一种卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法与流程

一种卵黄球蛋白igy的分离纯化方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种卵黄球蛋白igy的分离纯化方法。


背景技术：

2.卵黄球蛋白是蛋黄中一种重要的蛋白质组成成分，约占蛋黄干物质的9.3％。它在蛋黄中以α
‑
、β
‑
和γ
‑
卵黄球蛋白三种形式存在。γ
‑
卵黄球蛋白即igy，是鸡蛋蛋黄来源的免疫球蛋白。然而与哺乳动物igg相比，有着更大的分子量、酸性等电点。igy结构类似于哺乳动物的igg抗体，由四条链组成，即两条轻链和两条重链。igy的热稳定性与igg相差不大，具有一定的耐酸耐碱能力，在ph 4.0
‑
11.0范围内稳定，可耐受胃酸，抵抗肠道中胰蛋白酶的消化，而且采用包被微孔板作为捕获抗体就不会激活标本中的补体系统，可以避免由补体激活而导致的干扰。
3.由于igy具有上述的优点，其在食品、畜禽产业以及临床上有着广泛的应用。在食品领域，其可以做为一种抗体食品添加剂，制备抗体食品，从而提高机体免疫力。研究表明，添加igy的抗体食品对病原体感染能够起到预防作用，同时对风湿病症也具有良好的预防和改善作用。在畜禽产业中，igy对腹泻的发生程度和仔猪的死亡率起到降低的作用，并且有利于仔猪增加体重。在临床上igy也用于抗哺乳动物多克隆抗体的制备、制备实验诊断试剂和免疫防治。
4.基于igy的广泛应用，对于igy的提纯和制备方法也受到了广泛的研究。目前常采用的提纯制备方法有无机物沉淀法、高分子有机聚合物沉淀法、有机溶剂沉淀法、超滤法、离子交换色谱法和亲和色谱法。但是，目前采用上述方法普遍存在步骤多、批量小、试剂耗量大和回收率低等问题。因此，需要开发一种高回收率、高纯度的igy的分离纯化方法。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于提供一种高纯度、高回收率的卵黄球蛋白igy的分离纯化方法。
6.本发明的发明人在研究中发现，将鸡蛋黄按照无菌水稀释、冰乙醇沉淀、盐析和离子交换色谱纯化后能够得到纯度较高的卵黄球蛋白igy。从而，本发明提供了如下的技术方案：
7.一方面，本发明提供了一种卵黄球蛋白igy的分离纯化方法，其包括：
8.s1：将鸡蛋黄用无菌水稀释后搅拌均匀，调节ph值为4.6
‑
5.4，静置2
‑
10h后过滤去除沉淀，得到上清液；
9.s2：向s1中的上清液中加入95％冰乙醇使得终浓度为40％
‑
60％(v/v)，0
‑
10℃条件下搅拌20
‑
40min后离心，收集沉淀；
10.s3：向得到的沉淀中加入氯化钠水溶液，过滤除去脂蛋白沉淀，收集滤液；
11.s4：滤液用离子交换色谱法纯化，得到igy。
12.本发明中，冰乙醇是指将乙醇冷却到
‑
20℃时再使用。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤s1中无菌水稀释时的用量为鸡蛋黄体积的6
‑
10倍；进一步优选地，步骤s1中无菌水稀释时的用量为鸡蛋黄体积的8倍。本发明发现，当稀释倍数为8倍，调节ph值为5.2时，脂蛋白的回收率最小，说明稀释液的ph值为5.2时，可以获得较好的分离效果。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明中，调节ph值得方式包括采用酸性试剂进行调节，例如采用hcl、h2so4等无机酸进行调节；优选地，调节ph值为5.2。在一些具体的实施方案中，步骤s1中的静置时间为4h。
15.根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤s2中加入冰乙醇后的终浓度为60％(v/v)。乙醇的添加量会影响终产物中蛋白质的含量和免疫球蛋白的活性，经过对比，确定乙醇的添加量为60％最为合适。
16.根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤s3中加入的氯化钠水溶液的浓度为0.028mol/l
‑
0.056mol/l。在一些具体的实施方案中，步骤s3中加入的氯化钠水溶液的浓度为0.028mol/l。氯化钠水溶液的作用是用来溶解得到的沉淀，其浓度不同，得到的产物的产率也不一样。当氯化钠溶液的浓度为0.028mol/l时，蛋白质获取率最高，并且杂蛋白的去除情况也较为理想。
17.根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤s4中用离子交换色谱法纯化的步骤包括：
18.采用deae
‑
toyopearl 650m作为离子交换色谱用的填料，填料预先用na2hpo4‑
nah2po4缓冲液平衡，缓冲液的ph值为6.0
‑
8.0、缓冲液的离子强度为0.03mol/l
‑
0.1mol/l，流速为3
‑
8ml/min，将收集到的igy装入透析袋中，置于蒸馏水中，4
‑
10℃下透析除盐，得到igy。
19.根据本发明的具体实施方案，本发明中，缓冲液的ph值为7.0，缓冲液的离子强度为0.075mol/l，流速为3ml/min，透析袋的截留分子量为8000
‑
14000kd。
20.本发明提供的分离纯化方法中，离子交换纯化过程中采用较低的缓冲液离子强度，减少了后续脱盐时间，缩短了提取周期，对蛋白质活性影响小。
21.此外，本发明还提供了一种卵黄球蛋白igy，其是按照本发明所述的制备方法制备得到的，所述igy的纯度为96％
‑
99.9％；优选为98％
‑
99.9％。
22.综上所述，本发明提供了一种新的卵黄球蛋白igy的分离纯化方法。该方法综合采用水稀释法、冰乙醇沉淀和离子交换色谱法，能够制备出高回收率和高纯度的卵黄蛋白igy。其中，使用的乙醇是本身具有可食性，因此该方法的安全性较高。在制备igy组分过程中，对水稀释分离条件进行了改进，所使用的乙醇与其他有机试剂相比无毒无害，更安全；氯化钠水溶液沉淀去除脂蛋白，再结合一步洗脱离子交换纯化，有着更高的蛋白回收率和纯度，活性损失也较小，弥补了离子交换色谱不能同时达到高纯度和高回收率的缺点；仪器设备操作简单，成本低，可实现大规模生产制备高纯度高回收率的卵黄球蛋白igy。
