促进植物器官产生红色色泽的基因PpHSP20-like1及其应用的制作方法

促进植物器官产生红色色泽的基因pphsp20
‑
like1及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及促进植物器官产生红色色泽的pphsp20
‑
like1基因及其应用。


背景技术：

2.果肉颜色是果树果实的一个重要农艺性状，是评价果实品质的关键指标之一。桃(prunus persica)原产中国，分布广泛，种质资源丰富。桃果肉颜色有白、黄、绿、红、紫五种。红肉桃是桃亚属植物中的特异资源，与非红肉桃相比，红肉桃不仅具有特殊的视觉冲击力和感官吸引力，而且其富含的花色苷和酚类物质具有抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病等对人体健康非常有益的功能。随着人们对果品多样化、功能化需求的不断提高，红肉桃的营养价值日益受到重视，对优质红肉桃的需求不断上升。但是现有红肉桃资源及品种普遍存在风味偏酸、果形偏小等缺陷，亟待选育优质红肉桃品种。当前，桃红肉色泽形成的分子机制虽然在个别红肉桃种质资源中有了一定进展，但是红肉桃种质资源多样、遗传规律复杂、一些种质间存在遗传背景差异，其余红肉桃种质资源的红肉色泽形成分子机制仍不清楚，在一定程度上制约了利用现代分子标记技术提高优质红肉桃育种效率。
3.热激蛋白(heat shock protein,hsp)普遍存在于植物、动物以及人、果蝇等生物体中。根据分子量大小以及氨基酸序列的同源性，热激蛋白被分成hsp110、hsp90、hsp70、小分子质量hsp(small heat shock protein，缩写为shsp)等多个家族。因shsp家族蛋白分子量大多在15～22kda，故也被称之为hsp20家族蛋白。hsp20家族蛋白的典型特征是有一个保守的α
‑
crystalline结构域(acd)或具有一个与acd结构域非常相似的被称为acd
‑
like或hsp20
‑
like的结构域。也有一些文献把含有hsp20
‑
like结构域的hsp20蛋白分为单独的一类，称为hsp20
‑
like家族。
4.hsp20蛋白能够阻止蛋白变性，保持细胞正常的生理活性，使细胞免受热胁迫伤害。hsp20蛋白作为分子伴侣，其功能研究多基于草本植物等实验材料，在正常生长条件下和应激条件(高温、寒冷、干旱、病毒侵袭及化学刺激等)下的多种多样的细胞路径中起着复杂且重要的作用，例如细胞增殖、分化、迁移、信号转导、细胞骨架、纤毛动力学、免疫学、病原抵抗等。而在木本植物，尤其桃中的研究罕见。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一个正调控花色苷合成的pphsp20
‑
like1基因，其可以促进植物器官红色色泽的形成，如促进植物拟南芥叶和花萼、桃果肉红色色泽的形成。
6.本发明的另一个目的是提供pphsp20
‑
like1基因及其编码蛋白序列、过表达载体、宿主菌以及该pphsp20
‑
like1基因在促进植物器官红色中的应用。本发明构建pphsp20
‑
like1植物过表达载体，通过蘸花法异源转化拟南芥和同源瞬时转化白肉桃果实进行其生物学功能的验证。表明本发明克隆的pphsp20
‑
like1基因具有促进如果实红肉色泽形成的
功能。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明利用克隆技术从桃地方品种
‘
野鸡红’克隆得到一个与拟南芥hsp20
‑
like同源的基因pphsp20
‑
like1。pphsp20
‑
like1核苷酸序列如seq id no.1所示，包含1179个碱基，编码393个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.2所示，分子量为98.24997kda，等电点为5.07，亚细胞定位在细胞核。
9.本发明所述的基因pphsp20
‑
like1在促进植物器官产生红色色泽中的应用。
10.本发明所述的基因pphsp20
‑
like1在促进植物拟南芥叶和花萼、桃果肉红色中的应用。
11.本发明所述含基因pphsp20
‑
like1的表达载体在促进植物器官产生红色色泽中的应用。
12.本发明所述的表达载体的构建包括如下步骤：
13.以红肉桃品种
‘
野鸡红’的cdna为模板，设计引物，扩增得pphsp20
‑
like1基因片段，pcr产物纯化后连接到pentr/d
‑
