一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用的制作方法

crispr-cas9 assisted non-homologous end-joining strategy for one-step engineering of bacterial genome,sci.rep.6(2016)37895.)通过使大肠杆菌异源表达mycobacterium tuberculosis h37rv nhej蛋白，首次将nhej系统成功引入大肠杆菌，成功对线性质粒和断裂的基因组进行了末端连接。尽管大肠杆菌可以通过表达外源nhej系统获得非同源末端连接的能力，但是大肠杆菌本身固有的同源重组与引入的nhej系统是一种竞争关系，如果nhej系统连接效率较低，同源重组修复就会占主导作用，导致nhej系统的连接“失效”。
7.尽管tianyuan su等、xuan zheng等(x.zheng,s.li,g.zhao,j.wang.(2017).an efficient system for deletion of large dna fragments in escherichia coli via introduction of both cas9 and the non-homologous end joining system from mycobacterium smegmatis,bbrc.(2017)1-7)通过使大肠杆菌表达其它微生物来源的ku和ligd蛋白，成功将nhej系统引入大肠杆菌，但是迄今仍然没有高效的能使大肠杆菌获得nhej系统并进行基因编辑的方法。
8.高效的nhej系统是基因组规模的基因编辑技术的基础。因此，如何提供一种可在大肠杆菌中对基因组进行高效编辑的系统及方法，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

9.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，筛选得到的nhej系统在大肠杆菌中的连接效率很高，在基因编辑的相关研究中具有广阔的应用前景。
10.为达此目的，本发明采用如下技术方案：
11.第一方面，本发明提供了一种使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，所述使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具包括：
12.pdual-cas9-parental质粒载体：含有dna解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、arac基因、阿拉伯糖启动子和ⅱs型限制酶识别位点；
13.和pdual-sgrna-lacz质粒载体：含有靶向lacz基因的sgrna序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。
14.本发明中，通过所述高通量筛选工具可以快速高效地筛选出在大肠杆菌中有效的nhej系统，进而将其引入大肠杆菌，提高了基因断裂后的非同源末端连接效率，进而提升了基因编辑的效率，具有很高的应用价值。
15.优选地，所述dna解旋酶基因包括rep101基因。
16.优选地，所述复制子包括psc101复制子。
17.优选地，所述核酸酶基因包括cas9基因。
18.优选地，所述阿拉伯糖启动子的数量为2个。
19.优选地，所述ⅱs型限制酶识别位点为至少2个，例如可以是2个、3个、4个或5个等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
20.优选地，所述ⅱs型限制酶识别位点包括bsaⅰ和/或bbsⅰ。
21.优选地，所述组成型表达的强启动子包括j23119启动子。
22.优选地，所述pdual-cas9-parental质粒载体和pdual-sgrna-lacz质粒载体的抗
生素抗性基因不同。
23.优选地，所述pdual-cas9-parental质粒载体的抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，所述pdual-sgrna-lacz质粒载体的抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。
24.优选地，所述pdual-cas9-parental质粒载体顺次连接有dna解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、arac基因、阿拉伯糖启动子和ⅱs型限制酶识别位点。
25.优选地，所述pdual-sgrna-lacz质粒载体顺次连接有靶向lacz基因的sgrna序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。
26.作为优选技术方案，本发明中所述使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具，包括：
27.pdual-cas9-parental质粒载体：顺次连接有rep101基因、psc101复制子、卡那霉素抗性基因、cas9基因、arac基因、2个阿拉伯糖启动子、用于克隆ku基因的bsaⅰ限制酶识别位点和用于克隆ligd基因的bbsⅰ限制酶识别位点；
28.和pdual-sgrna-lacz质粒载体：顺次连接有靶向lacz基因的sgrna序列、j23119启动子、复制子和氨苄青霉素抗性基因。
29.第二方面，本发明提供了一种计算nhej系统连接效率的方法，所述计算nhej系统连接效率的方法包括：
30.将nhej系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；
31.将酶切后与未酶切的质粒分别转染制备的感受态细胞，培养；
32.统计平板上的克隆数，计算nhej系统的连接效率。
33.优选地，所述nhej系统为经过第一方面中所述的使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具筛选后的nhej系统。
34.优选地，所述nhej系统为同时连接有ku蛋白和ligd蛋白的cds编码序列的pdual-cas9-ku ligd质粒载体。
35.优选地，所述酶切包括限制酶酶切。
36.优选地，所述酶切包括ecor
ⅴ
限制酶酶切。
37.优选地，所述质粒包括puc57-amp。
38.优选地，所述nhej系统的连接效率的计算公式为：转化1ng酶切后的质粒的克隆数与转化1ng未酶切的质粒的克隆数的比值。
39.作为优选技术方案，本发明所述计算nhej系统连接效率的方法，包括以下步骤：
40.(1)将pdual-cas9-ku ligd质粒转化大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性lb平板，30℃培养过夜；
41.(2)挑取单克隆至lb培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液od
600
值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞；
42.(3)使用ecor
ⅴ
限制酶酶切puc57-amp质粒，酶切产物使用磁珠回收纯化；
43.(4)分别转化puc57-amp质粒以及ecor
ⅴ
酶切的puc57-amp质粒至步骤(2)制备的感受态细胞，涂布卡那霉素、氨苄青霉素lb平板，30℃培养过夜，同时将ecor
ⅴ
酶切的puc57-amp质粒转化mg1655感受态细胞，菌液离心后涂布氨苄青霉素的lb平板，30℃培养过夜(作为对照)；
44.(5)统计每个平板的克隆数，计算nhej系统的连接效率，其中，所述nhej系统的连
接效率的计算公式为：转化1ng ecor
ⅴ
酶切的puc57-amp质粒的克隆数与转化1ng puc57-amp质粒的克隆数的比值。
45.第三方面，本发明提供了一种通过nhej系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，所述基因编辑的方法包括：
46.将nhej系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；
47.构建靶向目的基因的pdual-sgrna质粒；
48.将构建的所述靶向目的基因的pdual-sgrna质粒转化制备的感受态细胞，培养；
49.挑取克隆进行验证，分析基因编辑的情况。
50.优选地，所述nhej系统为经过第一方面中所述的使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具筛选后的nhej系统。
51.优选地，所述nhej系统为同时连接有ku蛋白和ligd蛋白的cds编码序列的pdual-cas9-ku ligd质粒载体。
52.优选地，所述感受态细胞包括电转感受态细胞。
53.优选地，所述靶向目的基因的pdual-sgrna质粒转化制备的感受态细胞的方法包括电转化。
54.优选地，所述验证包括pcr扩增验证和/或测序验证。
55.作为优选技术方案，本发明所述通过nhej系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，包括以下步骤：
56.(1)将pdual-cas9-ku ligd质粒转化大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性lb平板，30℃培养过夜，次日，挑取单克隆至lb培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液od
600
值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞；
57.(2)构建靶向目的基因的pdual-sgrna质粒；
58.(3)将构建的所述靶向目的基因的pdual-sgrna质粒电转化步骤(1)制备的感受态细胞，涂布卡那霉素、氨苄青霉素lb平板，30℃培养过夜；
59.(4)挑单克隆至lb平板培养8小时，通过菌落pcr扩增目的基因，将扩增成功的pcr产物进行sanger测序验证，并分析基因编辑情况。
60.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
61.本发明通过使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具，筛选出在大肠杆菌中有效的nhej系统，成功将外源nhej系统引入大肠杆菌中，促进了断裂后dna双链的非同源末端连接，进而提高了基因编辑的效率，为大肠杆菌的基因编辑及基因功能的研究创造了条件。
附图说明
62.图1为本发明实施例3中lacz基因的扩增结果图片，图中，m-标准dna分子量marker，1～192-编号为1～192的菌落的扩增结果；
63.图2为本发明实施例3中ku基因的扩增结果图片，图中，m-标准dna分子量marker，1～192-编号为1～192的菌落的扩增结果；
64.图3为本发明实施例3中ligd基因的扩增结果图片，图中，m-标准dna分子量marker，1～192-编号为1～192的菌落的扩增结果；
65.图4为本发明实施例4中不同组别的平板菌落生长情况的结果图片；
66.图5为本发明实施例5中pcnb基因的pcr扩增的结果图片，图中，m-标准dna分子量marker，1～24-转化了pdual-cas9-mno-ku mfo-ligd质粒的24个菌落的扩增结果，25～48-转化了pdual-cas9-mbr-ku mfo-ligd质粒的24个菌落的扩增结果，49～72-转化了pdual-cas9-mno-ku msm-ligd质粒的24个菌落的扩增结果。
具体实施方式
67.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
68.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
69.材料：
70.top10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；
71.bsaⅰ、speⅰ、ecor
ⅴ
和gibsonmaster mix试剂盒购自neb公司；
72.t4 dna连接酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
73.mg1655大肠杆菌感受态细胞购自atcc公司；
74.x-gal和iptg购自默克公司；
75.puc57-amp质粒来自安升达生物科技有限公司。
76.实施例1构建使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具
77.本实施例提供一种使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具，所述使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具包括：
78.pdual-cas9-parental质粒载体：顺次连接有rep101基因、psc101复制子、卡那霉素抗性基因、cas9基因、arac基因、2个阿拉伯糖启动子、用于克隆ku基因的bsaⅰ限制酶识别位点和用于克隆ligd基因的bbsⅰ限制酶识别位点；
79.和pdual-sgrna-lacz质粒载体：顺次连接有靶向lacz基因的sgrna序列、组成型表达的强启动子j23119启动子、复制子和氨苄青霉素抗性基因。
80.所述使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具通过如下方法进行构建：
81.(1)基因合成pdual-cas9-parental质粒载体。
