用于探针法qPCR的TaqDNA聚合酶突变体的制作方法

用于探针法qpcr的taq dna聚合酶突变体
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及用于探针法qpcr的taq dna聚合酶突变体。


背景技术：

2.taq dna聚合酶一般在聚合酶链式反应(pcr)中用于核酸扩增子的扩增。在pcr反应中，目标dna片段(扩增子)一般通过三个步骤的循环进行扩增得到：变性、退火和延伸。实时荧光定量pcr(qpcr)是在pcr扩增的过程中，通过收集染料或探针产生的荧光信号数据，实现对扩增结果的检测和记录。基于探针的检测技术是指借助荧光标记的靶向探针进行检测的技术，当荧光探针与目标序列结合时释放荧光染料，可以通过实时检测荧光信号强度的改变推测扩增的进程。
3.taq dna聚合酶具有dna聚合酶活性和5
′→3′
外切酶活性，这也是探针法qpcr得以实现的基础。由于探针法qpcr的扩增子通常较短，因此，即使是在较短的扩增时间间隔内(如1秒)，野生型taq dna聚合酶的聚合活性也足以满足扩增要求。但是，无论扩增期间是否发生聚合，野生型taq dna聚合酶都无法在1秒钟内将探针从其附着的荧光团中分离出来，这也就限制了检测速度。因此，taq dna聚合酶负责释放报告信号的的5
′→3′
外切酶活性成为探针法qpcr的限速因子。基于此，本技术提供能够提高5
′→3′
外切酶活性的taq dna聚合酶突变体，以实现qpcr的快速检测。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了用于探针法qpcr的taq dna聚合酶突变体，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
5.本发明是这样实现的，一种taq dna聚合酶突变体，所述taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列相较于野生型taq dna聚合酶的氨基酸序列发生以下突变中的至少一种：v62s、v64s、a70f、f73a、a77f、p253g、e255k、d257r、a259f、a271f、l288s、e289k、s357i、l361s、l376s、p382g、t385i、g418p、r419d、e421k、l461s、a472f、e497k、l498s、e524k、d551r、r556d、s679i、l789s或e189k/e507k/e742k；所述野生型taq dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.2所示，v62s表示seq id no.2中的第62位氨基酸由v突变为s；e189k/e507k/e742k表示seq id no.2中同时发生3处突变，分别为第189位由e突变为k、第507位由e突变为k、第742位由e突变为k。其他突变体的突变方式的表示原理与此相同。
6.进一步地，taq dna聚合酶突变体能够延伸引物，延伸条件限制在1秒内。
7.本发明还提供了编码如上述的taq dna聚合酶突变体的dna序列。
8.v62s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第62位氨基酸的密码子由gtg替换为tct。
9.v64s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第64位氨基酸的密码子由gtt替换为tct。
10.a70f的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第70位氨基酸的密码子由gcc替换为ttc。
11.f73a的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第73位氨基酸的密码子由ttt替换为gct。
12.a77f的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第77位氨基酸的密码子由gcc替换为ttc。
13.p253g的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第253位氨基酸的密码子由ccg替换为ggg。
14.e255k的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第255位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa。
15.d257r的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第257位氨基酸的密码子由gat替换为cgt。
16.a259f的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第259位氨基酸的密码子由gcc替换为ttc。
