一种基于电火花空化气泡的分选装置及方法

1.本发明属于流式分选技术领域，主要应用于流式细胞仪中，具体涉及一种基于电火花空化气泡的分选装置及方法。


背景技术：

2.流式细胞仪是一种用于细胞等生物微粒高通量、多参数分析和分选的仪器。流式细胞仪分为分析型和分选型两种，一般的商业流式细胞仪在开放空间中利用高压静电场偏转包裹细胞的带电液滴，实现单细胞分选。高压静电场分选速度快，但其体积较大，面临气溶胶污染和交叉污染问题，分选过程中的机械冲击会对细胞活性产生影响。因次，商业流式细胞仪的分选系统亟需改进，需要开发结构简单，成本低且能够解决气溶胶污染和交叉污染的分选手段。
3.电火花空化气泡分选是一种利用正负电极之间的高压脉冲放电，产生等离子体加热液体产生空化气泡，进而推动细胞进行分选的一种分选方式。电火花空化气泡分选具有低成本、全封闭分选的优势，但目前仍存在电极材料耐久性差，分选成功率不够高的问题。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术存在的电火花空化气泡分选电极材料耐久性差，分选成功率低的技术问题，本发明提供了一种基于电火花空化气泡的分选装置及方法。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
6.一方面，本发明提供了一种基于电火花空化气泡的分选装置，包括：
7.液流子系统，包括鞘液流道、样本液流道、主流道，细胞样本经过所述样本液流道后形成单细胞轴流进入所述主流道，所述主流道在下游位置被分岔口分为废液流道和收集流道；
8.检测子系统，用于收集所述细胞样本激发的脉冲信号，并将所述脉冲信号转化为电信号；
9.数据采集处理子系统，用于采集分析所述电信号，并依据分析结果下发分选指令；
10.空化气泡产生子系统，用于产生空化气泡，所述空化气泡推动液体产生射流，所述射流由射流喷口喷出作用于所述细胞样本，所述分岔口位于所述射流喷口对应的范围内。
11.在一些实施例中，所述空化气泡产生子系统包括高压放电电路，通过调整所述高压放电电路的放电时间控制所述空化气泡的体积，所述放电时间根据当前放电脉冲距离前面若干个所述放电脉冲之间的时间间隔动态调整。
12.在一些实施例中，所述空化气泡产生子系统还包括：正电极、负电极和空化腔，所述空化腔位于所述主流道侧面，所述空化腔通过所述射流喷口与所述主流道连通。
13.在一些实施例中，所述正电极材料为铂或钨，所述负电极材料为铂、钨或不锈钢。
14.在一些实施例中，所述检测子系统包括激光器、前向散射光检测通道、侧向散射光检测通道和若干个荧光检测通道。
15.在一些实施例中，所述细胞样本被所述激光器发射的激光照射后产生光信号，按照荧光波段分离后的所述光信号由光电检测单元接收后形成脉冲信号。
16.在一些实施例中，所述光信号包括散射光信号和荧光信号。
17.在一些实施例中，从所述废液流道流出的所述细胞样本进入废液管，从所述收集流道流出的所述细胞样本进入收集管。
18.在一些实施例中，所述鞘液流道用于通过鞘液，所述样本液流道用于通过所述细胞样本。
19.另一方面，本发明提供了一种基于电火花空化气泡的分选方法，包括以下步骤：
20.(1)标记目标细胞；
21.(2)所述鞘液和细胞样本液分别从所述鞘液流道和所述样本液流道流入，所述鞘液包裹所述细胞样本液聚焦为单细胞轴流后流入所述主流道；
22.(3)所述单细胞轴流流经所述检测子系统的检测区域时激发光信号，所述光信号由所述光电检测单元接收后形成所述脉冲信号，所述检测子系统将所述脉冲信号转化为电信号；
23.(4)所述数据采集处理子系统采集所述电信号并根据预设条件判断是否为目标细胞，若为所述目标细胞，则下发分选指令，所述空化气泡产生子系统产生所述空化气泡，所述空化气泡推动所述目标细胞进入所述收集流道；若为非目标细胞，则不下发分选指令，使得所述细胞样本液进入所述废液流道。
24.相对于现有技术，本发明的技术效果为：