82.将所述pdual-cas9-parental质粒载体的功能原件通过基因合成顺次连接，得到所述pdual-cas9-parental质粒载体。
83.所述质粒具有seq id no.1所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
84.所述质粒自5’端151～1101bp为rep101基因，1149～1371bp为psc101复制子，2023～2838bp为卡那霉素抗性基因，3368～7471bp为cas9基因，7604～8482bp为arac基因，8509～8793bp和9243～9527bp为阿拉伯糖启动子，8838～8843bp的反向互补序列和8854～8859bp为bsaⅰ限制酶识别位点，用于克隆ku基因，9573～9578bp的反向互补序列和9589～9594bp为bbsⅰ限制酶识别位点，用于克隆ligd基因。
85.seq id no.1：
86.aaacagacgaagaatccatgggtatggacatgccgctcgccttccatgggtatggacagttttccctttgatatgtaacggtgaacagttgttctacttttgtttgttagtcttgatgcttcactgatagatacaagagccataagaacctcagatccttccgtatttagccagtatgttctctagtgtggttcgttgtttttgcgtgagccatgagaacgaaccattgagatcatacttactttgcatgtcactcaaaaattttgcctcaaaactggtgagctgaatttttgcagttaaagcatcgtgtagtgtttttcttagtccgttatgtaggtaggaatctgatgtaatggttgttggtattttgtcaccattcatttttatctggttgttctcaagttcggttacgagatccatttgtctatctagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtcgggcggcctcgcttatcaaccaccaatttcatattgctgtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaacccattggttaagccttttaaactcatggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcatcaaggctaatctctatatttgccttgtgagttttcttttgtgttagttcttttaataaccactcataaatcctcatagagtatttgttttcaaaagacttaacatgttccagattatattttatgaatttttttaactggaaaagataaggcaatatctcttcactaaaaactaattctaatttttcgcttgagaacttggcatagtttgtccactggaaaatctcaaagcctttaaccaaaggattcctgatttccacagttctcgtcatcagctctctggttgctttagctaatacaccataagcattttccctactgatgttcatcatctgaacgtattggttataagtgaacgataccgtccgttctttccttgtagggttttcaatcgtggggttgagtagtgccacacagcataaaattagcttggtttcatgctccgttaagtcatagcgactaatcgctagttcatttgctttgaaaacaactaattcagacatacatctcaattggtctaggtgattttaatcactataccaattgagatgggctagtcaatgataattactagtccttttcctttgagttgtgggtatctgtaaattctgctagacctttgctggaaaacttgtaaattctgctagaccctctgtaaattccgctagacctttgtgtgttttttttgtttatattcaagtggttataatttatagaataaagaaagaataaaaaaagataaaaagaatagatcccagccctgtgtataactcactactttagtcagttccgcagtattacaaaaggatgtcgcaaacgctgtttgctcctctacaaaacagaccttaaaaccctaaaggcttaagtagcaccctcgcaagctcggttgcggccgcaatcgggcaaatcgctgaatattccttttgtctccgaccatcaggcacctgagtcgctgtctttttcgtgacattcagttcgctgcgctcacggctctggcagtgaatgggggtaaatggcactacaggcgccttttatggattcatgcaaggaaactacccataatacaagaaaagcccgtcacgggcttctcagggcgttttatggcgggtctgctatgtggtgctatctgactttttgctgttcagcagttcctgccctctgattttccagtctgaccacttcggattatcccgtgacaggtcattcagactggctaatgcacccagtaaggcagcggtatcatcaacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttacgtttccaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttat
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87.(2)基因合成pdual-sgrna-lacz质粒载体。
88.将所述pdual-sgrna-lacz质粒载体的功能原件通过基因合成顺次连接，得到所述pdual-sgrna-lacz质粒载体。
89.所述质粒具有seq id no.2所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
90.所述质粒自5’端259～278bp为靶向lacz基因的sgrna序列，279～313bp为j23119启动子，584～1172bp为复制子，1343～2203bp为氨苄青霉素抗性基因。
91.seq id no.2：
92.tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaaaagcttctgcaggtcgactctagagaattcaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaactcgttttacaacgtcgtgacactagtattatacctaggactgagctagctgtcaaggatccagcatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacg
atacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc。
93.实施例2以pdual-cas9-parental为骨架载体构建ku ligd质粒文库
94.本实施例以pdual-cas9-parental为骨架载体构建ku ligd质粒文库，包括如下步骤：
95.(1)从ncbi获得微生物来源的ku蛋白和ligd蛋白的cds编码序列各11种，genbank登录号分别为wp_010886496(bsu-ku)、adn57538(buh-ku)、gas86454(mbr-ku)、adu06008(mms-ku)、gat12817(mno-ku)、yp_889815(msm-ku)、np_215452(mtb-ku)、acv76561(nmu-ku)、adh67668(nda-ku)、adg15500(pbh-ku)、ccq47782(psi-ku)、np_389223(bsu-ligd)、atd76462(bve-ligd)、cce75978(cne-ligd)、sjm32621(mde-ligd)、ali25184(mfo-ligd)、wp_011730625(msm-ligd)、np_215453(mtb-ligd)、bar68071(pae-ligd)、akj29816(pbr-ligd)、sud78454(ppu-ligd)和sms10934(pvi-ligd)。
96.(2)针对大肠杆菌宿主对ku蛋白和ligd蛋白的cds编码序列进行密码子优化，优化后的ku蛋白的cds编码序列不含bbsⅰ和bsaⅰ识别序列，序列5’端添加seq id no.34所示的核苷酸序列，3’端添加seq id no.35所示的核苷酸序列；优化的ligd蛋白的cds编码序列不含bbsⅰ识别序列，序列5’端添加seq id no.36所示的核苷酸序列，3’端添加seq id no.37所示的核苷酸序列。
97.seq id no.34：cccagtcacgacggtctcaaaaa(bsaⅰ识别位点)；
98.seq id no.35：aagccgagacctcctgtgtgaaa(bsaⅰ识别位点)；
99.seq id no.36：cccagtcacgacgaagacgcaaaa(bbsⅰ识别位点)；
100.seq id no.37：cacaaggtcttctcctgtgtgaaa(bbsⅰ识别位点)。
101.优化后的ku蛋白的cds编码序列具有seq id no.3～13所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
102.seq id no.3(bsu-ku)：
103.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgaatcgcacaccgtctttacacaccaaagagaaaaaaggcttcatcgacatgcacaccatgtggaaaggcagcatcagctttggtttagtgaacatcccgattaagctgtacgcagccaccgaagataaagatattaaattacgctctttacataaagaagatcatgccccgattaaatatgaaaaagtgtgtaccaactgcgagaaaactttaagccccgatgagatcgtgaaaggctatgagtatgtgaaaggcaagtatgtggtgctg
accgatgaggatctgaagagtctgaagcaagaacatgaggaaaaggccgttgagatcgtggacttcgttcagctgcaagaaatcgacccgatctacttcaaccgcagctactttgtgggccccggtgataacggcaccaaagcctataccttactgcgcgaagctttacgcagcaccggtaaaatcggcattgccaacatgaccattcgcagcaagcaacagctggccattctgcgtgtgtacgagaactgcatcgtgatggagagcatccattatccggacgaagtgcgtagcgcagcacaagttccgggtgttccggaccagagcaacgtgaacgacaaagagctgcagaccgcaattactttaattgatgagctgaccgccaagttcgagccggaaaaatacgaggacacctaccgtcaagctttactgcagcgcgtgaacgataagctggaaaacaaggaaaccgcagtgaccccggataaagcaccgccgcgcgaagatgttatcgatctggtgagtgctttacaagctagcattgatcgtacccgtcgcccgaatcgtgaaacacccgctgcagcaccggcacaagctgcagaaccgaagggtgccggtgacaaaaaacagaaaaccacccgcaaaaaagcaagcggcaccagctaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
104.seq id no.4(buh-ku)：
105.cccagtcacgacggtctcaaaaaatggcccatatgatctggaaaggcgccattagttttggtttagttcacgtgccggttcagctgtatccggccacccgtagcgagaaagtgggcttcaatttactggacaaacgcaccatcgatccggtgggttataaacagatcaataaacgtaccggtaaagacgtgacccgcgataacattgtgcgcggttttgaatatgaaaaagataaatatgtggtgctgaccgatgaagaaatccgcgccgccaatccggaaagtacccagaccgtggatattctggccttcgttgatgcaccggacatcagctttctgtatttagataccccgtactttctgacaccggaccgcaaaggcgaaaaagtgtacgcactgctgcgtgaggccatgaaaagtagcggcaaagttggtgtggccagcgttgttctgcacaacaaacagcatctggccgctttaattcccgttggtccggttttagctttaaatacactgcgctgggcagaagaagtgcgtgactttgatgagtttaaactgccggccgagggtgcaaaagccgctggtgttagcgcccgcgaactggacatggcccagaaactgatcgatgacatgagcgacacttgggatccgagtaagtatcacgacacctttcgcgacgacatcatggctttagttgatcgtaaggttcgcgagggcaaaaccgaagagatcaccgatattgaagccccgcgtgaggcacgtcaaagcgcagatattctggatttaagcgatctgctgaagcgttctttaggtcgcggcaaaaataaaccggccagcggcagtcgcaaacgtgccgcagatgatgaagccgacgacggcaatgccgatgcagaagatgatggcggtagcaccccggcacgcaagaaacctcgcacagcccgcagtaccggtagcgcacgtacaagccgtagcagcagcggcagtagtagcggtggtcgcgcagcaaccaaaagcacaaccgccgcacgcaaacgtcgtgcagcagcctaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