17.a271f的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第271位氨基酸的密码子由gcc替换为ttc。
18.l288s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第288位氨基酸的密码子由ctg替换为tct。
19.e289k的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第289位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa。
20.s357i的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第357位氨基酸的密码子由agt替换为atc。
21.l361s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第361位氨基酸的密码子由tta替换为tct。
22.l376s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第376位氨基酸的密码子由ctg替换为tct。
23.p382g的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第382位氨基酸的密码子由ccg替换为ggt。
24.t385i的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第385位氨基酸的密码子由acc替换为atc。
25.g418p的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第418位氨基酸的密码子由ggt替换为cct。
26.r419d的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第419位氨基酸的密码子由cgc替换为gac。
27.e421k的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第419位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa。
28.l461s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第461位氨基酸的密码子由ctg替换为tct。
29.a472f的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第472位氨基酸的密码子由
gcc替换为ttc。
30.e497k的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第497位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa。
31.l498s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第498位氨基酸的密码子由tta替换为tct。
32.e524k的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第524位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa。
33.d551r的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第551位氨基酸的密码子由gat替换为cgt。
34.r556d的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第556位氨基酸的密码子由cgt替换为gat。
35.s679i的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第679位氨基酸的密码子由tca替换为ata。
36.l789s的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第789位氨基酸的密码子由ctg替换为tct。
37.e189k/e507k/e742k的核苷酸序列与seq id no.1相比，区别仅在于，第189位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa，第507位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa，第742位氨基酸的密码子由gaa替换为aaa。
38.本发明还提供了包含如上述的dna序列的载体。
39.本发明还提供了包含如上述的dna序列的细胞。
