一种胶红酵母中虾青素高产量提取方法及制备的突变胶红酵母干菌体和应用与流程

1.本发明涉及虾青素的制备技术领域，特别是一种胶红酵母中虾青素高产量提取方法及制备的突变胶红酵母干菌体和应用。


背景技术：

2.虾青素，又叫3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β,β'-胡萝卜素，是一种含有2个酮基和2个羟基的酮式类胡萝卜素，呈深红色。它具有强抗氧化、抗肿瘤、抗光敏等多种生物学活性，并能消除机体自由基，能一定程度提高机体免疫能力。因此，虾青素在水产养殖、医药等方面有良好的发展前景。
3.虾青素具有很高的经济价值，国内和国际市场需求大。虾青素的获得途径分为化学合成和生物获取两种方式。化学合成的虾青素不仅价格昂贵，且其在结构、功能与生物可利用度方面与天然的虾青素有很大的差别。天然虾青素具有稳定性高、安全性好和易于吸收的优点，而化学合成产品的毒性问题倍受人们的关注，许多国家限制化学合成的虾青素的使用。所以天然虾青素的研制与开发受到重视，发展迅速并且将逐步取代化学合成虾青素。
4.天然虾青素主要来源于水产品废弃物、雨生红球藻和酵母。水产品废弃物中的虾青素含量低，提取条件要求苛刻，生产成本高。雨生红球藻自养培养周期长，破壁提取虾青素较困难，技术水平要求较高，生产工艺较复杂。海洋红酵母是微生物发酵生产虾青素较常用的菌种，具有生产周期短、天然无毒、生产成本较低的特点。在海洋红酵母中，胶红酵母可以利用多种糖作为碳源进行代谢，产生虾青素、消化酶和维生素等多种活性物质，能在发酵罐中实现高密度发酵，因此它是值得开发利用的益生菌株。
5.鹦鹉鱼是红魔鬼鱼和紫红火口鱼杂交得到的新品种，全身色泽鲜红，惹人喜爱。但现在的观赏鱼饲料营养成分单一，会导致观赏鱼免疫力低下、易患病，体色暗淡发白，严重影响了观赏鱼的养殖。而胶红酵母代谢产生的虾青素是一种天然色素，添加到饲料中，可以提高水产动物的免疫力和皮肤色泽鲜艳。