106.seq id no.5(mbr-ku)：
107.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgcgcagcatctggaaaggcagtatcgcattcggtttagttaacgtgccggtgaaagtttacagcgccaccgaggatcacgacatcaagttccaccaagttcatgccaaagacaatggccgcatccgctataaacgcgtgtgcgaagtgtgcggcgaagtggtggaatttcgcgatattaataaagcctatgaaagcgacgacggtcagatggtggtgattaccgacgaggatattgctactttaccggaagaacgtagtcgcgagattgaggtggtggagtttatcccggccgaacaactggatccgctgatgtacgataagagctactttctggagccggatagcaaaagcagcaagagctacgtgctgctggcaaaaactttagccgaaactgaacgcgttgccattgtgcacttcagcttacgcaataaaacccgtttagcagcactgcgcgttaaggatttcagcaagcgcaacgtgatggtgatccatactttactgtggccggatgaaattcgtgacccggattttccggtgctggacaaggaagtggagatcaaaccggccgaactgaagatggccggccaagttgtggaaagcatgaccgacgatttccacccggaccagtttcgcgatgattatcaagctcagctgtatgagctggttcaagccaaactggaaggcggcgaagcattcagtgtggaagaacagccggccgatctggatgaaaccgaggatgtttctgatctgctggccaagctggaagccagcgtgaaagcccgtaaaggcggtggtagcgcaaaaagcgataaggacagcgacgaggatagcgataaggatagcgatgacgaggaagcaaagccggccaaaaaggcacc
ggctaaaaaagcagcagccaagaaagccccggctaaaaaagccgccgccaaaaaataaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
108.seq id no.6(mms-ku)：
109.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgcgcgcaatttggaaaggcgccgttagctttggtttagttagcattggcgtgaaagtgtacagcgccaccgaggaaaaggacatccgtttccaccaagttcatcgtgaagatggcggccgcatccgctataagcgcacatgtagcgtgtgcggcgaagaggttacctacgacgacatcgccaaaggctatgacattggcggtggtgagatggtgattttaaccgacgaggattttgcagatctgccgctgagcaccagtcatgccatcgatgtgctggaattcgtgccggccgagcaagtggacccgattttatacaataaggcctactttttagagccggagggcagcgcaaccaaaccgtacgttctgctgcgtgacgctttaagcgatagcgaacgcgtggccattgtgaaggttgcactgcgtcagcgcgaacagttagccactttacgcgttcgtgagggtgtgctgctgctgaacacaatgctgtggccggatgaaattcgccgcccggatttcggctttctggatgaggatctgaaggtgcgtccgccggaactggcaatggcaagctctttaatcgatagcatggctggtgaatttgaaccggatgccttcaccgatgactatcgcgccgctttacaagaagttattgacgcaaaagtggaaggccgtgaagttgtgcagccggaagaagaagaggccgcacccgctgccgcagttgatctgatggccgcactgaaagccagcgttgaacgtgcacgtgcagcccgcggtgaagcacctagtggtggcggtgccgaaccgacaccgattagcagcgcacgcagcgctaaaaaagctgccaaaaaagcccccgctaaaaaggccgaaccggccaaaaagaccaccgccaaaaaggcaccggcaaagaaaaccgcagccaagaaagccgagccggctaagaaaactgccgccaaaaagactcccgctaagaaaaagaccgcctaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
110.seq id no.7(mno-ku)：
111.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgcgcagtatttggaagggtagcattgccttcggtttagtgaatgttccggtgaaggtgtatagcgcccagcaagatcacgacgtgaagttccaccaagttcacgccaaagataatggccgcatccgctataagcgtgtgtgcgaaatcgacggtgaagaagttgagtatcgcgatattgcccgcgcctatgaaagcgacgatggtcagaccgtgatcatcacagatgaggacatcgccacactgccggaagagcgtagtcgcgagatcgaggtgctggaatttgttccggccgccgacattgacccgatgatgtacgatcgcagctactttttagagccggaaggtaaaagcagcaagagctacgtgctgctgaccaaaactttaaaggaaaccgatcgcgttgccatcgttcactttgctttacgcaataagacacgtctggcagcactgcgcgtgcaagatttcagcaagcgcgatgtgatggtgatccagactttactgtggccggatgaaatccgtgatccggatttcccggttctggacaaagaagtggatattaaaccggcagaactgaaaatggccacacaagttgtggacagcatgaccgacgactttaacccggatcgctatcacgacgactatcaagaacagctgcgcgaactgattcaagctaaactggaaggcggtgaagcctttacaacagaggaacagccgcaagaactggacgaaaccgaggatgtttctgatctgctggcaaaactggaagccagcgttaaagcacgccgcgaaggtcgtggtggtagcaaaagcagcgacgacgacgataaacccgccaaaaaagctcccgctaagaaatctgccgctaagaaaactgccgccaagaaaactccggctaaaaaagctgccaagaagagtaccgccaaaaagagtccggccaagaagagcgcagccaaaaaataaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
112.seq id no.8(msm-ku)：
113.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgaatcgtgcagtgcgccataccggtctgatgcgcagcatctggaaaggtagcatcgcatttggtttagtgaatgtgccggtgaaagtgtacagcgccaccgaagatcacgatatcaaatttcatcaagttcatgccaaggataacggccgcatccgttacaaacgtgtgtgcgaggtgtgcggcgaagtggtggaatatcgtgatatcaataaagcctttgaaagtgatgacggccagatggtggtgattaccgatgaggacatcgcaactttacccgaagaacgcagccgtgagattgaagtggtggagttcatcccggcagagcaactggatccgctgatgtacgacaagagctacttcttagagccggacagcaagagcagcaagagttatgtgctgctggccaaaaccttagccgaaac
cgaccgcatcgcaatcgtgcacttttctttacgcaataaaagccgtttagcagctttacgcgtgaaagacttcagcaagcgcgacgtgatgatgattcacactttactgtggccggatgagatccgcgacccggattttccgattttagataaagaagttcagatcaaaccggccgagctgaaaatggctggtcaagttgtggagagcatgaccgacgacttcaagcccgatctgtaccacgatgactaccaagaacagttacgtgaactggtgcaagctaaactggaaggtggcgaagcattcagcgtggaagaacagccggccgaactggatgaaggtaccgaggacgtgagcgatctgttagccaagctggaagcaagcgtgaaagcccgtaagggcggcaaaagcgatagcaaggacgatagcgacagcgagagcgacagcaaagagagcaaaagcgacagtaagccggccaaaaaagcccccgctaagaaagccgcagccaagaaaagcaccgctaaaaaagccccggctaaaaaagcagccgccaagaaatcttaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
114.seq id no.9(mtb-ku)：
115.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgcgtgccatttggaccggcagcattgcatttggtttagtgaatgtgccggtgaaagtttacagcgccaccgcagatcacgatattcgtttccaccaagttcatgccaaggataatggccgcatccgctataaacgcgtttgcgaggcatgtggcgaagtggtggattatcgcgatctggcacgtgcctatgagagcggtgatggccagatggtggccattaccgatgacgacattgcctctttaccggaagagcgtagccgcgaaattgaggtgctggagttcgttccggccgccgatgtggacccgatgatgttcgaccgcagctattttttagaaccggacagcaagagcagcaaaagctacgtgttactggccaaaactttagccgaaaccgatcgtatggccatcgtgcattttactttacgcaataaaacccgtttagccgctttacgcgtgaaagacttcggcaaacgtgaagtgatgatggtgcacaccttactgtggccggatgagattcgcgatccggattttccggtgctggaccagaaggtggaaatcaaaccggccgagctgaaaatggctggtcaagttgtggatagcatggcagacgactttaacccggatcgctatcacgacacctatcaagaacagctgcaagaactgattgatacaaagctggagggtggccaagcttttaccgccgaagatcagccgcgtttactggatgaaccggaggatgtgagtgatctgctggctaaactggaagcaagcgtgaaggcccgcagcaaagcaaacagcaatgtgcctaccccgccgtaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
116.seq id no.10(nmu-ku)：
