预测食管癌对抗ERBB3抗体治疗的应答的方法和试剂盒与流程

预测食管癌对抗erbb3抗体治疗的应答的方法和试剂盒
1.本技术是申请日为2017年6月22日、申请号为201710485107.3、发明名称为“预测食管癌对抗erbb3抗体治疗的应答的方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明的领域涉及肿瘤的临床分子诊断。


背景技术：

3.大多数抗肿瘤药物对一些肿瘤患者有效的，但是在其他患者中则是无效的。这是因为肿瘤之间存在基因变化，甚至在同一患者的不同肿瘤中也能观察到。就靶向治疗而言，患者的应答更是各不相同。因此，当没有合适的方法来预测哪些患者将受益于哪种药品时，不能实现靶向治疗的全部潜力。根据the national institutes of health(nih)，术语“生物标志物”定义为“可客观测量的特征，并且该特征被评价为正常的生物对致病过程、或者对治疗干预的药理学应答的指示剂”(biomarkers definitions working group,2001,clin.pharmacol.ther.69:89
‑
95)。
4.事先鉴定哪些患者最可能对给定药品显示临床应答能够加速新药品的研发。同时，这也会显著减小临床试验的规模、持续时间和成本。目前，诸如基因组学、蛋白质组学和分子影像学之类的技术能够快速、敏感且可信赖地检测特定的基因突变、具体基因的表达水平以及其他分子生物标志物。尽管有多种技术可以用来表征肿瘤的分子，但由于已知的癌症生物标志物很少，所以很大程度上癌症生物标志物的临床应用仍未实现。例如，近来的综述文章表明：非常需要加速研发生物标志物及它们的用途，以改善癌症的诊断和治疗(cho,2007,molecular cancer6:25)。
5.另一篇近来关于癌症生物标志物的综述文章则指出：目前的挑战是发现癌症生物标志物。尽管在临床上已经成功在多种类型肿瘤(例如慢性粒细胞白血病、胃肠道间质瘤、肺癌和多形性胶质母细胞瘤)中使用分子靶向试剂，但由于缺乏有效的策略来评价患者对靶向试剂的应答，这些分子靶向试剂的广泛应用受到限制。问题主要在于不能使用分子定义的癌症来选择进行临床试验的患者以评估新药品。因此需要生物标志物，其可信赖地鉴定最可能受益于特定试剂的那些患者(sawyers,2008,nature452:548
‑
552,at548)。
6.诸如上述的文献表明，需要发现临床用途的生物标志物和基于此类生物标志物的诊断方法。
7.已知三种不同类型的癌症生物标志物：(1)预后性生物标志物；(2)预测性生物标志物；以及(3)药效动力学(pd)生物标志物。预后性生物标志物用于根据侵袭性(即，生长和/或转移的速率、以及对治疗的不反应)将癌症分类，例如实体肿瘤。这有时被称为“好效果”肿瘤，以区别“坏效果”肿瘤。预测性生物标志物用于评估特定患者将受益于使用特定药品治疗的可能性。例如，患有乳癌的患者，其erbb2(her2)基因被扩增，可能受益于使用曲妥单抗的治疗，然而不具有erbb2基因扩增的患者可能不受益于使用曲妥单抗的治疗。在患者服用药品时，pd生物标志物表明药品对其分子靶标的作用。因此，pd生物标志物通常在新药
品临床研发的早期阶段用于指导剂量水平和给药频率。就癌症生物标志物的讨论而言，可以参见sawyers,2008,nature452:548
‑
552。
8.由egfr或her2驱动的肿瘤通常响应于使用egfr或her2的抑制剂的处理，但是这些肿瘤总是产生对这些抑制剂的抗性。产生对抗egfr或抗her2治疗的抗性的机制之一是erbb3(也称为her3)信号传递的活化。例如参见engelman等,2006,clin.cancer res.12:4372；ritter等,2007,clin.cancer res.13:4909；sergina等,2007,nature445:437。此外，nrg1诱导的her2
‑
erbb3异源二聚体的活化还与对egfr抑制剂的抗性有关(zhou等,2006,cancer cell10:39)。因此，erbb3在药品抗性的研发中起到重要作用，并通过与egfr和her2形成的异源二聚体而涉及肿瘤的抑制和保持。由于erbb3缺乏激酶活性，所以erbb3抑制剂的研发已经受到关注，特别是抗erbb3抗体。
9.与其他类型的靶向治疗相同，一些但不是全部的肿瘤都响应于抗erbb3的治疗。因此，需要基于预测性生物标志物的方法，其中所述生物标志物可以用于鉴定其中肿瘤可能(或可能不)对使用erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)的治疗产生应答的患者。
10.近来，已经发现神经调节蛋白
‑
1(nrg1)的表达与肿瘤对使用erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)治疗的敏感性相关。作为erbb3的一个主要配体，nrg1能够促进erbb3与其他erbb家族成员的异二聚体化，从而激活多种细胞内信号通路。meetze等报道，抗erbb3抗体引起的肿瘤生长抑制(tgi)与erbb3的表达水平并不相关，而是与nrg1的表达水平显著相关，即当肿瘤样品中的nrg1表达水平等于或高于某一阈值时，所述肿瘤可能对使用抗erbb3抗体的处理产生应答。因此nrg1有望作为预测肿瘤对使用erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)治疗是否产生应答的有效生物标志物(参见cn103959065a和sergina等,2015,clin cancer res；21(5),1106
‑
1113)。
11.然而，本发明人发现，在食管癌异种移植模型中，尽管nrg1表达水平低的模型总是对抗erbb3抗体不敏感，但nrg1表达水平高的模型却可能对抗erbb3抗体处理产生应答或不产生应答(参见实施例2)，表明单独使用nrg1作为生物标志物来预测食管癌是否对使用erbb3抗体的处理产生应答不是非常有效。
12.因此，需要提供其他生物标志物，当单独使用或与nrg1一起使用时，其能够准确预测食管癌是否对使用erbb3抗体的处理产生应答。
13.发明简述
14.本发明部分基于这样的发现：在由食管癌得到的组织样品中，sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6、gnaz的表达水平与食管癌对使用erbb3抗体处理的敏感性相关。令人惊讶地，本发明人发现，这种相关性非常强，使得上述六个生物标志物sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6和gnaz中的每一个单独的表达水平均足以用于预测食管癌对使用erbb3抗体的处理是敏感的或是抗性的。本发明人进一步发现，上述生物标志物的组合使用(即，使用两个或更多个生物标志物)将进一步提高预测食管癌对使用erbb3抗体的处理的敏感性的有效性。因此，本发明提供了用于预测食管癌对erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)处理是敏感或抗性的方法。所述方法包括：(a)测量食管癌样品中选自sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6和gnaz的一个或多个生物标志物的表达水平；以及(b)将所述表达水平与对应生物标志物的阈值表达水平进行比较，其中所述sdc2和/或gnaz的表达水平等于或低于所述阈值表达水平，和/或一个或多个选自ptges、ncf2、noxa1或card6的生物标志物的表达水平等于或高于所