技术实现要素：

6.本发明的目的是要现有技术的提取虾青素产量低、成本高和操作复杂等问题，提供一种胶红酵母中虾青素高产量提取方法及制备的突变胶红酵母干菌体和应用。
7.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
8.本发明的第一个目的是要提供一种胶红酵母中虾青素高产量提取方法，包括以下步骤：
9.步骤一、对胶红酵母菌株进行多轮诱变和快速筛选，得到一株高产虾青素且稳定遗传的突变胶红酵母菌株；
10.步骤二、将突变胶红酵母菌株按2％接种量接种于ypd液体培养基，于30℃，
180rpm，培养24h获得突变胶红酵母种子液；将突变胶红酵母种子液按5％接种量接种于发酵培养基中培养，获得突变胶红酵母发酵液；
11.步骤三、取突变胶红酵母发酵液在1000rpm条件下离心10min，湿菌体放置于烘箱中，55℃烘干至恒重得到突变胶红酵母干菌体；对突变胶红酵母干菌体进行破壁处理，之后，加入浸提液振荡混匀，离心收集上清液；对菌体沉淀重复提取，直至菌体变为白色，收集所有上清液中的虾青素。
12.进一步地，所述步骤一具体包括：
13.1)将胶红酵母菌株依次经过紫外诱变、氯化锂-紫外复合诱变和紫外诱变；
14.2)用0.3-0.9g/l的β-紫罗酮筛选平板初筛，30℃，黑暗培养3-4天；挑取菌落较大且颜色较深的单菌落，摇瓶发酵复筛，选育出虾青素产量高且稳定遗传的突变胶红酵母菌株。
15.进一步地，所述发酵培养基的成分为蔗糖20-30g/l，酵母浸粉为5-10g/l，磷酸氢二钠为5-10g/l。
16.优选地，所述发酵培养基的成分为：蔗糖30g/l，酵母浸粉9g/l，磷酸氢二钠6g/l。
17.进一步地，所述步骤三中，利用酸热法对突变胶红酵母干菌体进行破壁处理，酸热法具体步骤为：取0.1g突变胶红酵母干菌体加入5ml的3mol/l的盐酸混匀均匀，置于沸水浴5min，再冰浴5min，离心弃上清液、保留菌体沉淀。
18.进一步地，所述浸提液为丙酮、乙醇、氯仿、乙酸乙酯中的一种或多种。
19.优选地，所述浸提液为体积比1:1的乙酸乙酯和乙醇组成的混合溶液。
20.本发明的第二个目的是要提供一种利用上述方法制得的突变胶红酵母干菌体。
21.本发明的第三个目的是要提供一种突变胶红酵母干菌体的应用，所述突变胶红酵母干菌体用作饲料添加剂。
22.进一步地，所述突变胶红酵母干菌体与饲料的比例为1-3:10-15。
23.与现有技术相比，本发明首先对原始胶红酵母菌株进行多轮诱变和快速筛选，可以得到一株高产虾青素且稳定遗传的突变胶红酵母菌株；其次，对突变胶红酵母菌株进行培养获得突变胶红酵母发酵液，然后对该发酵液的菌体进行破壁处理和浸提提取虾青素，本发明具有操作简单、成本低和产量高等优点；最后，将胶红酵母添加到鱼饲料中，丰富其营养成分，增强鱼的免疫力，使皮肤色泽鲜艳。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
25.实施例1
26.确定筛选平板中β-紫罗酮的浓度
27.胶红酵母经种子培养后，按5％接种量接种于发酵培养基中，培养24h。经紫外诱变，菌液做适当稀释涂布于含有过滤除菌的0-0.9g/lβ-紫罗酮筛选平板，25-30℃，黑暗培养3-4天，观察记录菌落的生长情况。
28.表1 不同β-紫罗酮浓度对筛菌效果的影响
29.β-紫罗酮浓度(g/l)00.10.30.50.70.9
致死率(％)02.56.675.482.887.7菌落颜色粉红粉红粉白粉白白色白色菌落大小正常正常略小略小小小
30.由表1可知，随筛选平板中β-紫罗酮浓度的升高，单菌落的致死率增加，颜色变浅，说明β-紫罗酮对色素的合成有较强的抑制作用。选择致死率在80％左右的浓度时，可以明显简化筛选工作量，但菌落过小，不利于后续挑菌。最终，确定β-紫罗酮的浓度为0.5g/l。
31.实施例2
32.多轮诱变选育高产虾青素的突变株
33.胶红酵母菌株(购自中国普通微生物菌种保藏中心)经过紫外诱变、氯化锂-紫外复合诱变和紫外诱变，用0.5g/lβ-紫罗酮筛选平板初筛，30℃，黑暗培养3-4天。挑取菌落较大且颜色较深的单菌落，摇瓶发酵复筛。选育出虾青素产量高且稳定遗传的突变株。
34.虾青素产量的测定：取10ml发酵液，离心弃上清液、保留菌体；加5ml的3mol盐酸混匀菌体，置于沸水浴5min，再冰浴5min，离心弃上清液、保留菌体沉淀。加入适量丙酮，混匀，离心，保留上清液，上清液为含虾青素的浸提液。重复该步骤，直至菌体变为白色，在474nm波长下，测定浸提液的吸光值。