117.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgcgcagcatctggaaaggcagcgtggcctttggtttagttaatgtgccggtgaaactgtacagcgcaaccgaagagaaggacatccgctttcatcaagttcatgcccaagatggtggccgcatcaaatataaacgcgtgtgcgatctggacggcgaggaagtgccgtatgccgatattgccaaagcctacgaaagcgacgatggtcgcacaatcatgctgaccgatgaggattttgctcagctgccggccagcagcagccgcgaaatcgatgttgtgagctttgtgcctagtgaccaagttgatcccgttctgtatgataaaacctactatctggagcccgctagcaccagcaccaaagcctatgtgttactgcgccagactttagaacagaccgaccgtattgccatcgtgaacttcgcactgcgccagaaaacccgtttagcagctttacgtgttcgtgatgatgtgctggtgatccagacactgctgtggccggatgaagtgcgcgccgcagaatttgcctctttagaggaaagcgtgagcattaaaccggccgaactgaagatggccagcatgctggtggatagtttcgccgatgacttccacccggaggactataccgatgagtatcgcgaagagctgcagcaactgatcgaagccaaactggaaggcggcgaagcctttgaaactccggaaaaaccggatgaaggtgaggatgctgaagtggttgatctgctggcagctctgcagcgcagcgttgagcgccataaaaaagctggtgcaagcaccggcgatgatagtggcgatggcgccgatgatagtccgaaaaagagcccgcgcaccagcagcgcaaaaacccgcaccaaagccaccgatgaaaccggtgaccaagataaagacgaggcaaaaccgccgacacgccgtcgtagtccggcacgtaaaaccggttaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
118.seq id no.11(nda-ku)：
119.cccagtcacgacggtctcaaaaaatggttaatccggtgtgggtgggcacactgatgtttggtcgcgtgccggtgggtgtgcgtttatatagcgcacgtgagcgtcgtggcccggttctgcaccagtttgaacgcggtaccgccg
atcgcattcgttatgtgcgcgtgaacgaacgtaccggcgaagaagtggctggtgaagatgtggtgcgtggtgcacgtaccggcgtggaggatgagtacgttgtgctggagccggaagaactggaagaaattttaccgcatggtagccgcacaatggaactgaccggctttttaagtcaaggtgccgttgacgcactgtggtacgccagtacatactatgtggcaccgcgtgccgccgcagatgccaaagcctatcagctgctgtataccgctttagaacagacccgccgtaccggtgtggccaccatcgttctgcgcgatcgcgaataccccgttctgatcgaaccgaatcgcggtgtgctgagcgccagtacactgtggtggccggatgaggttcgcgaaccggatgatgtgatgccgcccgttgcccatgccgcactggccaagagcgaactggaactggcccgcgaactggtgcgtagtctgagcattgagtgggatccggaagattacagcgacagctacggccagcgtctgacagaactggtgcgcgcaaaagcacgtggccgcaccttcacccatcgtccggagcaagctgtgccgcccgaagatgccgatggtctgggtgaagcactgcgccagtctttacccgctcaacgcacacgcggtgcacgtagtcgtggccctcgtgcaagtaccggtgcagaaggtgccggtcgcgcacgtgaacctcgtggtaccggtgcacgtggcgcacgtgtggaacgtcgcggtgaaggtcgcgccaccaaacgcgaactgctgcaacgcgcaagcgagctggatgttcccggtcgtagcaaaatgagccgtgagcagctggaagaagccgttggtttaaatggcgccgaagcccgtcgttaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
120.seq id no.12(pbh-ku)：
121.cccagtcacgacggtctcaaaaaatggcacatatgatctggaaaggcgccatcagctttggtctggtgcatgtgccggtgcagctgtaccccgctaccaaaagcgagaaggtgggctttaatctgctggacaaacgcaccatcgacccgatcggctataagcagatcaacaaacgcaccggcaaagacgtgacccgtgagaatatcgtgcgcggctttgaatatgaaaaagatcattatgtggttctgagcgacgatgagatccgcagcgccaatccggagagcacccagaccgtggacattctggcctttgtggatgccaccgatatcagctttttatatttagacacaccgtattttttaacaccggatcgcaagggtgaaaaagtgtacgctttactgcgcgaagccatgacagccagcggtaaaatcggtgtggccagcgtggtgctgcataataaacagcatttagccgcactgattcctctgggcccgatgctggctttaaatactttacgttgggccgatgaggttcgcggtctggacgagtttaaagtgccgccggaaggcatgaaagcagccggtgtgagcgccaaagagctggatatggctaaaaaactgatttatgatatgtctgaaacttgggatccgatgcagtatcatgataccttccgcgacgacatcatggcactggtggaacgcaagattcaagctggtaaaaccgaggaagtgaccgaagtggaagccccgcacgaaagccgtaaaagcgccgacattttagatctgagcgatctgctgaaacgttctttaggccgtggcaaaggtaaacaagctgcaactggtcgcaaacgcgctgccgatgaggatgaggatcagaccgatagcgaagccgacgaggaacccgctgcaccggcccgtaaacgtgcacgtgcaaccagcaccgcccgtagccgtagcggtagtggtggtagcgcccgcgttaccagcaaaacaaccgccacaagccgcaaacgccgtgcagcagcctaaaagccgagacctcctgtgtgaaa；
122.seq id no.13(psi-ku)：
123.cccagtcacgacggtctcaaaaaatgcgcgccatttggaaaggtgccatcgcctttggtttagtgaacgtgccggtgaaagtgtacagtgcaaccgaggaccacgatatctctttacaccaagttcacaacgccgacggtggtcgtatccgctatcagcgccgctgcgaggtgtgcagccaagtgattgattacagcgacatcgagaaggcatacgaagaggatggtaaaaccgtggtgttaagcaaggatgagctgcaagctattccggccgaaaacagccacgaaatcgaggtggtgcaatttgtgcctagcgaacagctggaaccgatgatgttcgagaagagctattatctggaaccggacagcaagagcccgaaagcctacgttctgctgcgtcgcgctttagaggataccgatcgcgtggccattgtgcagttcgctttacgtgagaaaacccgtctgggcgctttacgcatcaaagacgacgtgctggtgctgcagtctttactgtggccggatgaagttcgtgaggccaatttcccgtctttagatgtgagcatcaagatcagcccgcaagaacgtgatatgagcgccgcactggttgaaagcatggccgccgacttcgacccggaacacttcaccgatgattatcaagttcagctgcgccagctgatcgaagccaaactggaacaaggtgatgcactggacaccgatgaaacttttggcgttgaagccggtgagggtggcaaa
ggtgaggttatcgatttaatggaagctttaaaacgctctttagatcgcaaacgcggtggtggtagcggtacagctggtagtggcagcggtgaagaagcagcagacagcgacgatgaagaagaaggcaaaccggcccctaaacgtgcaaccgctggtaaaaccgccgcagccaaaagcgatggtaccaagagtaccgccgcacgtagcaccgccgcaaaaactggtaccggcaagaccgccaccaagtctaccagcaaagccgcagataccaaaaccggcgcagccaaaaccaccgccgccaaaagcaccgccaagtctaccgccggcaaaaccgcagataaaccggcagccaagaccacagctggtaaagcaaccggcacccgcgcacgtaaaccggcctaaaagccgagacctcctgtgtgaaa。
124.优化后的ligd蛋白的cds编码序列具有seq id no.14～24所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
125.seq id no.14(bsu-ligd)：
126.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggcattcaccatgcagccggtgttaacaagcagcccgcctatcggtgcagagtggcgctatgaggtgaagtacgacggttaccgctgcattctgcgtattcatagcagcggcgtgactttaaccagtcgtaacggtgttgagctgagcagtacattcccggagatcacccagttcgccaaaaccgcatttcagcatctggaaaaggaactgccgctgactttagatggtgaaattgtgtgtctggtgaacccgtgtcgcgcagatttcgagcatctgcaagttcgtggtcgtttaaagcgcccggataaaatccaagaaagtgccaacgcccgcccgtgttgttttctggccttcgatttactggaacgtagcggcgaagatgtgactttactgagctatttagaccgcaagaaatctctgcgtgagctgatcagcgccgcaaaactgccggccagccccgatccgtacgccaaggaaaccatccaaagcatcccgtgctacgaccatttcgatcagctgtgggagatggtgatcaagtacgacggcgaaggcatcgtggcaaagaaaaccaacagcaagtggctggaaaagaaacgcagcagcgattggctgaaatacaaaaactttaaacaagcttacgtttgtattaccggctttaatcctaataatggctttttaaccgtgagcgttctgaaaaacggcatcatgacaccgattgcaagcgtgagtcacggcatgcgcgatgaggagaaaagtgcaattcgcgagattatggaacagcacggtcaccagacaccgagcggcgagttcactttagaaccgagtatttgtgccgcagtgcagtatttaaccattctgcaaggtaccttacgtgaagtgagcttcatcggctttgagttccagatggactggacagagtgcacctatgcccaagttatccgccatagcaaaccggtgcaccctaagctgcagtttaccagtctggataagattatctttgagaaaaataagaaaaccaaagaagatttcattcaatatatgatcgaggtgagtgattatctgctgccgtttctgaagaatcgcgccgtgaccgtgatccgttatccgcacggcagtcgcagcgaaagcttttttcagaagaacaaaccggactacgcccccgattttgtgcagagcttttacgatggcagccacgagcacatcgtttgcgaagatatgagcacactgctgtggctgtgcaatcagctggcactggagttccatgtgccgtttcagacaatcaagagccgccgtccggcagagattgttatcgatttagacccgcctagccgcgacgattttttaatggccgtgcaagctgccaatgagctgaaacgtctgctggatagcttcggtatcaccagttacccgaagctgagcggtaacaagggcatccagctgtatatccctctgagcccggaggcatttacctacgaagaaacccgccagttcacacagctgattgccgagtactgcaccaacgcatttcccgaactgttcacaaccgagcgtttaatcaaaaaccgtcattgcaaactgtatctggattatttacagcacgccgaaggcaaaaccattatctgcccgtacagcacccgtggtaatgagttaggtaccgtggccgcaccgctgtattggcatgaagttcagagtagtctgaccccggctttattcacaattgacaccgttattgatcgtattaaaaaacaaggttgcccgttttttgatttctatcgcaacccgcaagatgaaccgctgagcgccattctgcaccagttaaagaagaaatcttaacacaaggtcttctcctgtgtgaaa；