topo载体，构建的质粒命名为pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1；通过gateway方法用lr酶将pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1连接到r05载体上，构建的质粒命名为r05
‑
pphsp20
‑
like1。
14.本发明设计克隆上述基因pplike1pphsp20
‑
like1核苷酸开放阅读框序列引物对，其碱基序列如下所示：
15.p1:5
’‑
caccatggaagatgaccctcctaaaatgtccgtc
‑3’
16.p2:5
’‑
ctcgtcttttatgataactccttcaaaaat
‑3’
。
17.利用含有重组载体r05
‑
pphsp20
‑
like1的农杆菌异源转化拟南芥和同源转化白肉桃果实，获得拟南芥红叶、红色花萼；桃果实红肉表型，验证其具有促进红色色泽形成的功能。
18.含有上述基因的重组表达载体、转基因重组菌。
19.上述的基因或上述的蛋白在提高优质红肉桃育种效率方面的应用。
20.上述的基因或上述的蛋白在鉴定红肉桃资源、基因分型、分子标记方面的应用。
21.本发明从红肉桃品种
‘
野鸡红’果实中克隆得到的功能基因pphsp20
‑
like1，并实现了其在促进植物器官产生红色色泽中的应用，尤其是促进果肉红色色泽形成方面的应用。申请人利用植物基因克隆技术从
‘
野鸡红’果实中克隆得到一个新基因pphsp20
‑
like1。pphsp20
‑
like1属于hsp20基因家族成员，具有一个与acd结构域非常相似的被称为acd
‑
like或hsp20
‑
like的结构域，在果实中表达。将pphsp20
‑
like1连接到含有gfp标签的r05载体上，并在烟草叶中瞬时转化，结果显示pphsp20
‑
like1位于细胞核，是一个核蛋白。同时把r05
‑
pphsp20
‑
like1异源转化拟南芥和同源瞬时转化白肉桃果实，结果显示：阳性株叶片花色苷含量和pphsp20
‑
like1基因相对表达水平显著高于野生型，阳性株叶片和花萼呈红色，高分辨率质谱(lc
‑
qtof/ms)分析表明阳性株叶片含有花色苷矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷和矢车菊素
‑3‑
芸香糖苷；与对照相比，白肉桃注射部位乳白色果肉变成红色。pphsp20
‑
like1促进红色色泽产生，在植物基因工程以及红肉桃育种的基因工程改良中具有广阔的应用前景。
22.本发明涉及一个赋予植物器官红色色泽的pphsp20
‑
like1基因。pphsp20
‑
like1的功能研究揭示其表达调控机理以及作用机制，可应用于植物基因工程以及红肉桃育种的基
因工程改良中，也可以利用本发明的基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高如桃果果实红肉色泽改良效率。
23.本发明通过红肉桃地方品种
‘
野鸡红’品种与多个非红肉桃分别进行杂交、qtl定位、基因组重测序、转录组测定等分析，发现一个果实红肉色泽性状相关基因pphsp20
‑
like1，该基因与拟南芥hsp20
‑
like chaperones superfamily protein高度同源(登录号at1g20870.1)，e
‑
value是2e
‑
31
；与桃
‘
lovell’参考基因组序列中的prupe.5g005900.1(xm_007209161.2)相似度最高，达99.92％，以prupe.5g005900.1序列为参考，设计引物从红肉桃品种
‘
野鸡红’果肉中将pphsp20
‑
like1基因克隆，并将该基因转化拟南芥和同源瞬时转化白肉桃果实，获得的转基因拟南芥植株叶片和花萼均呈现红色、转基因桃果肉红色。桃果肉色泽性状相关基因pphsp20
‑
like1的分离可以进一步丰富果实品质性状基因资源，对其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。
24.有益效果：与现有技术相比，本发明具有的优点和效果：
25.(1)本发明首次克隆到促进植物器官产生红色色泽的pphsp20
‑
like1基因该基因可以使得桃果肉红色色泽形成，为提高红肉桃育种效率提供了新的思路，为实现分子育种和节省大量人力、物力、地力等成本提供了基础。
26.(2)通过异源转化拟南芥和同源瞬时转化白肉桃，获得红肉色泽表型，功能验证结果表明本发明克隆的基因具有促进红色色泽产生的功能。
27.(3)pphsp20
