一种醋酸菌冻干粉及其制备方法与流程

1.本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种醋酸菌冻干粉及其制备方法。


背景技术：

2.醋酸菌(acetic acid bacteria,aab)是一类严格好氧的革兰氏阴性细菌，分类学上隶属于α变形杆菌纲，红螺菌目，醋酸醋杆菌科。醋酸菌常见于气候温暖、空气湿润的区域，广泛分布于果园土壤、果汁、蜜饯、花朵以及一些昆虫的肠道内。不同醋酸菌的耐酸性能存在明显差异，如葡糖醋杆菌属的菌株耐酸能力普遍高于醋杆菌属的菌株；而saccharibacter和asaia属的菌株却不能在含有醋酸的培养基上生长。目前关于醋酸菌耐酸性分子机制的认识主要来自于蛋白组学、转录组学和基因组学的研究，主要包括以下5个方面：(1)醋酸的外排系统；(2)醋酸在胞内的同化作用；(3)关键酶的作用；(4)细胞应激响应；(5)细胞包被结构修饰等。
3.醋酸菌最显著的特征是对醇、糖类等的不完全氧化特性，前者被应用于食醋的生产，而后者被应用于糖酸类如葡萄糖酸等生产的过程中。此外，醋酸菌的不完全所氧化特性还被广泛用于生物电池研究开发中。而木醋醋酸菌产生的细菌纤维素则是一种优良的生物材料，因此醋酸菌具有广泛的工业价值。
4.现有技术中，酵母菌、乳酸菌等常见菌均可采用工业化生产制备得到相应冻干菌粉，但是还没有产业化水平制备得到高活菌数、高纯度的醋酸菌冻干菌粉，只能采用醋酸菌传代式培养，或是采用醋胚发酵剂培养。其中，传代式培养与直投式发酵生产相比，大大增加了工艺的复杂，不利于醋酸菌产品的标准化，而醋胚发酵剂虽然含有醋酸菌，但是其发酵的醋酸菌种类较少，而且醋酸菌活菌数极低，一般小于1
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cfu/g，并且发酵剂没有进行杂菌控制，里面含有大量的芽孢杆菌、粪球菌等等，难以保证发酵产品的品质。
5.现阶段高纯度、高活菌数的醋酸菌发酵剂还处于空白阶段，还没有活菌数大于1
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cfu/g的醋酸菌冻干发酵剂产品，这主要因为醋酸菌与乳酸菌相比，其发酵过程中积累的醋酸比乳酸的杀伤力更强，醋酸菌在发酵过程中受到损伤后，在冻干的过程中极易死亡，很难保证醋酸菌冻干直投式发酵剂的生产。例如，专利cn103820368b公开了一种醋酸菌冻干菌粉的制备方法及用途，其醋酸菌冻干菌粉中的含菌量为1.1
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cfu/g。
6.因此，亟需提供一种高活菌数醋酸菌冻干粉及其制备方法，解决醋酸菌大规模产业化生产的需求。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种醋酸菌冻干粉及其制备方法。通过本发明所述的发酵过程控制和冻干保护剂优化，可以实现高活菌数醋酸菌发酵剂的生产。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
9.本发明提供了一种通过缓冲体系降低醋酸菌活力损伤的培养方法，所述的培养方
法包括以下步骤：
10.醋酸菌接种后发酵培养采用酸度调节体系进行缓冲，当体系ph降低到4.5，补充碱性物质进行ph控制，使ph维持在4.4
‑
5.0。
11.具体地，所述的酸度调节体系，包括但不限于磷酸二氢钾/钠、磷酸氢二钾/钠、醋酸钠等组成的缓冲体系，降低前期产酸对菌体的损伤。
12.具体地，所述的碱性物质包括但不限于氨水或者氢氧化钠。
13.另一方面，本发明提供了一种醋酸菌冻干粉的冻干保护剂，所述的冻干保护剂包括海藻糖2
‑
20％、蔗糖2
‑
10％、麦芽糊精2
‑
10％、甘油1
‑
3％、阿拉伯胶1
‑
5％，冻干保护剂的ph为5.0
‑
5.5。
14.具体地，所述的海藻糖与蔗糖的总量与甘油的重量比为4
‑
10:1。
15.具体地，所述的冻干保护剂还包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、维生素c盐等物质。
16.又一方面，本发明提供了一种醋酸菌冻干粉的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
17.(1)按上述通过缓冲体系降低醋酸菌活力损伤的培养方法进行乳酸菌的培养或发酵，至od值达到5
‑
10；
18.(2)将上述步骤(1)培养得到的醋酸菌菌液离心，收集菌泥；
19.(3)将上述步骤(2)离心得到的菌泥与上述冻干保护剂混合，得到混合液，将混合液进行冷冻干燥，得到醋酸菌冻干粉。
20.本发明对醋酸菌培养或发酵所用的培养基及步骤不做特别限制，可以为本领域技术人员熟知的培养基及步骤，但是在培养或发酵过程中需采用本发明所述的通过缓冲体系降低醋酸菌活力损伤的培养方法。
21.具体地，所述的步骤(3)中菌泥与冻干保护剂的质量比为1:1
‑
2。
22.具体地，所述的步骤(3)中冷冻干燥在冷冻干燥机内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥；所述的预冻为控制层板1h内降温至
‑
45到
‑
50℃，保持3
‑
4h；所述一次干燥为控制层板2h升温至
‑
25到
‑
30℃，保持至一次干燥终点；所述二次干燥为控制层板1h升温至22
‑
30℃，保持至二次干燥终点。
23.具体地，所述的醋酸菌冻干粉活菌数大于1
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cfu/g。
24.具体地，所述的醋酸菌包括但不限于巴士醋酸、木醋杆菌、食糖驹形杆菌、木醋杆菌、葡萄酸醋酸杆菌等。
25.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
26.本发明采用缓冲体系，通过培养基的两步ph控制，以降低培养过程中醋酸菌的活力损伤，与冻干保护剂协同作用以提高醋酸菌冻干粉的活菌数，有助于实现高活菌数醋酸菌发酵剂的工业化生产，满足醋酸菌的标准化、产业化需要。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
29.菌种来源说明：实验中涉及的乳酸菌来自玉园牌活性醋酸菌、沪酿1号等市售可得的低活菌数醋酸菌发酵剂。
30.实施例1葡糖酸醋酸杆菌菌粉制备
31.1.试剂
32.(1)种子培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l、酵母粉20g/l、k2hpo42.5g/l、kh2po42.5g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温