述阈值表达水平表明所述食管癌对erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)处理是敏感的。相反地，所述sdc2和/或gnaz的表达水平高于所述阈值表达水平，和/或一个或多个选自ptges、ncf2、noxa1或card6的生物标志物的表达水平低于所述阈值表达水平表明所述食管癌对erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)处理具有抗性。
15.在一个实施方案中，本发明的方法还包括测量nrg1基因的表达水平，其中nrg1表达水平等于或高于其阈值表达水平表明该食管癌对erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)处理是敏感的。
16.在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)测量食管癌样品中选自sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6和gnaz的一个或多个生物标志物的表达水平；以及(b)将所述表达水平与对应生物标志物的阈值表达水平进行比较，其中所述sdc2和/或gnaz的表达水平等于或低于所述阈值表达水平，且一个或多个选自ptges、ncf2、noxa1或card6的生物标志物的表达水平等于或高于所述阈值表达水平表明所述食管癌对erbb3抑制剂(例如抗erbb3抗体)处理是敏感的。
17.本发明的生物标志物(即sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6和gnaz以及nrg1)的表达水平是指蛋白质的表达水平或mrna的表达水平。蛋白质的表达可以通过本领域技术人员熟知的各种方法来测量，例如免疫组织化学(ihc)分析、酶联免疫吸附测试(elisa)、蛋白质免疫印迹法、免疫荧光法等。mrna的表达水平也可以通过本领域技术人员熟知的各种方法来测量，例如荧光定量pcr、微阵列、数字pcr、转录组测序技术(rnaseq)等。
18.本发明的另一个方面提供测量一个或多个选自sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6和gnaz的生物标志物在食管癌样品中的表达水平的试剂在制备用于鉴别食管癌对抗erbb3抗体处理是敏感或抗性的诊断测试试剂盒中的用途。在一个实施方案中，上述生物标志物还包括nrg1。
19.本发明的另一个方面提供用于预测食管癌对抗erbb3抗体处理是敏感的或抗性的诊断测试试剂盒，所述试剂盒包括用于测量一个或多个选自sdc2、ptges、ncf2、noxa1、card6和gnaz的生物标志物在食管癌样品中的表达水平的试剂。在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包括用于测量nrg1表达水平的试剂。所述试剂是本领域技术人员已知的用于测量基因的mrna或蛋白表达水平的试剂。例如，当用荧光实时定量pcr测量mrna表达水平时，所述试剂包括用于特异性扩增本发明生物标志物的引物、dna聚合酶和用于测量其表达水平的缓冲剂、反应物等。当用ihc分析测量蛋白表达水平时，所述试剂包括针对本发明生物标志物的抗体(一级抗体)和与一级抗体结合的检测抗体(二级抗体)等。在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包括用于测量一种或多种用作对照的其他基因的表达水平的试剂。
附图说明
20.图1为显示抗erbb3抗体的免疫球蛋白重链可变区序列的cdr
h1
、cdr
h2
和cdr
h3
序列(kabat定义)的示意图，所述抗体表示为can017、04d01、09d03、11g01、12a07、18h02和22a02(其对应于图2中方框所示的区域)。
21.图2为显示抗erbb3抗体的完整免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列的示意图，所述抗体表示为can017、04d01、09d03、11g01、12a07、18h02和22a02。比对各抗体的氨基酸序列，互补决定序列(cdr)(kabat定义)、cdr
h1
、cdr
h2
和cdr
h3
用方框标示。方框之外的序列表示
构架(fr)序列。
22.图3为显示抗erbb3抗体的免疫球蛋白轻链可变区序列的cdr
l1
、cdr
l2
和cdr
l3
序列(kabat定义)的示意图，所述抗体表示为can017、04d01、09d03、11g01、12a07、18h02和22a02(其对应于图4中方框所示的区域)。
23.图4为显示抗erbb3抗体的完整的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列的示意图，所述抗体表示为can017、04d01、09d03、11g01、12a07、18h02和22a02。比对各抗体的氨基酸序列彼此，互补决定序列(cdr)(kabat定义)、cdr
l1
、cdr
l2
和cdr
l3
用方框标示。方框之外的序列表示构架(fr)序列。
24.图5提供了定义(a)全长can017免疫球蛋白重链和(b)全长can017免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
25.图6提供了定义(a)全长04d01免疫球蛋白重链和(b)全长04d01免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
26.图7提供了定义(a)全长09d03免疫球蛋白重链和(b)全长09d03免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
27.图8提供了定义(a)全长11g01免疫球蛋白重链和(b)全长11g01免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
28.图9提供了定义(a)全长12a07免疫球蛋白重链和(b)全长12a07免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
29.图10提供了定义(a)全长18h02免疫球蛋白重链和(b)全长18h02免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
30.图11提供了定义(a)全长22a02免疫球蛋白重链和(b)全长22a02免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。