25.本发明采用铂或钨作为正电极材料，铂、钨或不锈钢作为负电极材料，提高了电极材料的耐久性；
26.本发明的分岔口位于射流喷口对应的范围内，避免了回弹现象造成的分选失效；
27.本发明通过调整高压放电电路的放电时间控制空化气泡的体积，放电时间根据当前放电脉冲距离前面若干个放电脉冲之间的时间间隔动态调整，从而有效控制了空化气泡的体积，获得大小均一的空化气泡，保证了系统的稳定性；
28.本发明可实现低成本、高速、高精度的细胞分选。
附图说明
29.本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
30.图1为本发明分选装置的结构示意图；
31.图2为本发明分岔口与射流喷口相对位置的示意图；
32.图3为本发明分岔口位于不同位置的分选效果示意图；
33.图4为本发明分选原理示意图；
34.图5为本发明正电极为金属钨时多次放电后的图像；
35.图6为本发明正电极为金属铂时多次放电后的图像；
36.图7为本发明动态调整放电时间间隔实现方式示意图；
37.图8为本发明分选控制方法的流程图。
38.附图标记说明：
39.1鞘液流道、2样本液流道、3负电极、4正电极、5废液流道、6收集流道、7废液管、8收集管、9高压放电电路、10激光器、11检测子系统、12数据采集处理子系统、13空化气泡、14非目标细胞、15目标细胞、16射流喷口、17空化腔、18主流道、19第一运动方向、20第二运动方向、21第三运动方向、22二向色镜、23脉冲信号、24分岔口、25射流喷口范围、26滤波片、27前向散射光检测通道、28荧光检测通道、29侧向散射光检测通道、30单细胞轴流。
具体实施方式
40.下面详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
41.下面参照附图描述根据本发明实施例提出的基于电火花空化气泡的分选装置及方法。
42.如图1-8所示，本发明提供的基于电火花空化气泡的分选装置，包括：液流子系统、检测子系统11、数据采集处理子系统12、空化气泡产生子系统。
43.其中，液流子系统包括鞘液流道1、样本液流道2和主流道18，鞘液流道1和样本液流道2均与主流道18相通，且鞘液流道1和样本液流道2位于上游位置。可以理解的是，鞘液流道1用于通过鞘液，样本液流道2用于通过细胞样本。鞘液用于包裹细胞样本液，在鞘液和细胞样本液的共同作用下，细胞样本形成单细胞轴流30进入主流道18，形成单细胞轴流30的细胞样本逐一排列流入主流道18。
44.可以理解的是，本发明不对鞘液流道1和样本液流道2的结构进行限制，本领域技术人员可以根据实际情况设计需要的结构，只要能使得细胞样本形成单细胞轴流30进入主流道18即可。
45.主流道18在下游位置被分岔口24分为废液流道5和收集流道6，可以理解的是，废液流道5用于通过非目标细胞14，收集流道6用于通过目标细胞15。
46.在一些实施例中，从废液流道5流出的细胞样本进入废液管7，从收集流道6流出的细胞样本进入收集管8。也就是说，废液流道5和收集流道6分别对应废液管7和收集管8。
47.可以理解的是，可以采用微流体芯片代替传统的流动室，从而有利于进一步提高分选装置的集成程度。其中，微流体芯片包括芯片基板及设置在基板上的流道。
48.在单细胞轴流30流经主流道18的过程中会经过检测子系统11的检测区域。检测子系统11包括激光器10、前向散射光检测通道27、侧向散射光检测通道29和若干个荧光检测通道28。当细胞样本经过检测区域时，激光器10发出激光并照射细胞样本，细胞样本被激发产生光信号，光信号包括散射光信号和荧光信号。在检测子系统11中二向色镜22和滤波片26组成光路，散射光信号和荧光信号经过光路后被按荧光波段分离，并由检测子系统11的光电检测单元接收，形成脉冲信号23。检测子系统11将脉冲信号23转化为电信号后传输到数据采集处理子系统12。
