一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用的制作方法

技术特征：
1.一种使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，其特征在于，所述使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具包括：pdual-cas9-parental质粒载体：含有dna解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、arac基因、阿拉伯糖启动子和ⅱs型限制酶识别位点；和pdual-sgrna-lacz质粒载体：含有靶向lacz基因的sgrna序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。2.根据权利要求1所述的使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，其特征在于，所述dna解旋酶基因包括rep101基因；优选地，所述复制子包括psc101复制子；优选地，所述核酸酶基因包括cas9基因；优选地，所述阿拉伯糖启动子的数量为2个；优选地，所述ⅱs型限制酶识别位点为至少2个；优选地，所述ⅱs型限制酶识别位点包括bsaⅰ和/或bbsⅰ。3.根据权利要求1或2所述的使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，其特征在于，所述组成型表达的强启动子包括j23119启动子。4.一种计算nhej系统连接效率的方法，其特征在于，所述计算nhej系统连接效率的方法包括：将nhej系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；将酶切后与未酶切的质粒分别转染制备的感受态细胞，培养；统计平板上的克隆数，计算nhej系统的连接效率。5.根据权利要求4所述的计算nhej系统连接效率的方法，其特征在于，所述nhej系统为经过权利要求1～3任一项中所述的使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具筛选后的nhej系统；优选地，所述nhej系统为同时连接有ku蛋白和ligd蛋白的cds编码序列的pdual-cas9-ku ligd质粒载体。6.根据权利要求4或5所述的计算nhej系统连接效率的方法，其特征在于，所述酶切包括限制酶酶切；优选地，所述酶切包括ecor
ⅴ
限制酶酶切。7.根据权利要求4～6任一项所述的计算nhej系统连接效率的方法，其特征在于，所述nhej系统的连接效率的计算公式为：转化1ng酶切后的质粒的克隆数与转化1ng未酶切的质粒的克隆数的比值。8.一种通过nhej系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，其特征在于，所述基因编辑的方法包括：将nhej系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；构建靶向目的基因的pdual-sgrna质粒；将构建的所述靶向目的基因的pdual-sgrna质粒转化制备的感受态细胞，培养；挑取克隆进行验证，分析基因编辑的情况。9.根据权利要求8所述的通过nhej系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，其特征在于，所述nhej系统为经过权利要求1～3任一项中所述的使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通
量筛选工具筛选后的nhej系统。10.根据权利要求8或9所述的通过nhej系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，其特征在于，所述nhej系统为同时连接有ku蛋白和ligd蛋白的cds编码序列的pdual-cas9-ku ligd质粒载体。

技术总结
本发明提供了一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，所述使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具包括：pDual-Cas9-Parental质粒载体：含有DNA解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、araC基因、阿拉伯糖启动子和Ⅱs型限制酶识别位点；和pDual-sgRNA-lacZ质粒载体：含有靶向lacZ基因的sgRNA序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。本发明筛选得到的NHEJ系统在大肠杆菌中具有良好的连接效率，并可以进行高效的基因编辑，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。


技术研发人员：薛高旭 夏立军 方其 张艳
受保护的技术使用者：苏州金唯智生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.28
技术公布日：2022/4/5