进行直观、灵敏且特异的检测；本发明检测系统可在37℃下进行等温检测，该检测可用于荧光读数或视觉读数；该检测系统的最低检出限为1.0
×
100copies/反应，且与其他家禽病毒没有交叉反应。
59.3、本发明提供了一种基于crispr-cas13a系统的可视、灵敏且特异的鸭坦布苏病毒核酸检测系统，该系统对鸭坦布苏病毒的早期检测及后期流行病学调查提供了技术支撑，对该病的防控具有指导意义。
附图说明
60.图1为本发明实施例试验设计中的rpa引物对的筛选结果图。
61.图2为本发明特异性试验设计中建立的crispr-cas13a系统侧向流动试纸条的特异性检测结果图。
62.图3为本发明敏感性试验设计中建立的crispr-cas13a系统侧向流动试纸条的敏感性检测结果图。
63.图4为本发明临床样品检测试验设计中荧光定量pcr检测15个临床样品的结果图。
64.图5为本发明临床样品检测试验设计中采用建立的 crispr-cas13a系统检测15个临床样品结果图。
具体实施方式
65.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。除非另有说明，本发明的实施例将采用本领域技术人员的能力范围之内分子生物学等领域的传统技术。另外，实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。
66.实施例一
67.本发明提出的一种采用crispr-cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的rpa引物对，其中，rpa引物对选自以下5对引物对中的任意一对：
68.(1)由rpa f1和rpa r1组成的引物对，其中，rpa f1的核苷酸序列和rpa r1的核苷
酸序列见表1；
69.(2)由rpa f2和rpa r2组成的引物对，其中，rpa f2的核苷酸序列和rpa r2的核苷酸序列见表1；
70.(3)由rpa f3和rpa r3组成的引物对，其中，rpa f3的核苷酸序列和rpa r3的核苷酸序列见表1；
71.(4)由rpa f4和rpa r4组成的引物对，其中，rpa f4的核苷酸序列和rpa r4的核苷酸序列见表1；
72.(5)由rpa f5和rpa r5组成的引物对，其中，rpa f5的核苷酸序列和rpa r5的核苷酸序列见表1。
73.本发明提出的一种采用crispr-cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的crrna，其中crrna是crrna1，crrna2，crrna3， crrna4或crrna5中的任意一种，其中，crrna1，crrna2，crrna3， crrna4和crrna5的序列见表1所示。
74.对上述的5对引物搭配各自的crrna进行显色反应的视觉效果来筛选出最佳预扩增引物及相应的crrna，结果发现引物rpa f2和 rpa r2搭配crrna2在侧向流动检测条的测试线的显色效果最佳，且阴性对照成立。
75.本发明提出的一种鸭坦布苏病毒核酸crispr
–
cas13a检测试剂盒，包括：rpa引物对，crrna，cas13a蛋白，ntp buffer mix，t7 rna polymerase mix，rnase inhibitor，rna reporter和鸭坦布苏病毒质粒标准品；其中，所述的rpa引物对选自以下5对引物对中的任何一对：
76.(1)由rpa f1和rpa r1组成的引物对，其中，rpa f1的核苷酸序列和rpa r1的核苷酸序列见表1；
77.(2)由rpa f2和rpa r2组成的引物对，其中，rpa f2的核苷酸序列和rpa r2的核苷酸序列见表1；
78.(3)由rpa f3和rpa r3组成的引物对，其中，rpa f3的核苷酸序列和rpa r3的核苷酸序列见表1；
79.(4)由rpa f4和rpa r4组成的引物对，其中，rpa f4的核苷酸序列和rpa r4的核苷酸序列见表1；
80.(5)由rpa f5和rpa r5组成的引物对，其中，rpa f5的核苷酸序列和rpa r5的核苷酸序列见表1。
81.实施例试验设计
82.1.1毒株
83.鸭坦布苏病毒(dtmuv)、鹅星状病毒(goastv)、鸭瘟病毒(dpv)、禽腺病毒4型(fadv-4)、新型鸭细小病毒(ndpv)、番鸭呼肠孤病毒 (mdrv)、新城疫病毒(ndv)等由本发明人实验室保存。
84.1.2 dtmuv的标准品制备
85.按照病毒dna/rna共提取试剂盒的说明书提取鸭坦布苏病毒及其他家禽病毒goastv、dpv、fadv-4、ndpv、mdr和ndv基因组，按照hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit的说明书对dtmuv的rna进行cdna合成。以得到的cdna为模板，利用引物dtmuv-f/r(dtmuv-f：ttcagctgtctggggatgcag； dtmuv-r：tctggcagtaaatgtcaatgcc)对标
准品目的片段进行pcr扩增。反应体系：2
×
taq酶10μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，cdna模板1μl，ddh2o补充至20μl；反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。将获得的产物进行凝胶电泳、切胶回收并纯化目的片段，连接pmd-19t克隆载体并转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株扩大培养，提取质粒并送测序，将序列鉴定正确的阳性质粒命名为pmd-19t-dtmuv，-80℃保存备用。测定pmd-19t
‑ꢀ
dtmuv浓度，并计算质粒拷贝数，计算公式：copies＝(amount
×
6.022
ꢀ×
1023)/(length
×1×
109×
650)，将其作为crispr-cas13a可视化检测方法的标准品。
86.1.3rpa引物及crrna的设计
87.利用ncbi primer blast进行引物设计，设计5条crrna及其各自对应的5对rpa引物(表1)，通过后续实验条件的优化及视觉效果的判定，最终选择一对rpa引物及其对应的一条crrna作为常用引物及序列。