127.seq id no.15(bve-ligd)：
128.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggttctgacaatgcagccgattttaaccagcgagccccccgaaggtagtgaatggcgttacgaggtgaagtacgacggtttccgctgtttactgcgtatcgacgaaagtggtgttactttaacaagccgcaatggtcagactttaaccaaccagttcccggaaattaccgcattcgccgcccgctgcttccagcatatgaaggatcgttttccgatcactttagacggtgagctggtgtatctgatcaatccgtatcgcgccgactttga
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129.seq id no.16(cne-ligd)：
130.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggccggcgcaaaacagcaagtggaggtggaaggtcgccgcattactttaaccaatttagataaggtgttatatccggccaccggtaccacaaaaggtgacgttattgcctattacgcagccatcgccccgcacatgattcctcatttacgtgatcgtccggtgacccgtaaacgctgggtggatggtgttggcaccgatgaacacccggccaaaatgttttttcagaaggatctggatgcccacacacccgaatgggttctgcgccgtgcaatccagcatcgtgaccatgcaaacgactatccgctggccaatgacgtggccacactgacttggctgggccagatcgcagccttagaactgcatgtgcctcagtggcgctttggtcgtaccggtgatgttcgtcgccccgatcgcttagtgctggatctggatccgggtccgggtgctggtctgcccgaatgtgtggaagttgccaaagccgcccgtgcaattctgcgtgatatgggtttagaaccgtaccccgttacaagcggcagcaaaggcattcatctgtatgccgcactggatggcagtcatgatgcagacgcaatcagcgaagttgcccatgaactggcccgtgctttagaagcagatcatccggatttagtggttagcgatatgcgcaaagctttacgtgaaggtaaggttctggtggactggagtcagaacaatccggccaaaacaaccgtggccccgtattctttacgcggtcgtagccgtccgacagttgcagttccgcgtacttggcgtgagctggcaagtccgacactgcgtcatctggaactggatgaagtggttgcccgtatgcgcacacgtgaggatcctttagccccggttgaagaaggccaccgtgaatctttagaaccgacacgcgaacgtttagccggtttcgcacataaggacgccgatgcagctggtgatcgtctggccacctatcgcagtaagcgcgacgccgcaaaaacaagcgagccggtgccggccgatgcaccggcaccgagcgatggcagcagctttgtgatccaagaacaccatgcacgcgctttacattgggatttccgtttagagcatgatggcgttctggtgagctgggctttacctaagggtgtgccgacagagcatggcaccaatcatttagcagtgcagacagaagatcatccgctggagtacggcagcttcgaaggcaccattccggccggcgaatatggtggcggcgaagtt
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131.seq id no.17(mde-ligd)：
132.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggcactggagacataccgtaagaagcgcgattttagcgttacaccggaacctcaaggtcgtcgtgcccctaaagctggtaacagctttgtgatccaaaaacatgatgcccgccgtttacactatgatttccgtctggagatggacggcgttctgaaaagttgggccgtgacaaaaggcccgagcttaatccccggtgaaaaacgtttagccgtgcacgttgaggatcatccgctggagtacggtggtttcgaaggcacaattccgaaaggcgaatacggtggtggtaccgttattttatgggaccgcggtacatggacccctatcggcgatgcacgccgcggctatgcaaaaggccatctggatttcgaattacatggcgagaaactgggcggtagctggcatttagttcgcatggctggtaaaccgcgcgagaaacgtgagaactggctgctgattaagggtgatgacgatgccgcccgcacagaggatgacccggacattttagacgaacgcccggaaagtattgccaccggccgtaagatcgaagatgttgctggtgaggaaccgggttggagcagtaaaaccggtcgtatccgcaagcgtcgtggtggtcgcactggtgccgcaccccccgaagagcagccggcaaccgtgagtgttccggaaccgagcaaaattaagggcgcaaagaaagccgctttaccggatttcgtggaaccgacactggccactttagttagtagcgccccgagtggtcaacgctggctgcacgagatcaaattcgatggctatcgtttacaagctcgcgtggaggctggtcgtgttaaactgctgacccgtagcggtttagattggacaaaaaagttcggtaaagccatcgttagtgctttagcagatttaccggttggtaccgcactgatcgacggtgagttagtggttgagacaagcgctggtgccagcgacttcagtgaattacaagctgatctgagtgagggccgtagcgatcgcttccgtttatacgttttcgatttactgcatttagatggttatgatctgcgcgatgtggcaagcatccagcgcaaggaactgctggagaagattatcggcagcggcagcggcatcattagctacagtggtcactttgaagaagatggtccgctggttctgcgtcatgcttgtcgtctgtctttagaaggtgtggtgagtaaactgcgcgatgcaccttaccgtgctggtcgtagcaagaactgggtgaaaagcaagtgcagcgcccgccaagaatttgtggtggccggctatgtgcctagcaccaccagccgtaatgcaattggcagtctggtgctgggcgtgtatgacgatggcaaactgcaccacgttggccgtgtgggtaccggctacacagcagccgttgccgaaggtttattcaagaagctggaacgcatccgtattccgagtagcccgttcgatgaacgtttaagcgccgaagaaactcgccaagttcgttatgtgcgtccggagctggttgccgagattgaattccgtgcttggacagcagatggca
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133.seq id no.18(mfo-ligd)：
134.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggaacgctatgaacgtgtgcgtttaaccaaccccgataaggttctgtaccccgctagcagcaccaccaaagcagaggtgtttgattattatctgagcatcgccgaagttatgctgccgcatattgccggtcgtccggttacccgtaaacgttggccgaatggtgtggcagaagccagcttcttcgaaaagcaactggccagtagtgcaccggattggctggaacgtggcaccattgtgcataagagcggcaccaccacctaccctatcgttaacacccgcgaaggcttagcatggatcgcccagcaagcttctttagagctgcatgttccgcaatggcgctttagcagcgatggcagccaaggtccggcaacccgtatcgtgttcgatttagatccgggtgaaggcgttacaatgcctcagctgtgcgaggttgcccaagccgtgcgcgaactgatgagcgacatcggcttaatgacctatccgctgaccagtggtagcaaaggtttacatttatacgttccgctggcagaccctatcagcagccgcggtgcaagcgttctggccaagcgcgttgcagtgcagctggagcaagctatgccgaagctggttaccgcaaccatgacccgcagtctgcgcgcccagaaagtgtttttagactggagtcagaataatgcagccaagaccacaatcgcaccgtattctttacgcggtcgtgattacccgaccgttgcagcaccgcgtacatgggatgaaattggcgacccggatttacgccatctgcgtttcgacgaagttctgcagcgcatcagtgacgatggcgatttattagctggtttagatgacgatgccccggttgccgataaactgaccacctatcgcagcatgcgcgatgcaacaaaaaccccggaacccgttccgcgcgatatcccggttcgcggtaacaacgatcgtttcgttattcaagaacatcacgcacgtcgtttacattatgatctgcgtctggaacgtgatggcgtgctggttagctgggcagttccgaaaaatttaccggacaccaccgccgttaatcatttagccgtgcacacagaagatcaccctatcgagtatttaacctttcacggcacaattccgaagggcgagtatggtgctggtaatatggtgatctgggacaccggtacctatgaggccgagaaattccgcgttccggccgatccggatgacagcgatgcaccgaagggtgaagttatcttcactttaaatggtaaccgcatcgatggccgttacgcactgatccagaccgaaggtaagaactggctggcacatcgcatgaaggatcagagcagcgccgcacccgaaccgaaagacttcgccccgatgttagcaaccgaaggcagtgtggccaagctgaaggccacccagtgggccttcgaaggtaaatgggacggctaccgcttactggtggaggccgaacatggtcgcttacaactgcgtagtcgccgcggccgtgatgttaccgccgagtatccgcagtttgaagcactggccgccgatctggccgatcatcatgtggtgctggatggtgaagccgttgccttagacgatcacggcatgccgagcttccgcgagatgcagaaccgcgcacgcagtacacgtgttgagttctgggcctttgatattttatggctggatggtcgctctttactgcgcgcaaaatacacagaccgccgcaaactgctggaagcactggcagctggtggtggtctgattgtgccggaacagctggctggtg
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135.seq id no.19(msm-ligd)：