49.数据采集处理子系统12，用于采集分析电信号，并依据分析结果下发分选指令。具体为，在待分选细胞进入主流道18之前，采用诸如荧光抗体等标记物对其进行标记修饰，目标细胞15和非目标细胞14在经过检测子系统11的检测区域时，受到激发产生的脉冲信号23不同，进而不同的脉冲信号23所转化的电信号不同，数据采集处理子系统12对电信号进行
采集分析，根据预设的条件判断是否为目标细胞15。
50.可以理解的是，经过数据采集处理子系统12的分析判断，若为目标细胞15，则下发分选指令，控制空化气泡产生子系统产生空化气泡13，空化气泡13推动目标细胞15进入收集流道6；若为非目标细胞14，则不下发分选指令，使得细胞样本液进入废液流道5。
51.空化气泡产生子系统，用于产生空化气泡13。空化气泡产生子系统包括正电极4、负电极3、空化腔17、高压放电电路9。当数据采集处理子系统12下发分选指令时，高压电路进行放电，高压电路放电时在正电极4尖端产生空化气泡13，空化气泡13首先在空化腔17中形成，然后推动液体产生射流，射流由射流喷口16喷出作用于目标细胞15，使得目标细胞15进入收集流道6。其中，空化腔17位于主流道18侧面，空化腔17通过射流喷口16与主流道18连通。其中，产生空化气泡13的单次能耗为10μj-10mj级，空化气泡13的直径为50μm-200μm。
52.分岔口24位于射流喷口范围25内，具体如图2所示，分岔口24的尖端在射流喷口16对应的范围内，优选地，分岔口24的尖端位于射流喷口范围25的中间位置。
53.分岔口24位于不同位置的分选效果如图3所示，其中，图3(a)为原设计分选结构的细胞微粒运动轨迹；图3(b)为本发明分选结构的细胞微粒运动轨迹。原设计为分岔口24位于射流喷口16的下游，本发明设计为将分岔口24的位置提前，即将分岔口24的位置设置在射流喷口范围25的中间位置。如图3(a)所示，从方形框标出的部分可以看出，以原设计结构进行分选时会发生明显的回弹现象，即细胞微粒受到空化气泡13产生的射流推动发生横向位移，但在推动结束后向流道中心位置回复。该设计由于分岔口24距离射流喷口16较远，在分选动作过后，细胞微粒最终再横向回复到初始位置，导致分选失败，细胞的轨迹如图3(a)中的虚线部分所示。本发明设计的分选结构中，将分岔口24的位置提前，设置在与射流喷口16正对的位置，如图3(b)所示。在本发明的设计中，射流将会产生一个斜向后的推动力，与主流道18中液流的推动共同作用在细胞微粒上，使其发生横向运动。细胞粒子在被射流推动之后，更快地进入到收集流道6，以此避免因回弹现象导致的分选失败。如图3(b)所示，从方形框标出的部分可以看出本发明的设计没有出现回弹现象，细胞的轨迹如图3(b)中虚线部分所示。
54.分选原理如图4所示，如图4(a)所示，实心圆标示目标细胞15，空心圆标示非目标细胞14，目标细胞15和非目标细胞14以单细胞轴流30的方式在主流道18中流动。当目标细胞15接近分岔口24时，触发正电极4和负电极3之间放电，在正电极4尖端产生空化气泡13，并进一步产生空化射流，空化射流从射流喷口16喷出推动目标细胞15偏离原先的运动轨迹。如图4(b)所示，射流对目标细胞15的推动使得目标细胞15产生一个第二运动方向20，第二运动方向20与目标细胞15原先的第一运动方向19合成后的方向为分选后目标细胞15的运动方法，即第三运动方向21。也就是说分选后目标细胞15沿着第三运动方向21运动顺利进入收集流道6。如图4(a)所示，分岔口24的位置在射流喷口对应的范围之间，能够有效阻止目标细胞15在空化气泡13溃灭的过程中发生回弹现象。
55.正电极材料为铂或钨，负电极材料为铂、钨或不锈钢。其中，正电极4为消耗性材料，由于空化气泡13在正电极4的尖端产生，因此，长期空化放电会导致一定的材料损耗。电火花放电同时伴随着正电极4烧蚀，金属材料被剥离，正电极4尖端将发生损耗。随着正电极4尖端的烧蚀损耗，正负电极间距逐渐增大，降低系统放电稳定性。
56.在正电极材料和负电极材料均为金属钨情况下，多次放电后的图像如图5所示。图