88.表1相关rpa引物和crrna
[0089][0090]
1.4 crrna的合成
[0091]
将设计的crrna进行体外转录制备。首先在设计时要注意在引物5’端添加附件t7启动子序列。将crrna的dna模板退火形成双链，最终浓度为10μm，利用hiscribe t7 quick high yield rna synthesiskit(new england biolabs)进行体外转录实验。体外转录得到的crrna 利用rnaxp磁珠进行纯化，并通过qubit进行产物浓度测定。
[0092]
1.5重组聚合酶扩增(rpa)
[0093]
按照rt-荧光型核酸扩增试剂盒(rt-rpa)试剂盒说明书操作，在 37℃条件下，孵育20分钟，以样本dna为模板即可实现对目的基因片段的扩增。一般的，单个扩增反应体系为引物(100pmol)，扩增缓冲液加酶mix(25μl)，mgoac溶液(3μl)，核酸模板(1μl)，无核酸酶水(补充体积至50μl)。
[0094]
1.6显色反应体系和条件的优化
[0095]
利用cas13a核酸酶(45nm)，crrna探针(22.5nm)，rna 报告分子(125nm)，rnase inhibitor(0.25μl)，ntp buffer mix 2.5ul，和t7聚合酶(0.4μl)，使用检测buffer补充至9μl，并添加1μl步骤 1.5的扩增产物，37℃孵育40分钟。利用横向流动试纸条稀释液将检测产物稀释10倍后，加载到横向流动试纸条上，放置3-5分钟，观察显色情况。
[0096]
2试验结果
[0097]
2.1质粒标准品的构建
[0098]
利用引物dtmuv-f/r对鸭坦布苏病毒cdna进行常规pcr反应，获长度1500bp的单一条带。产物经胶回收纯化后克隆、测序，结果与预期完全一致，将构建成功的阳性质粒命名为 pmd-19t-dtmuv。根据公式计算pmd-19t-dtmuv标准品的拷贝数为1.13
×
10
10
copies/μl)。
[0099]
2.2 rpa引物及crrna的筛选
[0100]
通过观察图1中5对引物搭配各自的crrna进行显色反应的视觉效果来筛选出最佳预扩增引物及相应的crrna。
[0101]
结果如图1所示，引物rpa f2和rpa r2搭配crrna2在侧向流动检测条的测试线的显色效果最佳，且阴性对照成立。以此作为后续实验的常用引物及序列(表2)。
[0102]
表2筛选后确定的rpa引物和特异性的crrna序列及本发明中应用的其他序列
[0103][0104]
特异性试验设计
[0105]
1试验方法
[0106]
用病毒dna/rna共提取试剂盒提取dtmuv、goastv、dpv、 fadv-4、ndpv、mdr和ndv的基因组核酸。以上述病毒基因组为模板进行核酸预扩增实验并应用试验例1已经建立的显色方法进行 crispr
–
cas13a侧向流动试纸条检测，同时设置阴性对照，验证该方法的特异性。
[0107]
2试验结果
[0108]
分别检测dtmuv和其他家禽病毒goastv、dpv、fadv-4、 ndpv、mdr和ndv对crispr
–
cas13a横向流动检测的特异性进行评估。
[0109]
检测结果如图2所示，仅在检测dtmuv的试纸条上出现测试带的显色，检测其他病毒的试纸条均被判定为阴性，结果证明本发明建立的检测方法特异性良好。
[0110]
敏感性试验设计
[0111]
1试验方法
[0112]
以10倍梯度稀释的pmd-19t-dtmuv标准品质粒(108copies/μ l)
‑×
100copies/μl)为模板进行灵敏度检测，以ddh2o为阴性对照，以测试线无明显条带的最低浓度作为检测方法的灵敏度。
[0113]
2试验结果
[0114]
将标准质粒进行10倍梯度稀释用于检测该方法的灵敏度，检测结果图3所示，检测最低检测限可达到1.0
×
100copies/μl，说明本发明方法对鸭坦布苏病毒的检测灵敏度高。
[0115]
临床样品检测试验设计
[0116]
1试验方法
[0117]
称取50mg的临床组织样本置于研磨管中，加入一颗研磨珠(直径 8mm)，加入100μl的生理盐水，放入组织匀浆机中，以5m/s匀浆 60s(或用研钵研磨)，收集组织研磨液，然后用rna提取试剂盒提取基因组rna作为检测模板，进而采用rt-rpa试剂盒对模板进行等温扩增，得到rpa扩增产物，最后分别用crispr-cas13a侧向流动试纸条检测方法以及本发明人实验室建立的荧光定量pcr方法对从安徽部分地区发病鸭场采集的15份疑似发病鸭的卵巢研磨液进行检测，并比较检测结果。
[0118]
2试验结果
[0119]
本发明人实验室分别以荧光定量pcr及crispr-cas13a横向流动检测方法对安徽发病鸭场采集的15份疑似发病鸭的卵巢研磨液进行临床检测，检测结果如表3，图4，图5所示。
[0120]
表3两种方法检测结果统计
[0121][0122]
根据图4，图5和表3可看出，各样品试纸条均表现出正条带且阴性结果成立，且与荧光定量pcr检测结果吻合度达100％，证明2 种方法的检测效果一致。
[0123]
本发明公开了鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a系统及rpa引物对和crrna。本发明基于设计的rpa引物对和特异性的crrna建立了一种基于crispr-cas13a诊断平台可视、灵敏且特异的鸭坦布苏病毒快速临床检测系统。本发明检测系统与以往的基于pcr技术的检测技术不同，反应全程无需复杂的温度控制仪器，只需在37℃下进行等温检测，可用于荧
光读数或视觉读数，检测系统的最低检出限为1.0
×
100copies/反应，且与其他家禽病毒没有交叉反应，增强的 cas13a检测还可直接在临床样品的病毒检测中发挥作用。本发明检测操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到1.0
×
100copies/反应；准确率高、可靠。
[0124]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。