‑
80 1ml/l。
33.(2)发酵培养基：葡萄糖50g/l，蛋白胨10g/l、酵母粉20g/l、k2hpo42.5g/l、kh2po42.5g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温
‑
80 1ml/l。
34.(3)冻干保护剂：海藻糖10％、蔗糖5％、麦芽糊精5％、甘油2％、阿拉伯胶2％，冻干保护剂的ph为5.0。
35.2.实验方法：
36.取醋酸菌保藏甘油管按照2％的接种量接种摇瓶种子培养基，30℃恒温培养16h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中培养，前期不补加碱，利用培养基体系中的缓冲物质，减缓因产酸导致的ph降低，30℃恒温培养至ph降低到4.5，开始补碱，用氢氧化钠控制ph4.5，直到残糖剩余0.5％，离心，将菌泥与冻干保护剂1:1(w/w)混合均匀，重悬液的ph调节至5.5，进行冷冻干燥。包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至
‑
45℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.3h升温至
‑
25℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h，即得到醋酸菌冻干粉，检测其活菌数。
37.实施例2
38.本实施例2与实施例1相比，区别在于，本实施例醋酸菌种子和发酵培养基不添加缓冲盐(k2hpo4、kh2po4)，其余操作步骤与实施例1一致。
39.实施例3
40.本实施例3与实施例1相比，区别在于，当发酵过程中体系ph降低到4.5时，用氢氧化钠控制ph稳定在5.0左右，其余操作步骤与实施例1一致。
41.实施例4
42.本实施例4与实施例3相比，区别在于，本实施例醋酸菌种子和发酵培养基不添加缓冲盐，其余操作步骤与实施例3一致。
43.实施例5
44.本实施例5与实施例1相比，区别在于，当发酵过程中体系ph降低到4.5时，用氢氧化钠控制ph稳定在5.5左右，其余操作步骤与实施例1一致。
45.实施例6
46.本实施例6与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖2％、蔗糖10％、麦芽糊精10％、甘油3％、阿拉伯胶5％，冻干保护剂的ph为5.0。其余操作步骤与实施例1一致。
47.实施例7
48.本实施例7与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖20％、
蔗糖2％、麦芽糊精2％、甘油1％、阿拉伯胶1％，冻干保护剂的ph为5.0。其余操作步骤与实施例1一致。
49.实施例8
50.本实施例8与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖15％、蔗糖15％、麦芽糊精5％、甘油2％、阿拉伯胶2％，冻干保护剂的ph为6.0。其余操作步骤与实施例1一致。
51.实施例9
52.本实施例9与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂：海藻糖10％、蔗糖5％、麦芽糊精5％、甘油2％、阿拉伯胶2％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.2％，维生素c钠2％，冻干保护剂的ph为5.0。
53.实施例10巴士醋酸菌冻干菌粉制备
54.1.试剂
55.(1)种子培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l、酵母粉20g/l、k2hpo42.5g/l、kh2po42.5g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温
‑
80 1ml/l。
56.(2)发酵培养基：葡萄糖50g/l，蛋白胨10g/l、酵母粉20g/l、k2hpo42.5g/l、kh2po42.5g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温
‑
80 1ml/l。
57.(3)冻干保护剂：海藻糖10％、蔗糖8％、麦芽糊精8％、甘油2％、阿拉伯胶3％，冻干保护剂的ph为5.5。
58.2.实验方法：
59.取醋酸菌保藏甘油管按照2％的接种量接种摇瓶种子培养基，30℃恒温培养16h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中培养，前期不补加碱，利用培养基体系中的缓冲物质，减缓因产酸导致的ph降低，30℃恒温培养至ph降低到4.5，开始补碱并控制ph4.5，直到残糖剩余0.5％，离心，将菌泥与冻干保护剂1:1(w/w)混合均匀，重悬液的ph调节至5.5，进行冷冻干燥。包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至
‑
45℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.3h升温至
‑
25℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h，即得到醋酸菌冻干粉，检测其活菌数。
60.实施例11
61.本实施例11与实施例10相比，区别在于，本实施例醋酸菌种子和发酵培养基不添加缓冲盐(k2hpo4、kh2po4)，其余操作步骤与实施例9一致。
62.实验例1
63.1.冻干菌粉活菌数检测：称量1g冻干菌粉加入9ml含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1ml菌液至9ml生理盐水中进行梯度稀释，取100μl稀释液涂布于mrs固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于30℃恒温培养箱中培养72h后取出计数。
64.2.缓冲盐和ph控制对醋酸菌影响
65.缓冲盐和ph控制对醋酸菌发酵培养及冻干菌粉中活菌数的影响如下表1所示。
66.表1缓冲盐和ph控制对醋酸菌影响
[0067][0068]
3.存活率检测
[0069]
具体检测结果如下表2所示。
[0070]
表2乳酸菌存活情况
[0071][0072][0073]
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。