136.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggaacgctacgaacgtgtgcgtttaaccaaccccgataaggtgctgtaccccgctaccggcaccaccaaagccgaagtgtttgattattatttaagcattgcacaagttatggtgccgcacatcgccggtcgtccggttacacgtaaacgctggccgaatggcgtggccgaagaagcattctttgagaagcagctggccagcagtgccccgagttggttagaacgcggcagcattacccataaaagcggcaccaccacctaccctatcattaacacccgcgaaggtctggcatgggttgcccagcaagcttctttagaagtgcatgtgccgcagtggcgctttgaagatggtgaccaaggtccggcaacccgtatcgttttcgatttagacccgggtgagggcgtgaccatgacccagctgtgcgaaatcgcccacgaagtgcgcgctttaatgaccgatctggatttagagacatacccgctgacaagcggcagcaaaggtttacatctgtacgttccgctggcagaaccgattagcagccgtggtgcaagcgttctggcacgccgtgtggcacagcagctggaacaagctatgccgaaactggttaccgccaccatgaccaaatctttacgtgctggtaaggtgtttctggattggagccagaacaacgcagcaaaaaccaccatcgccccgtatagtttacgcggtcgtgaccatcctacagtggccgcccctcgcacttgggacgaaattgccgatccggaactgcgccatttacgctttgatgaggtgctggaccgtctggacgaatacggtgatctgctggcacctctggacgcagacgccccgattgccgataagctgacaacctaccgtagtatgcgcgacgcaagtaaaaccccggaaccggtgccgaaagaaattccgaaaactggtaataatgacaaattcgtgatccaagaacatcatgcccgtcgtttacactacgacttacgtttagagcgcgacggcgtgctggttagtttcgccgtgcctaaaaatttaccggaaaccaccgcagaaaaccgtttagccgttcacaccgaagatcacccgattgaatatttagccttccacggtagcatccctaaaggcgagtatggtgccggcgatatggtgatttgggacagcggcagttatgaaaccgagaaattccgcgtgccggaagaactggataacccggacgacagccacggtgaaatcatcgtgactttacacggcgaaaaggttgacggccgttacgctttaattcaaaccaagggcaaaaactggctggcccaccgtatgaaagaccagaaaaacgcccgtccggaggattttgcccctatgctggccaccgaaggcagtgtggccaaatacaaggccaaacaatgggccttcgagggtaaatgggatggctaccgtgtgattatcgacgccgatcatggtcagctgcagatccgtagccgtaccggccgtgaagttaccggcgagtatccgcagtttaaagctttagccgcagatctggcagagcatcacgttgttctggacggcgaggccgttgccttagatgagagcggcgtgccgagttttggccagatgcagaatcgcgcccgtagcacccgtgtggagttttgggccttcgatattttatggttagacggtcgttctttactgcgtgcaaagtatagcgatcgccgtaaaattttagaagctttagcagacggtggtggtctgattgtgcccgatcaactgccgggtgacggccccgaagccatggaacacgtgcgtaaaaagcgcttcgagggtgtggttgccaaaaagtgggatagcacctaccagcccggtcgtcgcagcagcagctggatcaaagataaaatttggaatacccaagaagttgttattggcggttggcgtcaaggtgagggtggtcgcagcagtggtattggcgctttagttctgggcattccgggtcccgaaggtttacagttcgtgggtcgtgttggcaccggttttaccgaaaaagaactgagtaagctgaaagatatgctgaagccgctgcataccgatgaaagcccgttcaacgcaccgctgccgaaagtggatgcccgtggcgtgacctttgtgcgccccgaactggtgggcgaagtgcgttatagcgagcgcaccagcgatggtcgtttacgtcaacctagttggcgtggtttacgcccggataagacaccggatgaggtggtttgggaataacacaaggtcttctcctgtgtgaaa；
137.seq id no.20(mtb-ligd)：
138.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatgggcagcgcaagcgaacagcgcgttaccttaaccaacgccgacaaagtgctgtatccggcaaccggtaccaccaaaagcgacattttcgactactatgctggtgtggcagaggtgatgctgggtcatattgccggtcgcccggcaacccgtaaacgctggccgaatggcgttgatcagccggcatttttcgagaagcagctggctttaagtgcacccccttggctgagccgtgccaccgttgcacaccgtagtggtaccaccacctaccctatcattgatagcgccaccggtctggcttggattgcacagcaagccgcactggaagtgcacgtgccgcagtggcgtttcgtggccgaaccgggtagtggcgaattaaatcccggtccggctacccgtttagtgttcgatctggatccgggcgagggtgtgatgatggcacagctggccgaagttgcacgcgcagtgcgtgacttactggcagacattggcttagtgacctttccggtgacaagcggcagtaaaggtctgcatttatacaccccgctggatgaaccggtgagtagtcgcggcgccacagtgctggcaaaacgtgttgcacagcgtttagagcaagcaatgcccgctctggtgaccagcacaatgaccaaaagtctgcgcgccggcaaggtgtttgtggattggagtcagaacagcggcagcaagaccacaattgcaccttatagtctgcgcggtcgtacccatccgaccgttgcagccccgcgtacatgggcagaactggacgatcccgctctgcgccagctgagctatgacgaagttctgacacgcattgcccgcgatggcgatctgctggaacgtttagatgcagatgcaccggttgcagatcgtttaacccgctaccgtcgtatgcgtgatgcaagcaaaacccccgaaccgatcccgaccgccaagcccgttaccggtgacggtaacacattcgtgattcaagaacatcatgcccgtcgcccgcactatgattttcgtttagaacgtgatggcgtgctggtgagttgggccgttccgaaaaatctgccggataacaccagcgttaaccatttagccattcacaccgaggatcacccgctggagtatgccacctttgagggcgcaattcctagcggtgaatatggtgccggcaaagtgatcatctgggacagtggcacctatgataccgagaaatttcatgatgacccgcacaccggtgaggtgatcgttaatttacatggtggccgtatcagcggtcgctacgcactgattcgcaccaatggcgaccgctggctggcccatcgtttaaagaatcagaaagatcagaaagtgttcgagtttgataatctggcccctatgctggcaacccacggtacagtggccggtctgaaggccagccagtgggcatttgaaggcaaatgggatggctaccgcttactggttgaagcagatcacggtgcagtgcgtctgcgcagtcgtagcggccgtgatgtgaccgccgaatatccgcagctgcgcgctttagcagaagatttagcagatcatcacgttgtgctggatggtgaggccgtggttctggacagcagcggcgtgccgagtttcagccagatgcaaaaccgcggtcgtgacacacgcgtggaattctgggcctttgacttactgtatctggatggccgtgcactgctgggcacccgttatcaagatcgccgtaaactgttagaaactttagcaaacgcaacctctttaaccgttccggaactgttaccgggcgacggtgcccaagcttttgcttgtagtcgtaaacacggttgggaaggtgtgattgccaaacgtcgtgacagccgttatcagcccggtcgccgttgtgccagctgggttaaagataaacattggaatacccaagaagtggtgatcggtggctggcgtgctggtgaaggcggtcgtagcagcggtgtgggtagtttactgatgggcatcccgggtccgggtggtctgcagtttgctggtcgtgtgggtaccggcttaagcgaacgtgaactggccaatctgaaggagatgctggcaccgctgcacaccgatgagagtcctttcgacgtgccgttacccgctcgtgatgccaaaggcatcacctacgttaagccggcactggtggccgaagttcgctatagcgaatggacaccggaaggccgtttacgccagagtagctggcgtggtttacgtccggacaaaaaaccgagcgaggtggttcgcgagtaacacaaggtcttctcctgtgtgaaa；
139.seq id no.21(pae-ligd)：
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141.seq id no.22(pbr-ligd)：
142.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatgggtcgtgaccaccctctgagtgcctaccacgccaaacgtgattttgcacacacccccgaaccggctggtgagaaacgcgtggccaaacgccgtggtaaggccgttcagcccgctttacagtttgttattcagcgccatcatgcccgtcgtctgcactacgattttcgtttagaatggggcggcacactgaaaagctgggcagttcctcgcggtcctagcttagatcccgatattcagcgtttagcagttgaagttgaagatcatccgctggattacgctggtttcgagggtacaattccgaaaggtcactatggcgctggtgatgtggcaatttgggatcgcggcgaatggattccggagggtgatgcagaagagggtttacgtcgtggcaagctgcatttcgaactgcgcggtacacgtctgcacggtgcttgggttttatttcgtctggccggcgagggtgaccaatggatgctgcgtaagcgccgcgatcagcatgcccgtatcggtgatggtgatgccgttctgcacgatcctccggaagcagaagcaccgcccgctcccgctcccgctcccgttgcagcaaagagcccgcgtagtagcgcagcaagtagccgtcgtcgtcgtgtgccggtgccggaatttgtggagccgcagttagccactttagtggatcgcccgcccgttagcgatgcatgggtgtacgagatcaaatacgacggcta
