一种角质细胞生长因子活性多肽及其应用

1.本发明涉及一种角质细胞生长因子活性多肽及其应用，属于角质细胞生长因子活性多肽技术领域。


背景技术：

2.创面愈合是一个组织缺损修复的复杂过程，异常的创面愈合会导致慢性难愈性创面，是临床上亟待解决的难题。局部应用生长因子有助于促进创面愈合，但是目前应用的生长因子产品价格昂贵,生物半衰期短，稳定性差，易受到创面局部环境的影响，难以达到预期的治疗效果，限制了其广泛应用。
3.目前多肽的研究及应用达到了空前繁荣的程度。相对于天然蛋白,其具有分子量较小,作用单一,副作用小,无免疫原性,稳定性好,可溶性好和可大量生产等优点。噬菌体随机肽库(phage peptide library)是呈现特定长度的各种不同外源性多肽的噬菌体集合物，已广泛应用于受体阻断剂及激动剂、多肽疫苗和药物的研发等多个领域。
4.角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，简称kgf)是一种上皮细胞特异性的生长因子，与上皮创面愈合关系密切。但目前，尚未有角质细胞生长因子用于制备活性多肽凝胶剂的相关报道。
5.鉴于此，有必要提供一种角质细胞生长因子及其应用，以解决现有技术的不足。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一，是提供一种角质细胞生长因子活性多肽。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种角质细胞生长因子活性多肽，其核苷酸序列如seq id no.54所示，其氨基酸序列如seq id no.55所示。
8.gaactaattctggaaaaccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggg(seq id no.54)。
9.elilenhyntyasakwthngg(seq id no.55)。
10.本发明的角质细胞生长因子活性多肽的有益效果是：
11.1、本发明应用噬菌体随机多肽库筛选kgf关键序列，获得kgf基因序列，可于体外直接合成kgf活性多肽，短期内可以大量合成，大大降低了生产成本。
12.2、本发明可以调整肽链的序列结构，修饰肽链，改善活性多肽的空间构像及稳定性；并且生成不需要借助于动物载体，避免了疾病的传播，避免了伦理学问题。这样避免了传统生长因子稳定性差、成本高和易降解等缺陷，具备较好的稳定性、免疫原性和安全性。
13.本发明的目的之二，是提供上述角质细胞生长因子活性多肽的应用。
14.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述角质细胞生长因子活性多肽在制备治疗创面愈合的药物中的应用。
15.本发明的角质细胞生长因子活性多肽的应用的有益效果是：
16.上述角质细胞生长因子活性多肽可以用于制备治疗创面愈合的药物，可以促进创
面愈合，有效降低炎症，提高治愈效率和效果，同时对人体无毒副作用。
17.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
18.进一步，所述治疗创面愈合的药物包括有效量的角质细胞生长因子活性多肽和药学上可接受的辅料。
19.采用上述进一步的有益效果是：治疗创面愈合的药物采用上述成分，可以有效地治疗创面愈合，治疗效果明显，并且毒副作用小。
20.更进一步，所述治疗创面愈合的药物的剂型为外用的半固体制剂、外用的固体制剂和外用的液体制剂中的任意一种。
21.采用上述更进一步的有益效果是：采用上述制剂类型，更便于患者使用。
22.更进一步，所述外用的半固体制剂为膏剂。
23.更进一步，所述膏剂为凝胶剂或乳剂。
24.采用上述更进一步的有益效果是：采用凝胶剂或乳剂，避免了传统生长因子稳定性差、成本高、易降解等缺陷，具备促进创面愈合的作用，可以用于制备糖尿病慢性创面、浅表烧伤、部分皮层烧伤、供皮区伤口、手术后伤口以及皮肤擦伤等创面愈合的药物。
25.更进一步，所述凝胶剂由角质细胞生长因子活性多肽和基质组成，其中，所述角质细胞生长因子活性多肽的剂量为2000iu/克凝胶基质-10000iu/克凝胶基质。
26.采用上述更进一步的有益效果是：采用上述剂量，可以达到较高的治愈率和理想的疗效。
27.更进一步，所述角质细胞生长因子活性多肽的剂量为8000iu/克凝胶基质。
28.采用上述更进一步的有益效果是：采用上述剂量，可以达到更高的治愈率和理想的疗效。
29.更进一步，所述凝胶基质包括伯格沙姆407、卡波姆、对羟基苯甲酸甲酯和肝素的混合物。
30.采用上述更进一步的有益效果是：在凝胶剂中，伯格沙姆407作为凝胶基质的主要成分，卡波姆作为保湿剂，对羟基苯甲酸甲酯作为防腐剂，肝素钠作为稳定剂。
具体实施方式
31.以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
32.实施例1：kgf活性多肽序列的筛选
33.以人kgf单克隆抗体包被96孔板，添加噬菌体随机七肽库(购自neb公司，美国)4℃孵育过夜，tbst洗板10次，洗脱缓冲液(0.2mol/l的glycine-hcl，ph值为2.2，0.1％bsa)洗脱结合的噬菌体，中和缓冲液(1mol/l的tris-hcl，ph值为9.1)快速中和洗脱物。
34.应用e.coli er2738宿主菌对洗脱物进行扩增用于下一轮筛选。同样方法对每轮的洗脱物再行三轮筛选。对第四轮的洗脱物进行滴度测定，随机挑选噬菌体蓝斑，扩增，调整至2.0
×
10
13
pfu/ml。
35.应用elisa方法和人kgf免疫测定试剂盒(购自r&d公司，美国)，按试剂盒操作说明检测单克隆噬菌体的结合力。分别测定波长为450nm和570nm的光密度值od，计算两者的差值，得到每孔光密度值od＝od
450
－od
570
，如表1所示
36.od值结果显示，各单克隆噬菌体与特异性抗体具有良好的结合性。
37.表1 样本光密度值