5分别为钨电极空化放电10次、3000次、10000次、30000次、100000次后的图片，该图片由高速相机拍摄。从图5中可以看出，钨电极在30000次空化放电后出现明显烧蚀剥离现象，此时，正负极间距显著增大，系统的放电稳定性降低。
57.在正电极材料为金属铂，负极材料为金属钨的情况下，多次放电后的图像如图6所示。图6分别为钨电极空化放电30000次、300000次、1000000次、3000000次、10000000次后的图片，该图片由高速相机拍摄。从图6中可以看出，铂电极性能稳定，经过1e7次空化放电后无明显损耗(实测可达1e8次放电)。实际应用中，可根据成本和分选次数要求灵活选择正负电极的材料。
58.由于在流式检测中，微粒经过检测区域的间隔具有偶然性，在大量微粒检测分选过程中易出现相邻两微粒经过的时间间隔过短，导致空化气泡13体积过大。因此，克服放电高速且随机带来的影响，维持空化气泡13体积不发生较大变化，保证系统稳定性至关重要。研究发现空化气泡13体积和放电能量在一定范围内成线性关系，可以通过控制放电时长来控制放电能量，进而有效调控空化气泡13的体积。
59.本发明通过调整高压放电电路9的放电时间控制空化气泡13的体积，放电时间根据当前放电脉冲距离前面若干个放电脉冲之间的时间间隔动态调整。本发明的动态调整放电时长由程序算法调节单次放电时长，进而维持空化气泡13的大小。
60.本发明提出的一种动态调整放电时长的实施方式，如图7所示。根据已有研究，在相同缓冲液流量下，产生空化气泡13频率越高，时间间隔越小，气泡体积增大越明显。基于这一原理，设计动态脉冲时长分选。
61.如图7，假设当前分选为第n次放电，对于第n次分选的放电时长，将其与之前三次(第n-1次、第n-2次和第n-3次)分选间隔时间(δt1、δt2和δt3)引入作为参考，修正当次分选放电时长tn，以控制产生空化气泡13的体积。相对于标准放电时长为t
st
，修正后的放电时长tn由公式1计算。其中，δt
st
为标准放电间隔，标准放电间隔为2ms，当相邻目标细胞15分选间隔大于δt
st
时，认为当前放电不受之前放电气泡影响，当相邻目标时间间隔小于δt
st
时，则需要进行动态调整，其中k1，k2，k3为实验确定的修正系数。
62.公式1：
[0063][0064]
其中，h＝h(x)，h(x)的表达式如公式2所示。
[0065]
公式2：
[0066][0067]
其中，动态调整放电时长的算法过程运行在数据采集处理子系统12中，数据采集处理子系统12包含具有计算能力的计算机或微处理器(mcu)，或现场可编程门阵列(field programmable gata array,fpga)，能够对目标细胞15的间隔时间进行判断，同时实现快速实时计算放电时间的功能，并给出分选信号。
[0068]
基于电火花空化气泡的分选方法，包括以下步骤：
[0069]
(1)标记目标细胞15；
[0070]
(2)鞘液和细胞样本液分别从鞘液流道1和样本液流道2流入，鞘液包裹细胞样本液聚焦为单细胞轴流30流入主流道18；
[0071]
(3)单细胞轴流30流经检测子系统11的检测区域时产生光信号，光信号由光电检测单元接收后形成脉冲信号23，检测子系统11将脉冲信号23转化为电信号；
[0072]
(4)数据采集处理子系统12采集电信号并根据预设条件判断是否为目标细胞15，若为目标细胞15，则下发分选指令，空化气泡产生子系统产生空化气泡13，空化气泡13推动目标细胞15进入收集流道6；若为非目标细胞14，则不下发分选指令，使得细胞样本液进入废液流道5。
[0073]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0074]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0075]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。