ccgcatgctggtgcgttgcgatggccgtcaagttcgtttattcagccgtaacggcattgaatggaccgaacgtttaccgagtctggttcaacgtctgagcgctttacaaagccatagcggctggctggacggcgagattgttgtgatggacgagcatggccataccgatttccatgctttacaagctacactggatagtggcgccccgcaagttgagtatgtggtgttcgacgtgccgtggtgggatggtgaagatttacgcgaccgtccgctgagtcatcgtttacaagctttagatgagatctttgccgcactgccggcacaacccggtttaagtcgtagtaaaccgctggatccgggttatgttggccaagctgttctgcaagctgcatgccagctgggtctggaaggtctgatcggcaagcgtctggatgcaccttatcgcagcggccgtagcccgcattggattaagctgaaatgccgcagcgaacaagaagttgttattggtggttacaccgagccgcgtggcagtcgcggccacttaggtgcactgttagtgggcgtgtggggtaaagatggccagctggattatgccggccgtgttggcagtggttttgatcaagctggtttacaagctatgcgtgaacgtctggcaccggatgaaaccgcacgctgtccgtttcgtagcaaaccttctttaccgggtgcccctaccgtgcattgggtggagccggtgcatgtggttcaagttcgctatgcaagttggacccaagaaggtttactgcgtcaagctagctttgtgggtgtgcgcgaggacaaaccggtgcgcaaggttgtgcgtgagctgccgcagaccgtggcacaagaagataccccgatgcgtcctagcgccacacgtctggctggtcgtccggcaagtccggcagccacagcagcacgcgcaagtctgcgccgtagtggtgccagcagcgacccgaaagcaaacagtgttggcggcgttcgtgttacacatccggagcgtctggtgttcagcgttcctcgcattaccaaactggaagttgttcgctatcatgaagatatcggtgaatatctgctgcctcatttagcagcccgccctctgagcttactgcgctgtccgcaaggcaccggcggtgagtgcttcttccaaaaacatgtggaaaccactttaccgagcggtgtggaaagcgttgaagttcccgctagtgacggtaccgacacactggtgatggtgaacagcgtggaaggtattgttgctttagcccagtacggcaacgttgaatttcacacttggggcgcacgtgcacctcgtcccgatcgtccggaccgtatcaccatggatctggatcccgatcccgatttaccgtgggcccaagttgtggaagccgcccagctgacccgtgttttactggaagaactgggtctggccgcctttttaaaaaccaccggcggcaagggtttacatatcgtgaccccgatcaaagccacccgtagttgggacgaagtgaaagccttcacaaagggtctggccagccgtctggccagtgttgcccctcagcgttttaccgcccgtctgagtaagagcagccgcggtggtcgtatttttattgactatttacgtaatggccgcggtgccacagcagtggcaagttattctttacgcgcacgtgaaggtgcaccggtgagcgttccgctgcattgggatgagttaagcgccaagaaagacgtgcgtgccgaacacttcaacttacgcaatgccgttgcccgtgcaccggagagtgaaaccgcatggcaagattatgccgcccagcgccgtaccttaacagttaagatgtttcgcgctttaggtgtggatccgggtagcgcagaaagctaacacaaggtcttctcctgtgtgaaa；
143.seq id no.23(ppu-ligd)：
144.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggccaagccgctgcaagaatatgcacgcaagcgtgactttaacgcaaccccggaaccgagcggcaaacgcagtcgtggcaagaaggcacacgcactgcagttctgcatccagaaacacgatgccagccatttacattatgacttccgtttagaactgggcggcactttaaaaagctgggccattccgaagggcccgagcttagaccctaatgtgcgtcgtctggccgttcatgtggaagatcatccgctggactatgccgatttcgaaggccatattccggagggccactatggcgccggtgatgtgatcgtttgggaccgtggtatctgggaaccggagggcgatgcccaccaaggttatgccaaaggcaaattaaagttccgtttacaaggtgagaaactgagcggtgtttggcatttattccgtacacatttagctggtaaaaaagagcagtggatgctggtgaagagccatgatgcccaagctcgcagcgaggccgagtacagtattgttaacgcacagccggacagcgttctgagcgaccgtactttaattcctcgtaaaccggccgccaaacaagctgcagccaaacctcgtgccacacgtaaacgtcccggtaaggttcgccaagcagcattaccgaaccagctgcagccgcaattagccactttagttgatacacctccgcaaggtgactggcgttacgaggtgaagtttgatggctatcgcattctggcccgcatcgatggtgacgacgtgcgtctgtttacccgcaatggccacgattggagtagtaaaatgccgcgccagctggcagctttacgtgcactgggtatcgatagcgcttggctggatggcgaaatggtggtggccgatg
aaaacggtgcagcagatttccaagctttacaaaatgcctttgataccgagcaagatgaacacatcacctactatgtgtttgatttaccgtttttaggcggtcaagatctgcgccatgcaccgctgcaagatcgtcgtgaaactttaaaaacattactggaccacgacgccagcgatgttctgaaatatagcgccgattttgatgagcccgttgatgcactgctggccagtgcatgccgtctggaactggagggtttaattggcaagcgcgccgacagcccgtatagtggtcgtcgcagtggcgactggattaaactgaagtgtaagcgccgccaagaattcgtgctggttggttacaccgacccgaaaggcagccgcagcggtttcggtgctttattactggctttacatgatcccgataacggcgaactgcgttatgccggcaaggttggcaccggttttacagcagcaactttagcaagcatccacacacgtttacaaccgctggagattgccaaaccggcagttacccgtcctccgagtggtgccgaagcacgcggcgttcactggctgaagccgcaattactggcagaagtggcctacgcccaaatgacacgcgacggtattgtgcgtcatagcgtgttccacggtctgcgtgacgacaaaccggccaccgcaattgatctggaacgccctatgagtaccaacaccacacctcgtcgtaaacgtggtaaagcagcacctctgagcgaggatttacatctgacccatccggatcgtgttattgacgccaccactggtgttacaaagcgtgatgtggccgagtactacgccgccgttagccagtggctgctgcctcagattcagcatcgtccggtggccttagttcgtgcaccggatggtctggctggtgagctgttcttccaaaagaacgccagccagctgcatttaccgaacgtgctggagtatgacaaagcccaagctggtcaagctgcaatggtgatcaatcgcgccgatactttactgggtgcagttcagatgaatatgctggaactgcacagctggaatgcaaccgacaaggatttcgacaagccggatcgctttgtgctggatttagatccggaccccgctttaccttggaaggcaatgctggaagcaacccagttaacactgactttattagacgagctgggtttaaaagtgttcatcaagaccagcggtggcaagggtattcatttagtggtgccgttaacccgtcgcgctggttgggatgaggttaaagcctttagccacgccatcgtggaatatctggccaagctgttccccgatcgtttaagcgccgttagtggtccgaaaaatcgtattggtcgtatttttattgactatctgcgtaatgcccgtggtgcaacaacagcttgtgcctactctttacgcgcacgtgaaggtatgccggtgagcgtgcctatttggcgtgaggagctgaccgcactgaaggccgcaaatcagtggaatatcgcaaatttacccgctcgtttagccgaagttgacgatccgtgggccgatctgggccgtgtgcgtcagagcatcacagcccgcatgcgtaagcaactgggtttagcctaacacaaggtcttctcctgtgtgaaa；
145.seq id no.24(pvi-ligd)：
146.cccagtcacgacgaagacgcaaaaatggcaaagccggtgagtgaatatacccgcaagcgcaacttcgacattaccagcgagcccgctgaggctggtagtaaaatgcgcagcgccaaagcccacgcactgagcttcgttatccagaagcacgatgccagccatctgcactatgatttccgtctggagctggacggtacactgaagagctgggccgtgcctaagggccctagcttagatcctacccagaaacgtttagccgtgcatgttgaggatcatcctctgggttatgcaagcttcgaaggcagcattccgaagggccagtatggtggtggcgacgttattgtgtgggatcgcggtgtgtgggagccgcacggtgatcctcgcaaaacctacgccgaaggcaagctgaaattcacactgattggtgaaaagctgactggtgattgggctttagttcgtacccgtctgaagggtagcggtagcaaagagcagtggctgctgattaaggagaaggatagcgttgcccgcccggccgatgagtatgatatcattgaacagcagcctcaaagtgtgattagtggcgcccatgtgggcgttggtcgcgttccggcaagcaaagccaagccgcgcagcacaaaaaccaaaaccgataccgcaccggcaaaaccgagccgcatgagcagccgtaccaaggccaaagccgcactgcccgaactgttaaccccgcaactggcaacactggttgatgcccctccggctggtgaatggctgtacgagatcaaatttgatggctaccgcattctgacacgcatccaaggcgacgatgttcgtctgttcacccgcaatggtcacgattggaccgaacgtctgccggagctggcaaaagcaatcaaagctttaaaactgcaagatacttggttcgacggcgaagtggttgtgttaaacgatcaaggtttaccggattttcaagctttacagaacgccttcgaaatcggtcgcagcaaggatattttatattatttattcgatatgccgtatctgaccggcgaagatctgcgcgaggtgccgatcgaacaacgtcgcgatgctttaaagcaagttctgggtaagcagcgtagccgtttactgcgctttagcgatgcattccgtagcggccacaaagacattgttgagagcgccagcgcaatgggtctggagggcgtgattgg
caaacgcgctggtagtccttatgtgagcaaacgcaatgccgactggatcaagctgaaatgtcgtctgcgccaagagttcgtgattgttggctatacagcccctcaaggtagccgcagtgcattcggcgcactgctgctggccgttaatgatgacgacggtctggtgtatgccggccgtgtgggcactggtttcaccagccagactttaaaacaactgcatgaccaactgcaacctttagagcgcgataccagtccgctggacaagaaactgaccagcgcacaagctcgtggcgtgcaatgggtggaaccgcgtttaatctgcgaagccgagtttgcagagtggacccgcgaaggcattctgcgccaagcagcctttgtgggtttacgcagcgacaaaccggcaagcgaggtggttcgcgaatatccgcagcccgctgacattgccagccgtccgaaagcagcaaaaagcagcaagaccaaggcattagaggcccccgttgcccgcaaaaccgcacgtggcaaagtgaatgtggctggtgtgggtattagccacagcgaccgcgtgattgatagcaagagcggcacccagaagatcgaactggcacaattctacgaaagcatcgccgattggattttaccgtatttaaacaatcgcccggttgcactgctgcgctgtccggaaggcattgacggcgagcaatttttccagaagcatagcgagcgtttagcaattccgcacattcgccagctggatcgcaaactggatccgggtcatgcagcactgatggaaatcgacaccgtgcaagctttagtgggtgccgcacagatgggtgccatcgaatttcacacttggggcgccaccagtgatcgtatcgagacacccgatcatctggtgctggatttagaccccgatccggccttaccgtggcgcagcatgatcgaagcaacccagatggtgctggccgttttagaggagctgggcttagaagcctttttaaaaaccagcggcggcaaaggcatgcatatcatcgtgcctttagcccgccacgcagattgggataccgtgaaaggcttcgccaaagccatcgccgaatttgttacccagcagctgccggaacgcttcaccgccacaatgggtcctaaaaaccgtgtgggccgcatcttcgttgattatctgcgtaatagccgtggcggcagtacagtgaccgcatacagcgttcgcgcccgccccggtctgcccgttagtgttccgatcgctttagacgaactggctggtttaacaagcagcgcccagtgggatgttacaaatttagagcagcgtctgcgcgaactgaagggcgacccgtgggagggttatcgtaatcgtcagcgcatcacacagaaaatgtggaagcagctgggtgcaaagcgtagttaacacaaggtcttctcctgtgtgaaa。