‑
like1基因与红肉性状形成相关，将pphsp20
‑
like1与构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因在转基因植株中过表达后，与野生型和空载体对照株相比，叶片和花萼显现红色；转化白肉桃果实，与对照相比，白肉桃注射部位乳白色果肉变成红色。pphsp20
‑
like1表达量显著提高。pphsp20
‑
like1的分离可以进一步丰富果肉红色色泽基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。
28.(4)本发明有助于更好地了解果实红肉色泽形成的分子作用机制。pphsp20
‑
like1的克隆为进一步了解红肉色泽相关基因编码蛋白之间互作、花色苷代谢信号传导通路奠定基础。可以利用该基因的转基因植株进一步分析pphsp20
‑
like1是如何传递信号以及传导过程，从而获得pphsp20
‑
like1参与果肉花色苷信号传导通路的机制。pphsp20
‑
like1的分离以及功能鉴定为研究果肉红色色泽基因的作用机制奠定基础。
29.(5)本发明应用于果肉红色色泽育种，针对pphsp20
‑
like1开发分子标记，为在苗期淘汰掉非目标性状小苗奠定基础，大幅提高育种效率，在果实红肉转基因育种中有较大的应用价值。
附图说明
30.图1为
‘
野鸡红’品种果实发育四个阶段的红肉表型图。
31.图2为提取的
‘
野鸡红’成熟果实总rna的琼脂糖凝胶电泳图。
32.图3为扩增pphsp20
‑
like1基因全长pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中m是marker分子量标准，条带从上至下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1和泳道2均是pphsp20
‑
like1全长。
33.图4为pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1菌液pcr鉴定阳性克隆琼脂糖凝胶电泳图，其中m是marker分子量标准，条带从上至下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、
750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1至泳道8是pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1菌液pcr产物1至8号管。
34.图5为pphsp20
‑
like1的亚细胞定位分析；采用转盘式激光共聚焦显微镜(ultra view vox，usa)，20x物镜情况下拍照。图上方英文标出了不同光质设置，从左至右分别是明场(bright field)、绿色荧光(pphsp20
‑
like1
‑
gfp,488nm)、红色荧光(right field,561nm)、以上三种情况重合在一起(merge)的结果图。
35.图6为pcr检测pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1转基因拟南芥阳性株琼脂糖凝胶电泳图，其中图a，m是marker分子量标准，条带从上至下依次为4500bp、30000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；泳道1至泳道4是pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1转基因株编号1
‑
4号，wt是野生型对照株；图b中m是marker分子量标准，条带从上至下依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道5和泳道6是pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1转基因株5和6号苗，泳道空载体是侵染r05空载体株。
36.图7为拟南芥转基因阳性株系和对照株叶片表型；wt代表野生型对照，空载体代表空载体对照，oe1至oe5分别代表过表达株系1至5号。a：整体颜色表型；b：茎上花萼颜色表型；c：放大的茎上花萼颜色表型；d：顶花颜色表型。
37.图8为拟南芥转基因阳性株系和对照株叶片中pphsp20
‑
like1的相对表达水平；wt代表野生型对照叶片中pphsp20
‑
like1的相对表达水平，空载体代表空载体对照株叶片中pphsp20
‑