38.编号光密度值编号光密度值编号光密度值编号光密度值10.15580.201150.125220.11020.11890.111160.140230.09030.139100.129170.160240.09140.103110.127180.105250.09750.104120.388190.104260.08660.200130.136200.135
ꢀꢀ
70.101140.127210.106
ꢀꢀ
39.应用碘化物缓冲液法提取噬菌体dna，送北京华大基因有限公司，进行染料示踪的双脱氧法自动测序，测序获得26个不同的碱基序列。如表2所示。
40.表2 26个特异性的碱基序列及对应的氨基酸序列
41.[0042][0043]
应用核酸blast系统检测模拟肽dna的相似性，将上述26个筛选出来的kgf短肽的核苷酸序列逐一与seq id no.53所示的kgf核苷酸序列进行比对，发现特异性的核苷酸序列在kgf核苷酸序列集中出现于多个部位，选取这些相对集中的核苷酸序列，如seq id no.54所示，其对应的氨基酸序列如seq id no.55所示。
[0044]
atgcacaaatggatactgacatggatcctgccaactttgctctacagatcatgctttcacattatctgtctagtgggtactatatctttagcttgcaatgacatgactccagagcaaatggctacaaatgtgaactgttccagccctgagcgacacacaagaagttatgattacatggaaggaggggatataagagtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtacctgaggatcgataaaagaggcaaagtaaaagggacccaagagatgaagaataattacaatatcatggaaatcaggacagtggcagttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtgaattctatcttgcaatgaacaaggaa
ggaaaactctatgcaaagaaagaatgcaatgaagattgtaacttcaaagaactaattctggaaaaccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggggaaatgtttgttgccttaaatcaaaaggggattcctgtaagaggaaaaaaaacgaagaaagaacaaaaaacagcccactttcttcctatggcaataact(seq id no.53)。
[0045]
gaactaattctggaaaaccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggg(seq id no.54)。
[0046]
elilenhyntyasakwthngg(seq id no.55)。
[0047]
实施例2：kgf活性多肽的合成
[0048]
将实施例1筛选获得的kgf多肽序列，送武汉明皓生物科技有限公司进行kgf活性短肽的合成，纯化为98％纯度，然后对多肽的c端进行酰胺化封闭，增强活性多肽的稳定性；对多肽的n端进行罗丹明激光染料标记，用于鉴定活性多肽的与表皮细胞的亲和力，检测其是否可以与表皮细胞相结合。制备成冻干粉，于-20℃保存。
[0049]
实施例3：kgf活性多肽的体内外实验
[0050]
采用kgf活性多肽对培养的表皮细胞进行干预，因为kgf活性多肽以罗丹明激光染料进行了标记，免疫荧光检测结果显示kgf活性多肽能够与表皮细胞上的特异性受体kgfr相结合。
[0051]
进一步将kgf活性多肽与人表皮细胞进行共培养，进行体外实验，用cck-8法检测kgf活性多肽对表皮细胞增殖的影响，结果显示kgf活性多肽能够促进表皮细胞增殖，并呈浓度依赖性。用rt-pcr法和western-blot法检测表皮细胞上特异性受体kgfr的表达水平，结果显示该kgf活性多肽可促进表皮细胞表达kgfr。
[0052]
体外实验，设置空白对照组、kgf活性多肽组和kgf生长因子组，分别与人表皮细胞进行共培养。采用cck-8法，发现与空白对照组相比，kgf活性多肽组可促进细胞增值，并具有显著差异(p《0.05)，并呈剂量依赖性，详见表3。
[0053]
表3 cck-8检测增殖的表皮细胞的光密度值
[0054][0055]
体内应用链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型，于大鼠背部制备直径2cm的圆形创面，并定期对创面局部分组干预，不同组的干预分别为kgf活性多肽凝胶组、kgf生长因子组和
空白对照组。伤后14d进行拍照，记录创面未愈合面积，计算创面愈合率。并对创面组织进行组织病理学及pcr检测，结果显示kgf活性多肽凝胶组与空白对照组相比，kgf活性多肽凝胶组的创面愈合率为85％，空白对照组为60％，并且有显著性差异，表明kgf活性多肽凝胶能够显著性地促进创面愈合。因此，本发明的角质细胞生长因子活性多肽可以用于制备治疗创面愈合的药物，可以促进创面愈合，有效降低炎症，提高治愈效率和效果，同时对人体无毒副作用。
[0056]
所述治疗创面愈合的药物包括有效量的角质细胞生长因子活性多肽和药学上可接受的辅料。
[0057]
所述治疗创面愈合的药物的剂型为外用的半固体制剂、外用的固体制剂和外用的液体制剂中的任意一种。
[0058]
所述外用的半固体制剂为膏剂。
[0059]
所述膏剂为凝胶剂或乳剂。
[0060]
所述凝胶剂由角质细胞生长因子活性多肽和基质组成，其中，所述角质细胞生长因子活性多肽的剂量为2000iu/克凝胶基质-10000iu/克凝胶基质。所述角质细胞生长因子活性多肽的剂量为8000iu/克凝胶基质。
[0061]
所述凝胶基质包括伯格沙姆407、卡波姆、对羟基苯甲酸甲酯和肝素的混合物。
[0062]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。