40.本发明还提供了如上述的taq dna聚合酶突变体在核酸扩增中的应用。
41.本发明还提供了如上述的taq dna聚合酶突变体在qpcr中的应用。
42.本发明还提供了一种qpcr检测试剂盒，包括：目标序列引物、插入染料或标记的目标探针、以及如上述的taq dna聚合酶突变体。
43.进一步地，插入染料是sybr green或evagreen。标记被核酸外切酶从探针上剥离时会发出荧光。
44.本发明还提供了一种qpcr检测方法，反应体系20μl，包含4μl 50ng/μl taq dna聚合酶突变体，1μl 10μm正向引物，1μl 10μm反向引物，1μl 5μm标签探针，1μl模板，2μl 10x buffer，余量为水；反应程序为：95℃变性30秒；95℃退火4秒，60℃延伸1秒，40个循环；所述taq dna聚合酶突变体如上述。
45.进一步地，所述buffer包含20mm tris
‑
hcl，80mm tris
‑
acetate，10mm(nh4)2so4，10mm kcl，2mm mgso4，3mm mg
‑
acetate，0.1％
‑
x
‑
100，ph 8.8。
46.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
47.本发明提供的taq dna聚合酶突变体与野生型taq dna聚合酶相比，qpcr效率更高。本发明中基于探针法qpcr对taq dna聚合酶突变体进行设计、表征和筛选，采用快速扩增时间(延伸期1秒)的循环过程，获得了部分taq dna聚合酶突变体，包括:v62s、v64s、a70f、f73a、a77f、p253g、e255k、d257r、a259f、a271f、l288s、e289k、s357i、l361s、l376s、p382g、t385i、g418p、r419d、e421k、l461s、a472f、e497k、l498s、e524k、d551r、r556d、s679i、l789s、e189k/e507k/e742k。
48.与野生型taq dna聚合酶相比，本技术提供的突变体具有快速检测扩增结果的特点，这显著降低了qpcr过程所需的总时间，提高了qpcr或实时qpcr的检测效率。因此，本技术提供的突变体具有较大的经济优势。
49.本发明提供的taq dna聚合酶突变体可以用于常规的qpcr检测，包括基因表达分析和其他dna定量检测。
附图说明
50.图1
‑
6为野生型和突变型taq dna聚合酶的扩增信号图。图中，x轴为周期数，y轴为荧光信号(dr)，表示扩增过程中的荧光变化，圆点表示每个周期具体检测到的信号值。所有检测阈值线固定在0.02。所有突变体的qpcr程序都是重复运行的，如图所示，可以看到两组不同的点和线。
51.图1是野生型及突变体v62s、e255k、p253g、f73a、a77f的扩增信号图；
52.图2是野生型及突变体v64s、a70f、l288s、e289k、s357i的扩增信号图；
53.图3是野生型及突变体l361s、d257r、a259f、a271f、g418p的扩增信号图；
54.图4是野生型及突变体r419d、e421k、l461s、l376s、p382g的扩增信号图；
55.图5是野生型及突变体t385i、e524k、d551r、r556d、s679i的扩增信号图；
56.图6是野生型及突变体a472f、e497k、l498s、l789s、e189k/e507k/e742k的扩增信号图。
具体实施方式
57.本技术中的“约”、“大概”等词语，与数字一起使用时，通常指在实验误差范围内的数值(如均值在95％的置信区间内)或在数值
±
10％内的变量值，以较大的数值为界限。
58.术语“标记探针”是指用于扩增反应的标记探针，包括定量或qpcr分析，以及端点分析。这种标记探针可用于监测目标多核苷酸的扩增，适用于监测扩增子数量随时间的变化。
59.寡核苷酸标记探针包括但不限于5'
‑
核酸外切酶taqman探针(见美国专利no.5,538,848)、各种茎环分子信标(见美国专利no.6,103,476和no.5,925,517，无茎分子信标或线性信标(wo 99/21881)，pna分子信标(如，美国专利no.6,355,421和no.6,593,091)，线性pna信标，non
‑
fret标记探针(如，u.s.专利no.6,150,097)，sunrise/amplfluor标记探针(美国专利no.6,548,250)、茎环和双蝎形标记探针(美国专利no.6,589,743)，凸环标记探针(美国专利no.6,59091)，伪结标记探针(美国专利no.6,589,250)；循环子(美国专利no.6,383,752)，发夹标记探针(美国专利no.6,596,490)、肽核酸(pna)发光标记探针、自组装纳米粒子标记探针和二茂铁修饰标记探针等，如美国专利no.6485901。标记探针也可以包括黑洞猝灭剂(biosearch)，爱荷华黑(idt)猝灭剂，qsy猝灭剂(分子标记探针)，以及dabsyl和dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂(epoch)。标记探针也可以由两个探针组成，如，荧光团位于其中一个探针上，猝灭剂位于另一个探针上，两个探针的杂交使信号猝灭，或通过荧光的变化改变信号特征。除羧基荧光素、磷酰胺荧光素、cy 5磷酰胺荧光素(可从amersham获得)外，标记探针也可以包括带有磺酸基的荧光染料磺化衍生物。