31.图12总结了在食管癌异种移植模型中，测量higg(20mg/kg)和抗erbb3抗体can017(20mg/kg)的肿瘤抑制活性的实验结果。
32.图13的上图是散点图，其显示出can017在20个异种移植物模型中的体内效力(其表示为肿瘤生长抑制的百分率(tgi))与sdc2的mrna表达水平之间的关系。20个数据点以(
●
)表示，其中实线表示sdc2的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性。图13的下图是sdc2的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性的显著性分析。
33.图14的上图是散点图，其显示出can017在20个异种移植物模型中的体内效力(其表示为肿瘤生长抑制的百分率(tgi))与gnaz的mrna表达水平之间的关系。20个数据点以(
●
)表示，其中实线表示gnaz的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性。图14的下图是gnaz的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性的显著性分析。
34.图15的上图是散点图，其显示出can017在20个异种移植物模型中的体内效力(其表示为肿瘤生长抑制的百分率(tgi))与ncf2的mrna表达水平之间的关系。20个数据点以(
●
)表示，其中实线表示ncf2的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性。图15的下图是ncf2的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性的显著性分析。
35.图16的上图是散点图，其显示出can017在20个异种移植物模型中的体内效力(其表示为肿瘤生长抑制的百分率(tgi))与noxa1的mrna表达水平之间的关系。20个数据点以(
●
)表示，其中实线表示noxa1的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性。图16的下图是
noxa1的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性的显著性分析。
36.图17的上图是散点图，其显示出can017在20个异种移植物模型中的体内效力(其表示为肿瘤生长抑制的百分率(tgi))与ptges的mrna表达水平之间的关系。20个数据点以(
●
)表示，其中实线表示ptges的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性。图17的下图是ptges的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性的显著性分析。
37.图18的上图是散点图，其显示出can017在20个异种移植物模型中的体内效力(其表示为肿瘤生长抑制的百分率(tgi))与card6的mrna表达水平之间的关系。20个数据点以(
●
)表示，其中实线表示card6的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性。图18的下图是card6的mrna表达水平与肿瘤生长抑制的相关性的显著性分析。
38.图19显示gnaz和nrg1的表达水平与肿瘤生长抑制(tgi)百分比的关系的示意图。其中与y轴平行的实线表示nrg1的阈值表达水平2.05，与x轴平行的实线表示gnaz的阈值表达水平1.1。
◆
表示tgi<70％；δ表示tgi>70％。
39.发明详述
40.定义
41.如本文所用，“can017”是指人源化的抗人类erbb3单克隆抗体，其全长重链氨基酸序列为seq id no:9，而其全长轻链氨基酸序列为seq id no:10。
42.如本文所用，“erbb3”(也称为her3)是指通过如下基因及其等位基因变体编码的人类蛋白质，其中所述的基因鉴别为entrez gene id no.2065。
43.如本文所用，“erbb3抑制剂”是指与erbb3结合，并抑制、中和、防止或消除erbb3在肿瘤细胞中的生物学活性的分子(小分子或高分子，例如抗体或其抗原结合片段)。
44.如本文所用，“nrg1”(也称为神经调节蛋白
‑
1、heregulin、hrg或hrg1)是指由entrez gene id no.3084及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
45.如本文所用，“sdc2”(也称为多配体蛋白聚糖2)是指由entrez gene id no.6383及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
46.如本文所用，“ncf2”(也称为中性粒细胞胞质因子2)是指由entrez gene id no.4688及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
47.如本文所用，“noxa1”(也称为nadph氧化酶活化剂1)是指由entrez gene id no.10811及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
48.如本文所用，“gnaz”(也称为g蛋白亚单元αz)是指由entrez gene id no.2781及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
49.如本文所用，“ptges”(也称为前列腺素e合酶)是指由entrez gene id no.9536及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
50.如本文所用，“card6”(也称为半胱天冬酶募集结构域家族成员6)是指由entrez gene id no.84674及其等位基因变体编码的人类蛋白质。
51.如本文所用，对处理产生的“反应”或“应答”是指就所处理的肿瘤而言，肿瘤显示出：(a)生长减慢，(b)生长停止，或(c)衰退。
52.如本文所用，“表达水平”是指本发明的生物标志物在食管癌样品中的表达水平。例如，表达水平可以表示为(1)由rnaseq测量得到的mrna表达水平(用fpkm进行标准化)，或(2)在ihc测试中的染色强度。可以用阈值表达水平来解释本发明的生物标志物的表达水
平，其可以在阈值测定分析中凭经验测定，例如使用roc曲线分析。
53.如本文所用，“阈值测定分析”是指对食管癌的数据组进行分析，从而测定该生物标志物在食管癌样品中的阈值表达水平。
54.如本文所用，“阈值表达水平”指这样的表达水平：等于或高于该表达水平(对于nrg1、ncf2、noxa1、ptges和card6)，或等于或低于该表达水平(对于sdc2和gnaz)，食管癌肿瘤将被分类为对使用的erbb3抑制剂处理是敏感的。
55.erbb3抗体