147.(3)酶切pdual-cas9-parental质粒。
148.酶切反应体系如下：
[0149][0150]
37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。
[0151]
(4)酶切11种ku蛋白的cds编码序列。
[0152]
酶切反应体系如下：
[0153][0154]
37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。
[0155]
(5)连接。
[0156]
将步骤(4)纯化后的ku蛋白的cds编码序列按等分子数混合，再与步骤(3)纯化的酶切载体片段混合，进行连接。
[0157]
连接反应体系如下：
[0158][0159][0160]
22℃反应1h，反应结束后将连接产物转化top10感受态细胞，涂布卡那霉素抗性lb平板，30℃培养过夜，次日将平板所有克隆刮板抽提质粒，将质粒进行ngs测序分析ku蛋白的cds编码序列的克隆情况，测序结果显示质粒文库含有11种ku蛋白的cds编码序列。
[0161]
(6)酶切。
[0162]
将步骤(5)中刮板抽提的质粒使用bbsⅰ进行酶切。
[0163]
酶切反应体系如下：
[0164][0165]
37℃反应1h，反应结束后使用酚/氯仿/异丙醇沉淀的方法对酶切产物进行纯化。
[0166]
(7)酶切11种ligd蛋白的cds编码序列。
[0167]
酶切反应体系如下：
[0168][0169]
37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。
[0170]
(8)连接。
[0171]
将步骤(7)纯化的ligd蛋白的cds编码序列按等分子数混合，再与步骤(6)纯化后的载体片段混合，进行连接。
[0172]
连接反应体系如下：
[0173][0174]
22℃反应1h，反应结束后将连接产物转化top10感受态细胞，涂布卡那霉素抗性lb
平板，30℃培养过夜，次日将平板所有克隆刮板抽提质粒，得到ku ligd质粒文库，将质粒进行ngs测序分析ligd蛋白的cds编码序列的克隆情况、文库ku ligd组合的覆盖度情况，测序结果显示质粒文库含有121种ku ligd质粒，即ku ligd质粒文库构建成功。
[0175]
实施例3从ku ligd质粒文库筛选在大肠杆菌体内有效的nhej系统
[0176]
本实施例对在大肠杆菌中有效的nhej系统进行筛选，包括如下步骤：
[0177]
(1)将实施例2构建的ku ligd质粒文库电转至mg1655大肠杆菌感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性lb平板，30℃培养过夜。
[0178]
(2)将平板所有克隆刮板并将菌液接种至lb培养基，于30℃、220rpm条件下培养，当菌液od
600
值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞。
[0179]
(3)电转pdual-sgrna-lacz质粒至步骤(2)制备的电转感受态细胞，涂布含iptg、x-gal、卡那霉素和氨苄青霉素的lb平板，30℃培养过夜。
[0180]
(4)挑取192个白色单克隆至lb培养平板培养8小时，使用菌落pcr的方法扩增每个单克隆的ku、ligd以及lacz基因序列。
[0181]
pcr扩增体系如下：
[0182][0183]
其中，lacz基因的pcr扩增引物如seq id no.25和seq id no.26所示。
[0184]
seq id no.25：agcatctggtcgcattgggtcaccagc；
[0185]
seq id no.26：cttccagataactgccgtcactccagcgc。
[0186]
ku基因的pcr扩增引物如seq id no.27和seq id no.28所示。
[0187]
seq id no.27：cttcagccatacttttcatactc；
[0188]
seq id no.28：agctggacaccgtttaaactcaatg。
[0189]
ligd基因的pcr扩增引物如seq id no.29和seq id no.30所示。
[0190]
seq id no.29：tctgttgtttgtcggtgaactg；
[0191]
seq id no.30：ctggtattggcacaaacctgat。
[0192]
反应程序如下：
[0193]
预变性：96℃，6min；
[0194]
循环扩增：94℃，30s；58℃，30s；72℃，50/120s；循环35次；
[0195]
循环外延伸：72℃，5min。
[0196]
扩增产物于4℃保存。
[0197]
其中，扩增lacz和ku基因，pcr延伸时间为50s；扩增ligd基因，pcr延伸时间为120s。
[0198]
lacz基因的扩增结果如图1所示，ku基因的扩增结果如图2所示，ligd基因的扩增
结果如图3所示，由上述图片可以看出，挑取的192个菌株中共有132个克隆的lacz、ku和ligd基因均扩增成功。
[0199]
将lacz、ku和ligd基因均pcr扩增成功的克隆对应的pcr产物纯化后进行sanger测序分析，lacz基因的pcr产物使用seq id no.25和seq id no.26进行测序，ku基因的pcr产物使用seq id no.28进行测序，ligd基因的pcr产物使用seq id no.30进行测序。
[0200]
测序结果显示，132个克隆的lacz基因均发生基因编辑，有不同长度的序列缺失或插入，132个克隆对应的ku ligd组合的结果如表1所示：
[0201]
表1
[0202][0203][0204]
由表1可知，共有24种ku ligd组合可以作为大肠杆菌的nhej系统，其中mno-ku mfo-ligd频数最高，达到32，mbr-ku mfo-ligd频数为18，均高于现有文献报道的msm-ku msm-ligd组合频数，表明mno-ku mfo-ligd、mbr-ku mfo-ligd作为大肠杆菌nhej系统，基因编辑效率优于msm-ku msm-ligd。此外，mno-ku msm-ligd频数和msm-ku msm-ligd相近。
[0205]
实施例4计算nhej系统末端连接效率
[0206]
本实施例分别以mno-ku mfo-ligd、mbr-ku mfo-ligd、mno-ku msm-ligd以及msm-ku msm-ligd作为大肠杆菌的nhej系统，计算四种nhej系统的连接效率，包括如下步骤：
[0207]
(1)参考“实施例2”，使用bsaⅰ分别酶切pdual-cas9-parental质粒以及mno-ku、mbr-ku和msm-ku蛋白的cds编码序列，使用t4 dna连接酶分别将mno-ku、mbr-ku和msm-ku蛋白的cds编码序列连接到pdual-cas9-parental质粒，最终得到pdual-cas9-mno-ku、pdual-cas9-mbr-ku和pdual-cas9-msm-ku质粒，然后使用bbsⅰ分别酶切pdual-cas9-mno-ku、pdual-cas9-mbr-ku和pdual-cas9-msm-ku质粒以及mfo-ligd和msm-ligd蛋白的cds编码序列，通过t4 dna连接酶分别将mfo-ligd和pdual-cas9-mno-ku、mfo-ligd和pdual-cas9-mbr-ku、msm-ligd和pdual-cas9-mno-ku、msm-ligd和pdual-cas9-msm-ku进行连接，最终得到pdual-cas9-mno-ku mfo-ligd、pdual-cas9-mbr-ku mfo-ligd、pdual-cas9-mno-ku msm-ligd以及pdual-cas9-msm-ku msm-ligd质粒。
[0208]
(2)将pdual-cas9-mno-ku mfo-ligd、pdual-cas9-mbr-ku mfo-ligd、pdual-cas9-mno-ku msm-ligd以及pdual-cas9-msm-ku msm-ligd质粒分别电转mg1655大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性lb平板，30℃培养过夜。
cas9-mno-ku msm-ligd质粒分别电转mg1655大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性lb平板，30℃培养过夜。
[0223]
(2)分别挑取单克隆至lb培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液od
600
值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞。
[0224]
(3)使用speⅰ限制酶酶切pdual-sgrna-lacz质粒。
[0225]
酶切反应体系如下：
[0226][0227]
基因合成pcnb-sgrna-for-gibson序列，序列如seq id no.31所示。
[0228]
seq id no.31(pcnb)：
[0229]
tttaacttgctatttctagctctaaaacggttcacgcgcatatcgttaactagtattatacctaggactgagctagctgtca。
[0230]
使用gibsonmaster mix试剂盒将speⅰ酶切后的pdual-sgrna-lacz质粒和pcnb-sgrna-for-gibson序列进行连接反应，连接反应体系如下：
[0231][0232][0233]
反应条件为50℃连接反应1h。
[0234]
连接产物转化top10感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性lb平板，37℃培养过夜，次日挑8个单克隆测序，将测序正确的质粒命名为pdual-sgrna-pcnb。
[0235]
(4)分别电转pdual-sgrna-pcnb质粒至步骤(2)制备的三种电转感受态细胞，涂布卡那霉素、氨苄青霉素的lb平板，30℃培养过夜。
[0236]
(5)挑单克隆至lb平板培养8小时，通过菌落pcr扩增pcnb基因，pcr扩增体系及反应程序参考实施例3的步骤(4)，延伸时间为50s。
[0237]
pcnb基因的pcr扩增引物如seq id no.32和seq id no.33所示。
[0238]
seq id no.32：gccgcaaggtgctaagccgcgaggaaag；
[0239]
seq id no.33：cagggcagcattgacctgctccagc。
[0240]
pcr扩增结果如图5所示，将扩增成功的pcr产物纯化后进行sanger测序分析。
[0241]
pcnb基因的pcr产物使用seq id no.32和seq id no.33进行测序，测序结果显示：所有克隆的pcnb基因均出现不同长度的序列缺失或插入，基因编辑后的pcnb部分测序结果比对结果如下：
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247][0248]
其中，pcnb-1、pcnb-2和pcnb-3：转化pdual-cas9-mno-ku mfo-ligd质粒的pcnb基因的编辑后的序列；
[0249]
pcnb-4、pcnb-5和pcnb-6：转化pdual-cas9-mbr-ku mfo-ligd质粒的pcnb基因的编辑后的序列；
[0250]
pcnb-7、pcnb-8和pcnb-9：转化pdual-cas9-mno-ku msm-ligd质粒的pcnb基因的编辑后的序列；
[0251]
pcnb-ref：mg1655大肠杆菌pcnb基因原始序列。
[0252]
上述实验结果证明本发明筛选的mno-ku mfo-ligd、mbr-ku mfo-ligd以及mno-ku msm-ligd可以作为大肠杆菌的nhej系统，并用于大肠杆菌基因编辑中。
[0253]
综上所述，本发明通过使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具，可以迅速筛选出在大肠杆菌中有效的nhej系统，末端连接效率计算实验证明所述nhej系统具有良好的末端连接效率。本发明成功将外源nhej系统引入大肠杆菌，并可以进行高效的基因编辑，具有实际应用的价值。
[0254]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。