60.本技术中“样本”指任何来源的生物样本，包括核酸或dna。
61.本技术中“real time quantitative pcr”、“real time qpcr”和“quantitative pcr”(缩写“qpcr”)可以互换使用，是指使用标记探针同时进行扩增、检测和定量检测目标多核苷酸的pcr扩增方法，进一步地，也可以包括本技术中举例给出的方法，如实时荧光定量pcr或半定量荧光定量pcr系统中的taqman、sybr green等方法。
62.本技术中“靶标”是指一个需要被扩增的多核苷酸序列，可以是一个核酸分子，也可以存在于一个核酸分子或样本中。靶标多核苷酸可以以任何方式获取，可以是以rna为基础获取的dna或cdna，可以是甲基化和/或非甲基化形式。
63.本技术中“循环阈值”或“c
t”是指荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，包括通过绘制荧光信号与循环周期的对数曲线实现dna的实时定量pcr。阈值最好设定为背景信号以上荧光信号标注差的3
‑
5倍。荧光超过阈值的周期数称为阈值周期(ct)或定量周期(cq)。
64.本技术中“阈值”是指用于计算循环阈值(c
t
)的报告信号值。
65.本技术中“报告信号”是指在数据检测分析过程中，由报告基因(通常是染料或标记的探针)产生的与pcr产物浓度相关的信号值，包括但不限于循环反应数据。所述数据包括但不限于荧光信号数据、光信号数据、磁信号数据和电子信号数据。所述检测分析包括但不限于通过qpcr进行dna定量分析。报告信号可以由dna与染料(如sybr green或evgreen)结合或者插入染料中产生。染料在pcr过程中与双链dna结合，增加染料的荧光量子产量，从而使每个周期测量的荧光强度增加。可以通过调整检测方法使信号强度增加，从而提高目标dna定量的准确性。
66.本发明中的taq dna聚合酶突变体可以使qpcr效率更高，如使扩增时间间隔周期为1秒。为了提高目标体系的扩增效率，本技术中的taq dna聚合酶突变体可以与引物和模板一起使用，以筛选到最佳组合。试验中，可以通过连续稀释dna浓度来构建与c
t
值变化的标准曲线，从而根据报告信号确定样品稀释度。使用线性回归的斜率确定放大倍数，如稀释1:2导致(ct)差异为1，则放大倍数为100％。
67.qpcr的扩增效率也可以通过qpcr定量方法来确定，这种方法不需要绘制标准曲线。如mak2方法(参见boggy g,woolf pj(2010)；ravasi t(ed.)."a mechanistic model of pcr for accurate quantification of quantitative pcr data"plos one 5(8):e12355)，该方法已被证明具有与标准曲线方法相同或更好的定量检测效果。这类方法是利用聚合酶扩增过程中的原理知识对样品浓度和扩增效果进行估计的。
68.本发明中的taq dna聚合酶突变体可以进行实时或qpcr检测，也可以用于核酸定量检测，并通过相对定量或绝对定量检测基因的表达。绝对定量要求样品与标准品的pcr扩增效率相同，从而能够通过与标准曲线比较得出目标dna分子的准确数量。本发明中的taq dna聚合酶突变体能够提供更快的循环周期，相同或更高的扩增效率，非常适合于绝对定量和相对定量检测。
69.定性pcr也可以用于感染性疾病、癌症和遗传异常等的核酸检测，从而实现快速诊断。本发明中的taq dna聚合酶突变体在qpcr检测中的特性有助于传染性疾病或新发疾病(如流感、冠状病毒)的诊断。
70.本发明中的taq dna聚合酶突变体能够对基因表达进行实时或qpcr检测，这对食品安全、食品变质、发酵以及水体(包括饮用水和娱乐用水)微生物风险评估和公共卫生保
护具有重要意义。
71.本发明中的taq dna聚合酶突变体可以对不同类别或功能的基因进行实时或qpcr检测，如在环境相关样品中用于确定样品中微生物的数量和/或根据标记识别不同科、属和种的微生物。还可以用于功能标记物(蛋白的编码基因)的检测，以显示群落内的基因表达，从而揭示环境信息。
72.本发明中的taq dna聚合酶突变体可以对农业病原体进行实时或qpcr检测，包括感染植物或幼苗的细菌。即使检测体系中仅含有少量病原体也是可以的，如与宿主植物dna混合的栎树猝死病菌phytophthora ramorum，这是一种卵菌，可以杀死橡树和其他物种。