56.本文所公开的方法可以用于预测食管癌对使用erbb3抑制剂的处理的应答，其中所述的抑制剂例如为抗erbb3抗体或抗erbb3抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，将食管癌分为对erbb3抗体(或其抗原结合片段)敏感的或抗性的，其中所述的抗体抑制或防止nrg1(例如nrg1
‑
β1)与erbb3结合，由此间接抑制或防止erbb3的配体诱导的二聚化(例如抗erbb3抗体can017、04d01、12a07、18h02和22a02)。在其他实施方案中，肿瘤被分类为对抗体(或其抗原结合片段)敏感的或抗性的，其中所述的抗体在不防止nrg1与erbb3结合(例如抗erbb3抗体09d03和11g01)的条件下抑制或防止erbb3的二聚化。
57.在示例性的实施方案中，erbb3抑制剂为以下抗体之一：can017、04d01、12a07、18h02、22a02、11g01和09d03。
58.抗erbb3抗体can017包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:1的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:2的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:3的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:4的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:5的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:6的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体can017包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:7的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:8的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体can017包括seq id no:9的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:10的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图5所示。
59.抗erbb3抗体04d01包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:11的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:12的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:13的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:14的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:15的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:16的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体04d01包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:17的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:18的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体04d01包括seq id no:19的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:20的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图6所示。
60.抗erbb3抗体09d03包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:21的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:22的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:23的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中
所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:24的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:25的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:26的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体09d03包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:27的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:28的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体09d03包括seq id no:29的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:30的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图7所示。
61.抗erbb3抗体11g01包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:31的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:32的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:33的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:34的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:15的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:35的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体11g01包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:36的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:37的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体11g01包括seq id no:38的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:39的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图8所示。