具体实施方式
23.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
24.需要说明的是，本发明实施例中所采用的试剂都是通过商业购买可以获得的。
25.本发明中采用的测试方法，也皆为本领域技术人员熟知的常规技术手段。
26.实施例1
27.本实施例提供了一种卵黄球蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
28.选择市售新鲜鸡蛋，用卵黄分离器去除蛋白，之后将蛋黄于滤纸上滚动，吸干，刺破卵黄膜，收集卵黄。取100ml卵黄，加入8倍体积的无菌水进行稀释，搅拌均匀后用hcl调节ph值为5.2，静置4h左右后过滤去除沉淀，得到上清液。
29.向上清液中加入95％冰乙醇(预先冷却至
‑
20℃备用)，使终浓度为60％(v/v)，4℃搅拌20min后离心，收集沉淀。
30.向上述沉淀加入0.028mol/l的氯化钠水溶液(量能够充分溶解沉淀即可)，搅拌20分钟左右后过滤去除脂蛋白沉淀，收集滤液得到澄清的水溶性蛋白组分(wsf)。
31.采用deae
‑
toyopearl 650m作为离子交换色谱用的填料，填料预先用na2hpo4‑
nah2po4缓冲液平衡，缓冲液的ph值为7.0、缓冲液的离子强度为0.075mol/l，流速为3ml/min，将收集到的igy装入透析袋中(透析袋的截留分子量为8000kd)，置于蒸馏水中，4℃下透析除盐，得到igy。
32.回收率、纯度、生物活性的测定：
33.蛋白质的回收率、纯度、生物活性是分离纯化过程的重要指标，在分离纯化过程中，igy有不同程度的损失，抗原抗体结合活性也会受到一定程度的影响。
34.蛋白的回收率可以采用福利
‑
酚法进行确定。
35.igy的纯度采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)法进行测定：laemmli体系，4％浓缩胶，10％分离胶，恒压150v，加样量1～10mg，电泳后的凝胶分别采用考马斯亮蓝r
‑
250和糖蛋白染色，分析测定本发明提供的制备方法所得igy的纯度可达99％。
36.igy的回收率测定：igy的回收率可以通过以下公式进行计算：
[0037][0038]
igy的活性检测方法为：
[0039]
igy活性检测采用elisa方法检测(sousa et al.,2011)，具体操作如下：
[0040]
(1)标准品的稀释：原倍标准品一支，按照下列表1在小试管中进行稀释。
[0041]
表1
[0042]
800ng/l5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液400ng/l4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液200ng/l3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液100ng/l2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液50ng/l1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
[0043]
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl最终稀释度为5倍。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不
触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0044]
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。
[0045]
(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水倍稀释后备用。
[0046]
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置后弃去，如此重复次，拍干。
[0047]
(6)加酶：每孔加入酶标试剂，空白孔除外。
[0048]
(7)温育：操作同3。
[0049]
(8)洗涤：操作同5。
[0050]
(9)显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl。轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min。
[0051]
(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0052]
(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15min以内进行。
[0053]
igy活性保持率(％)＝处理后样品活性含量/处理前样品活性含量
×
100％。
[0054]
结果分析：
[0055]
igy在分离纯化过程中的回收率、纯度、活性保持率如下表2所示：
[0056]
表2
[0057]
分离过程回收率(％)纯度(％)活性保持率(％)水稀释93.562095.21冰乙醇沉淀70.377682.31离子交换色谱94.669979.61
[0058]
由上表2可以看出，采用本发明提供的制备方法所得到的蛋白回收率高、且最终纯度可达到99％、活性保持率在79.61％。相比于单纯采用水稀释法、或者是水稀释法加冰乙醇沉淀的方法，本发明提供的方法在纯度、回收率方面均有所提升。在活性保持率方面稍有下降，但也在可接受的范围之内。
[0059]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。