73.本发明中的taq dna聚合酶突变体可以根据实时或qpcr检测的灵敏度和动态范围实现对转基因生物的检测。这种检测不需要对转基因进行扩增，只需要与特定引物组合，对载体的启动子、终止子或中间序列进行扩增即可。构建转基因植物的过程中通常会插入若干拷贝的转基因，因此，本技术中的taq dna聚合酶突变体也可以用于基因拷贝数的检测。
74.使用本发明中的taq dna聚合酶突变体的qpcr可以实现对病毒的定量分析和基因分型(使用熔化曲线对菌株进行表征)。
75.感染程度与许多疾病的确诊紧密相关。本发明中taq dna聚合酶突变体可以用于定量分析病人组织中单位病毒基因组的拷贝数，从而对感染程度进行判断。
76.本发明中，seq id no.1是带有c端histag标签的野生型taq dna聚合酶的dna序列。seq id no.2是带有c端histag标签的野生型taq dna聚合酶的氨基酸序列。
77.实施例
78.使用本发明中的taq dna聚合酶突变体进行基因表达分析时，一般从样品中提取rna，然后逆转录获得cdna。可以用现有技术中的任一方法检测报告信号的阈值，确定样品的c
t
，实现cdna靶标的定量检测。
79.获取突变体
80.采用反向pcr诱变方法获取taq dna聚合酶突变体。本发明中所有taq dna聚合酶突变体均在大肠杆菌中表达并纯化，并经过测序验证，且为了方便纯化，所有突变体及野生型均在c端添加有his标签。
81.qpcr探针
82.qpcr探针的获取：以美国疾控中心2019
‑
ncov实时rt
‑
pcr诊断小组发布的sars
‑
co n基因2019
‑
ncov_n2为目标进行qpcr。
83.正向引物：2019
‑
ncov_n2 forward primer:ttacaaacattggccgcaaa(seq id no:3)；
84.反向引物：2019
‑
ncov_n2 reverse primer:gcgcgacattccgaagaa(seq id no:4)；
85.探针：2019
‑
ncov_n2 probe:fam
‑
aca att tgc ccc cag cgc ttc ag
‑
bhq1(seq id no:5)。
86.起始目标浓度为每个反应合成10个covid
‑
19n基因(twist bioscience,ca)。
87.反应体系20μl，包含4μl 50ng/μl taq dna聚合酶，1μl 10μm正向引物，1μl 10μm反向引物，1μl 5μm标签探针，1μl 10个拷贝/μl covid 19n基因，2μl 10x buffer(20mm tris
‑
hcl，80mm tris
‑
acetate，10mm(nh4)2so4，10mm kcl，2mm mgso4，3mm mg
‑
acetate，0.1％
‑
x
‑
100，ph 8.8@25℃)，余量为水。
88.使用prime pro 48real
‑
time qpcr仪(cole
‑
parmer,uk)，反应程序为:95℃变性30秒，然后40个循环[95℃退火4秒，60℃延伸1秒]，60℃收集荧光信号。
[0089]
结果如图1
‑
6所示。野生型没有显著的信号，产生显著信号的突变体有v62s、v64s、a70f、f73a、a77f、p253g、e255k、d257r、a259f、a271f、l288s、e289k、s357i、l361s、l376s、p382g、t385i、g418p、r419d、e421k、l461s、a472f、e497k、l498s、e524k、d551r、r556d、s679i、l789s、e189k/e507k/e742k。每个突变体的核苷酸和氨基酸序列都记载在序列表中(详细参见序列表)。
[0090]
本技术中通过引用专利、文献对技术方案进行解释。上述给出的实施例仅做代表示例，并不对本技术的保护范围造成限制。本领域技术人员可以在对本技术的技术方案理解的基础上对实验方法、实施例等作出改变，并包含在本技术权利要求的保护范围内。对本领域技术人员而言，在不偏离本发明的范围和精神的情况下，可以对本发明的技术方案作出替代或修改，这对本领域技术人员而言是显而易见的。对于本发明中未明确记载为必要条件的要素，本发明可以在不包含这些要素的情况下实施。在每个实施例中，“包含”、“包括”或“包含”等词语为开放式描述。本发明中的方法或工艺顺序可以进行调整，并不局限于说明书或权利要求书中指出的步骤顺序。任何情况下，对本技术的解释都不得局限于本技术的说明书或实施例中的具体描述。除在申请人的答复文件中明确声明的以外，本技术不被任何审查员或专利商标局的职员的任何声明所限制。
[0091]
本发明中对技术方案进行了较宽泛的描述，属于同一亚属或种的微生物也属于本发明的保护范围内。本发明中所使用的术语或表述仅用于描述，并不产生限制，使用与这些术语或表述意思相同的描述都是可以的，都属于本发明的保护范围内。因此，虽然本技术中已经通过优选实施例或可选特征进行明确公开，但本领域技术人员可以依据本发明所公开的概念进行修改，这些修改都属于本发明权利要求的保护范围内。