like1的相对表达水平，oe1至oe5分别代表pphsp20
‑
like1过表达株系1至5号叶片中pphsp20
‑
like1的相对表达水平。rpii为看家基因；以oe1株系叶片中pphsp20
‑
like1表达水平为1的情况下，其他株系及对照株中的相对表达水平。
38.图9为hplc检测过表达pphsp20
‑
like1拟南芥阳性株系和野生型对照株叶片中花色苷成分；a图代表野生型对照株的结果，b图代表转基因阳性株的结果；wt代表野生型对照株；oe代表pphsp20
‑
like1过表达株。
39.图10为lc
‑
qtof/ms检测和分析拟南芥转基因阳性株系叶片中花色苷成分；a代表矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷质谱tofms二级图，b代表矢车菊素
‑3‑
芸香糖苷质谱tofms二级图。
40.图11为pphsp20
‑
like1过表达白肉桃果肉色泽和对照桃果肉色泽表型；oe1和oe2分别代表2个白肉桃瞬时过表达pphsp20
‑
like1的果肉色泽表型，ck1代表不含pphsp20
‑
like1基因的空载体对照的果肉色泽表型，ck2代表不注射任何液体对照的果肉色泽表型。
具体实施方式
41.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
42.下述实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用到的实验耗材，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
43.所用的引物合成和测序均由通用生物系统有限公司合成。
44.本发明中品种
‘
野鸡红’由江苏省农业科学院提供(许建兰，马瑞娟，张斌斌，丁辉，严娟，俞明亮.不同肉色桃杂交后代主要性状遗传规律研究.果树学报，2019，36(1)：21
‑
30)。
45.瞬时表达品种
‘
小红花’由江苏省农业科学院提供(沈志军，桃初级核心种质、关联
分析和红肉性状的图谱定位，2013)。
46.野生型拟南芥(arabidopsis thaliana)col
‑
0种子和野生型本氏烟草(nicotiana benthamiana)种子均由江苏省农业科学院提供。
47.实施例1
48.pphsp20
‑
like1克隆以及序列分析
49.桃果实红肉色泽相关蛋白pphsp20
‑
like1编码基因pphsp20
‑
like1的克隆。
50.以参考基因组prupe.5g005900.1序列为参考，设计引物对(上游引物p1和下游引物p2)用于从红肉桃
‘
野鸡红’(图1)果肉中扩增果实红肉色泽相关like1pphsp20
‑
like1基因。
51.按照minibest rna提取试剂盒(minibest rna kit，宝生物工程(大连)有限公司)说明书方法提取桃
‘
野鸡红’成熟果实总rna(图2)。采用cdna第一链合成试剂盒(primescript
tm
ii 1st strand cdna synthesis kit，宝生物工程(大连)有限公司)按说明书方法反转录成cdna，并稀释10倍，
‑
20℃保存。以此cdna为模板，采用上游引物p1(5
’‑
caccatggaagatgaccctcctaaaatgtccgtc
‑3’
)和下游引物p2(5
’‑
ctcgtcttttatgataactccttcaaaaat
‑3’
)进行pcr扩增。每管pcr反应体系50μl，包含2x high
‑
fidelity master mix 25μl，上下游引物各1μl(10μm)，cdna 2μl，ddh2o 21μl。pcr反应程序为：98℃预变性1min，98℃变性15s，55℃退火15s和72℃延伸20s，72℃2min，35个循环，4℃保存，合计3管。
52.取2管pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外凝胶成像仪看到约为1179bp的条带(图3)，与预期大小一致。用pcr产物纯化试剂盒(takara minibest dna fragment purification kit ver4.0，宝生物工程(大连)有限公司)回收相同的另一管pcr产物。将该回收纯化dna片段与克隆载体质粒pentr/d
‑