35.虾青素产量(mg/l)＝a
·d·va
/e
·vb
36.式中：a——吸光度；d——稀释倍数；va——浸提液的体积(ml)；
[0037]vb
——取样发酵液的体积(ml)；e——消光系数(0.16)。
[0038]
生物量的测定：取10ml发酵液，离心弃上清液，将菌体洗涤两次，烘干至恒重，称重。
[0039]
经过多轮诱变，得到一株最优的突变株，该菌株的虾青素产量为4.2mg/l，较原始菌株提高68％；生物量为12.3g/l，较原始菌株提高35％。
[0040]
实施例3
[0041]
将突变胶红酵母菌株按2％接种量接种于ypd液体培养基，于30℃，180rpm，培养24h获得突变胶红酵母种子液；将突变胶红酵母种子液按5％接种量接种于发酵培养基中培养，本实施例所用的发酵培养基的组分为蔗糖30g/l，酵母浸粉9g/l，磷酸氢二钠6g/l；获得突变胶红酵母发酵液；取突变胶红酵母发酵液在1000rpm条件下离心10min，湿菌体放置于烘箱中，55℃烘干至恒重得到突变胶红酵母干菌体；取0.1g突变胶红酵母干菌体加入5ml的3mol/l的盐酸混匀均匀，置于沸水浴5min，再冰浴5min，离心弃上清液、保留菌体沉淀，之后，加入体积比1:1的乙酸乙酯和乙醇组成的混合溶液振荡混匀，离心收集上清液；对菌体沉淀重复提取，直至菌体变为白色，收集所有上清液中的虾青素。
[0042]
经实测，本实施例得到的虾青素产量为5.3mg/l，比原始培养基提高26％；生物量为19.3g/l，比原始培养基提高57％。
[0043]
实施例4
[0044]
虾青素提取条件优化
[0045]
将胶红酵母发酵液，在1000rpm条件下离心10min，湿菌体放置于烘箱中，55℃烘干至恒重。为比较不同破壁方法的效果，各取0.1g干菌体，利用酸热法、反复冻融 超声波裂解法、dmso、机械法和自溶法进行破壁处理。之后，加入1ml丙酮溶液作为浸提液，振荡混匀，离心收集上清液，对菌体沉淀重复提取，直至菌体变为白色。利用紫外分光光度计在474nm处，
测定浸提液的吸光值，比较提取出的虾青素含量。
[0046]
为确定最优的浸提液，各取0.1g干菌体，酸热法破壁。之后，分别使用丙酮、乙醇、氯仿和乙醇、乙醇和乙酸乙酯作为浸提液提取虾青素，重复提取至菌体变为白色。利用紫外分光光度计在474nm处，测定浸提液的吸光值，比较提取出的虾青素含量。
[0047]
虾青素含量(μg/g干菌体)＝a
·d·
v/e
·w[0048]
式中：a——吸光度；d——稀释倍数；v——浸提液的体积(ml)；
[0049]
w——取样干菌体克数(g)；e——消光系数(0.16)。
[0050]
表3 不同破壁方法的比较
[0051]
破壁方法虾青素含量(μg/g)酸-热法305.6反复冻融 超声波裂解法111.6dmso170.6机械法115.3自溶法31.9
[0052]
由表3可知，酸热法破壁得到的虾青素含量最高，为305.6μg/g。因此，确定最优的破壁方法为酸热法。
[0053]
表4 不同浸提溶剂的比较
[0054]
浸提溶剂虾青素含量(μg/g)丙酮305.6乙醇359.1氯仿 乙醇(体积比1:1)75乙酸乙酯 乙醇(体积比1:1)698.4
[0055]
由表4可知，浸提溶剂为乙酸乙酯和乙醇(1:1)得到的虾青素含量最高，为698.4μg/g，较原始采用丙酮提取条件提高1.3倍。因此，确定最优的浸提液为体积比1:1的乙酸乙酯和乙醇组成的混合溶液。
[0056]
实施例5
[0057]
胶红酵母对鹦鹉鱼养殖上的应用
[0058]
实验前，将鹦鹉鱼在实验室条件下，暂养1周，暂养期间每天投喂两次基础饲料，驯化。喂实验饲料前，饥饿24h，拍照记录鹦鹉鱼皮肤颜色情况，称量鹦鹉鱼平均体重、体长和体高。将胶红酵母湿菌体烘干，干菌体按1:10的比例拌入基础饲料中，得到的饲料中虾青素的含量为70mg/kg。每天投喂两次添加有胶红酵母干菌体的饲料，共养殖8周。实验过程中，拍照记录和比较皮肤颜色变化情况。实验结束后，饥饿24h，称量比较鹦鹉鱼的平均体重、体长和体高。
[0059]
实验前，喂食基础饲料的鹦鹉鱼全身体色偏白，红色斑点较少，且主要集中在脊背处。实验后，鹦鹉鱼全身通红，无白色斑点。体重、体长和体高都有所增加，患病情况变少。由此证明，虾青素可以有效使鹦鹉鱼皮肤变红，着色效果明显，提高其生长性能和免疫力。
[0060]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。