topo(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)连接，得到重组质粒pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1。将重组质粒pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1转化大肠杆菌dh5a感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，用卡那霉素(50.0mg
·
l
‑1)标记筛选阳性克隆，并进行菌液pcr鉴定(上游引物5
’‑
tgtaaaacgacggccagt
‑3’
和下游引物p2:5
’‑
ctcgtcttttatgataactccttcaaaaat
‑3’
)，得到含有预期片段大小的条带(图4)，并提取阳性重组质粒送通用生物系统有限公司测序。测序比对结果表明pphsp20
‑
like1 orf长度是1179bp，将该基因命名为pphsp20
‑
like1，序列如seq id no：1所示，其与参考基因组
‘
lovell’有1个snp变异。pphsp20
‑
like1基因编码的蛋白序列如seq id no：2所示。以上实验步骤均按试剂盒说明书进行操作。
53.seq id no：1
54.atggaagatgaccctcctaaaatgtccgtcaatccatcgtttgccgaccagctttttctactgaacttcgtaatgggaaattatttgggccctgatgtcacgtttgataacctcgaatgttcagcatttcaaaggatagctgaaggttcacctccgtatatgtcaagttatttggggccttcttatgttagtgtgtctcttttggagggtttatattactatctcttgagaaatgttcaccctagtctcattttgagaccagaaatgttgcataagtatttaaagggcagcctacctttgccaaattcagggctgacgaaagacagttggcagttcacaaattttttccctttggatcttcatgaacagatatggtacccagaaagcttcagaattgttaaggggattctttttattgatgatcctgttacatcatgtatgaaagaggacgatctggaaaagttcaaatctttatcaggtataaataacatgaaaattgatatagatgaagccatacgatatcaacacaagtacctggataatggggaaagtaagacgaattgcttgaatgatgattgcaatttcacaaagacagaatttttttccaa
tggaaatggaaattggtcggaaagatttcagcaaaaatataagagaaggtgcttctctcattctccatcaaagccagcatttccccaagttgttactacaaaacatttaagcaaatatggagcttcatggaagacctgcaaaccagatggacctgtgttcatgccccttatctctgttcctaatttggaagaatgtacttcagattcttctgttgttttgtctgggactgccaggaaaggggtagttgggccacctgttggtgttgtggacattggtgttagcaaggctgcatattacttccgggttgctctaccaggggtcaggaaggatttttgtcaattcaattgtgagattgaatctaatggcaagattcatctccaaggcgtcacaagtggtggaaatcccataaggaaacgttcgcgtgtattccaaatgaaattgcagcaattatgcccacccggaccattcacgctctcgttcagccttccaggacctgttgatccaaggctctttgcaccaaattttggacctgatggcatttttgaaggagttatcataaaagacgagtga
55.seq id no：2meddppkmsvnpsfadqlfllnfvmgnylgpdvtfdnlecsafqriaegsppymssylgpsyvsvslleglyyyllrnvhpslilrpemlhkylkgslplpnsgltkdswqftnffpldlheqiwypesfrivkgilfiddpvtscmkeddlekfkslsginnmkidideairyqhkyldngesktnclnddcnftkteffsngngnwserfqqkykrrcfshspskpafpqvvttkhlskygaswktckpdgpvfmplisvpnleectsdssvvlsgtarkgvvgppvgvvdigvskaayyfrvalpgvrkdfcqfnceiesngkihlqgvtsggnpirkrsrvfqmklqqlcppgpftlsfslpgpvdprlfapnfgpdgifegviikde*
56.实施例2
57.构建pphsp20
‑
like1基因过表达载体
58.采用gateway方法将pentr/d
‑
topo:pphsp20
‑
like1重组质粒中的pphsp20
‑
like1按照说明书步骤连接到r05载体(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，冻融法转化大肠杆菌dh5
ɑ
感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，次日挑单克隆进行菌液pcr鉴定，并取4管(技术重复)具有预期条带大小的菌液送通用生物系统有限公司测序鉴定。测序比对结果表明：成功获得了正确的含有pphsp20
‑
like1基因的重组表达载体r05
‑
pphsp20
‑
like1。根据axyprep质粒回收试剂盒(康宁生命科学有限公司)说明书回收r05
‑
pphsp20
‑
like1质粒，
‑
20℃保存。
59.实施例3
60.pphsp20
‑
like1基因过表达载体转化农杆菌
61.采用冻融法，将重组质粒r05
‑
pphsp20
‑
like1和r05空载体质粒按照gv3101说明书步骤分别转化农杆菌gv3101感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，28℃条件下倒置培养24h后挑单克隆置于1.5ml离心管中，内含有1.0ml的yeb液体培养基(含庆大霉素50μg/ml、利福平50μg/ml、壮观霉素100μg/ml)，培养条件为28℃，200rpm，振荡培养过夜后，以1μl菌液为模板、用rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)和载体及pphsp20
‑
like1基因特异性引物(p35s(上游引物)：5
’‑
gacgttccaaccacgtcttcaaag
‑3’
和p2(下游引物)：5
’‑
ctcgtcttttatgataactccttcaaaaat
‑3’
)进行pcr检测，产物片段与预期目的片段大小一致，表明成功获得了含重组表达载体r05
‑
pphsp20
‑
like1的农杆菌菌株。
62.实施例4
63.pphsp20
‑
like1蛋白亚细胞定位将实施例3中制备的含有重组质粒r05
‑
pphsp20
‑
like1的阳性克隆菌液扩大至50ml yeb液体培养基体系，28℃，200rpm，继续震荡培养至od600为0.8～1.0，离心弃上清。用注射缓冲液(含10mm mes，10mm mgcl2，100μm乙酰丁香酮)洗一次，然后用上述缓冲液将菌体gv3101
‑
r05
‑
pphsp20
‑
like1重悬至od600为0.7，并在室温条件下静置4h。随后，选取长势优良本氏烟草，用一次性灭菌注射器吸取1ml重悬液注
射叶片两侧，注射3株合计9片叶，烟草于16h:8h光暗周期、22℃和70％空气湿度的条件下暗培养1天，正常培养2天。用转盘式激光共聚焦显微镜(型号：ultra view vox，美国珀金埃尔默股份有限公司)观察pphsp20
‑
like1的亚细胞定位。如图5所示，pphsp20
‑
like1蛋白位于细胞核，是一个核蛋白。
64.实施例5
65.r05
‑
pphsp20
‑
like1重组表达载体转化拟南芥
66.1)转pphsp20
‑
like1基因拟南芥株系的获得和鉴定：
67.将实施例3中制备含有重组质粒r05
‑
pphsp20
‑
like1的阳性克隆菌液和含有r05空载体质粒的菌液分别扩大至100ml yeb液体培养基体系，28℃，200rpm，继续震荡培养至od600为0.8～1.0，离心弃上清。用缓冲液(含ms液体培养基，100μm乙酰丁香酮)洗一次，然后用上述缓冲液将沉淀重悬至od600为1.0，并在室温条件下静置4h。通过蘸花法转化拟南芥，具体为将携带重组质粒r05
‑
pphsp20
‑
like1的农杆菌悬浮液放在灭菌烧杯中，将拟南芥的含苞待放花浸在烧杯液体10s，合计转染6株，放在暗处一天后在16h/8h昼夜光周期、22℃和70％空气湿度的植物培养室中继续生长。r05空载体质粒的菌体也采用同样的方法转化拟南芥6株。成熟后分别收获种子，干燥后4℃密封保存，命名为t0种子。
68.把野生型对照种在不含抗生素的ms培养基上，r05空载体对照和t0种子种到ms培养基(含有终浓度为25.0mg
·
l
‑1卡那霉素)的培养皿中，待长出4个叶片时移栽到方形土钵中，在16h/8h昼夜光周期、22℃和70％空气湿度的植物培养室中生长。一个月后分别提取pphsp20
‑
like1过表达、空载体、野生型对照拟南芥叶片的基因组dna，利用引物p35s:gacgttccaaccacgtcttcaaag和p2ctcgtcttttatgataactccttcaaaaat，通过pcr进行阳性苗鉴定(图6)，将转pphsp20
‑
like1基因阳性拟南芥株系做好标记并命名为t0代转基因株系。待种子成熟，单株收获种子t1代。各单株种子分别播于添加有终浓度为25.0mg
·
l
‑1卡那霉素的ms培养基内，待t1代植株长出真叶移至方形营养钵中生长，在同样条件下的植物培养室培养。将t1代单株收获种子并干燥后4℃密封保存用添加有终浓度为25.0mg
·
l
‑1卡那霉素的ms培养基继续筛选，以观察t2代植株分离情况。t2代种子在含有卡那霉素的ms培养基上发芽率为100％。结果：该t2代种子是纯合转pphsp20
‑
like1基因株系种子，共获得稳定的6包纯合转pphsp20
‑
like1基因株系种子；t2种子种下去，转基因阳性株的叶片和花萼均呈现红色(图7)。其中：t0代表示转基因当代植株，t1代表示t0代自交产生的种子及由它所长成的植株，t2代表示t1代自交产生的种子及由它所长成的植株。
69.2)pphsp20
‑
like1在转pphsp20
‑
like1基因阳性株系和对照中的表达水平检测
70.qrt
‑
pcr检测转基因株和对照株叶片中pphsp20
‑
like1相对表达量。选取上述转基因阳性株的5个t2代纯合转基因株系种子(oe1、oe2、oe3、oe4、oe5)、1个r05空载体株种子、2个野生型对照株种子在统一条件下播种后培养，分别提取叶片总rna，分别反转录成cdna，稀释10倍备用(具体步骤同实施例1)，pphsp20
‑
like1以稀释的各株系cdna为模板，为pphsp20
‑
like1设计实时荧光定量pcr引物(上游引物：5
’‑
cctacctttgccaaattcag
‑3’
和下游引物5
’‑
cttttccagatcgtcctctt
‑3’
)，采用premix ex taq
tm
(tli rnaseh plus)试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)进行荧光定量pcr反应，反应体系是20μl：包含10.0μl sybr premix ex taq(2
×
)，0.4μl rox dye，上下游引物各0.4μl，cdna模板2.0μl，ddh2o 6.8μl，密封在96孔板中，仪器采用applied biosystems 7500real
‑
time pcr系统。反应程
序按照premix ex taq
tm
(tli rnaseh plus)说明书设置，看家基因采用rna polymerase ii(rp ii)。设置3个生物学重复和3个技术重复。每个基因的相对表达水平分析采用2
‑
δδct
方法，使用spss20.0对数据进行差异显著性分析，所有数据以邓肯氏新复极差法进行测验。
71.qrt
‑
pcr结果表明(图8)，pphsp20
‑
like1基因在oe5中表达量最高，oe3中次之，oe2和oe1再次之，oe4中最弱(图8)，但是拟南芥阳性苗株oe1～oe5的pphsp20
‑
like1基因表达量均显著高于空载体对照和野生型wt对照。
72.实施例6
73.hplc检测拟南芥转基因阳性株系和野生型对照株叶片中花色苷成分
74.采用高效液相色谱(hplc)方法，分别称取拟南芥转基因阳性株系和野生型对照株新鲜叶片0.2g，液氮研磨至粉末状，加入2.0ml溶液(丙酮：水：乙酸＝70:29.5:0.5)，4℃冰箱中避光浸提12h。取上清液放到新的离心管中，10000rpm 4℃离心10min，采用微孔滤膜(0.22μm)过滤3次，放在棕色进样瓶中备测。
75.采用agilent高效液相色谱系统(1100系列，vwd紫外检测器)和agilent zorbax sb
‑
c18色谱分析柱(4.6mm
×
250mm，5μm)进行花色苷成分检测。标准品为矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷(aladdin，27661
‑
36
‑
5)，甲醇甲酸等试剂均为色谱纯级。甲醇是分析纯级磷酸、甲酸是hplc级；色谱条件：流动相a：甲醇:磷酸:三氟乙酸＝97:2:1(v/v)；；流动相b：水:磷酸:三氟乙酸＝97:2:1(v/v)；进样量为20μl，流速为1.0ml/min；检测波长：515nm；柱温：25℃。
76.结果发现，野生型对照中无花色苷(图9a)，阳性拟南芥叶片在14.589min、15.411min、19.195min时分别出峰(图9b)，其中15.411min峰最高，其次是14.589min，再次是19.195min；通过与标准品相比，发现14.589min峰是矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷，但是15.411min峰代表的花色苷物质未知。
77.这些结果说明拟南芥野生型对照中无花色苷，过表达pphsp20
‑
like1拟南芥阳性株中产生了花色苷中的一种矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷，这与红肉桃
‘
野鸡红’果肉红色是由花色苷矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷决定的结果相互印证，15.411min峰代表的花色苷物质，需要进一步进行定性分析。
78.pphsp20
‑
like1基因过表达使叶片和花萼呈现红色，野生型对照和空载体对照株叶片和花萼不呈现红色，即pphsp20
‑
like1基因过表达使叶片和花萼中产生了花色苷中的矢车菊素
‑3‑
葡萄糖苷及另外一种未知花色苷物质。
79.实施例7
80.质谱检测拟南芥转基因阳性株系叶片中15.411min峰代表的花色苷成分
81.称取拟南芥转基因阳性株系新鲜叶片0.2g，液氮研磨至粉末状，加入2.0ml提取液(丙酮：水：乙酸＝70:29.5:0.5)，4℃冰箱中避光浸提12h。取上清液与放到新的离心管中，10000rpm 4℃离心10min，采用微孔滤膜(0.22μm)过滤，放在棕色进样瓶中备用备测。
82.色谱条件：shimadzu lc20 sciex tripletof 5600 ；液相条件：柱子采用waters beh xbridge 3.5um，2.1*150mm；流动相a：乙腈，流动相b：0.1％甲酸水，进样量5ul，流速0.3ml/min；lc
‑
qtof/ms质谱条件：ida方法，mass range：m/z 100
‑
1000，正模式。采用串联飞行时间质谱仪(规格型号：triple tof 5600 ，美国国ab sciex公司)进行高分辨率质谱检测。甲酸、乙腈是hplc级；实验用水来自milli
‑
q纯水系统。
83.根据质谱二级tofms图(图10a和图10b)、文献中各种花色苷成分的分子量综合判定转基因阳性株系15.411min峰代表花色苷矢车菊素
‑3‑
芸香苷。因此，过表达pphsp20
‑
like1拟南芥阳性株中产生了花色苷中的矢车菊素
‑3‑
葡萄糖和矢车菊素
‑3‑
芸香糖苷。
84.实施例8
85.重组表达质粒瞬时转化白肉桃果实
86.将实施例3中制备含有重组质粒r05
‑
pphsp20
‑
like1的阳性克隆菌液、空载体质粒菌液分别扩大至50ml yeb液体培养基体系，28℃，200rpm继续震荡培养至od600为0.8～1.0，离心弃上清。用注射缓冲液(含10mm mes，10mm mgcl2，100μm乙酰丁香酮)洗2次，然后用上述缓冲液将沉淀重悬至od600为0.7，并在室温条件下静置4h。随后，选取江苏省农业科学院提供的白肉桃品种
‘
小红花’160个果实，设计处理：注射空载体质粒(作为对照1)60个果，注射重组质粒r05
‑
pphsp20
‑
like1的阳性克隆菌液60个果，不注射任何(作为对照2)40个果；具体是在成熟前3周在树上，用一次性灭菌注射器吸取1ml重悬液注射果实阴面和阳面各一针。树体和果实进行正常田间栽培管理，每隔3天调查一次果肉色泽，共三次。如图11其中oe1和oe2分别代表2个白肉桃瞬时过表达pphsp20
‑
like1的果肉色泽表型，ck1代表不含pphsp20
‑
like1基因的空载体对照的果肉色泽表型，ck2代表不注射任何液体对照的果肉色泽表型。结果表明：与空载体对照1和不注射任何对照2相比，pphsp20
‑
like1瞬时过表达导致注射部位白肉产生红肉色泽，pphsp20
‑
like1促进了果肉红色色泽的产生。本实施例对白肉桃品种
‘
小红花’进行了重组表达质粒瞬时转化，同时其具有广谱性，对其它种类的白肉桃也具有类似效果。