62.抗erbb3抗体12a07包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:40的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:41的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:42的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:14的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:15的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:16的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体12a07包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:43的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:44的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体12a07包括seq id no:45的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:46的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图9所示。
63.抗erbb3抗体18h02包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:47的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:48的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:49的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:50的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:51的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:52的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体18h02包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:53的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:54的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体18h02包括seq id no:55的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:56的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图10所示。
64.抗erbb3抗体22a02包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括：seq id no:57的氨基酸序列所示的cdr
h1
，seq id no:58
的氨基酸序列所示的cdr
h2
，以及seq id no:42的氨基酸序列所示的cdr
h3
，如图1所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括：seq id no:14的氨基酸序列所示的cdr
l1
，seq id no:15的氨基酸序列所示的cdr
l2
，以及seq id no:16的氨基酸序列所示的cdr
l3
，如图3所示。在示例性的实施方案中，抗体22a02包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区包括seq id no:59的氨基酸序列，如图2所示；其中所述的免疫球蛋白轻链可变区包括seq id no:60的氨基酸序列，如图4所示。在另一个示例性的实施方案中，抗体22a02包括seq id no:61的免疫球蛋白重链氨基酸序列，以及seq id no:62的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，如图11所示。
65.可以考虑到技术人员能够理解的是，可以通过将上述可变区与各恒定区序列连接来创建完整的重链或kappa轻链抗体序列，从而形成活性的全长免疫球蛋白重链和轻链。例如，完整的重链包括重链可变区，及其后面的鼠或人igg1或igg2b重链恒定序列(在本领域是已知的)，并且完整的kappa链包括kappa可变序列，及其后面的鼠或人kappa轻链恒定序列(在本领域是已知的)。进一步考虑到可以将由免疫球蛋白重链和轻链得到的cdr1、cdr2和cdr3序列置于人或人源化的免疫球蛋白构架区中。
66.样品
67.由食管癌得到的组织样品(例如由人类患者获得的人食管癌组织样品，其中所述的人类患者例如为考虑使用erbb3抑制剂处理的人类患者)可以用作rna来源、蛋白质来源或用于免疫组织化学(ihc)的薄切片来源，这样可以在实施所公开的方法中测定样品中的本发明的生物标志物的水平。可以通过使用传统的肿瘤组织活检仪器和过程来获得组织样品。内镜组织活检、切除组织活检、切取组织活检、细针穿刺活检、咬切组织活检、刮取组织活检和皮肤组织活检为本领域任一技术人员为了获得肿瘤样品可以使用的公认的医学过程的实例。肿瘤组织样品应该足够大，从而提供足够的rna、蛋白质或薄切片，以用于测量生物标志物的基因表达。
68.肿瘤组织样品可以为允许测量生物标志物的表达或含量的任何形式。总之，组织样品必须足够用于rna提取、蛋白质提取或薄切片的制备。因此，组织样品可以是新鲜的、通过合适的低温学技术保藏的或通过非低温学技术保藏的。用于处理临床组织活检样本的标准方法是将组织样品固定于福尔马林中，然后将其包埋在石蜡中。这种形式的样品通常称为福尔马林固定
‑
石蜡包埋(ffpe)的组织。用于随后分析的组织制备的合适技术是本领域的技术人员所公知的。
69.生物标志物的表达
70.如本文所述，可以通过任何合适的方法来测定或测量由肿瘤得到的组织样品中生物标志物的表达水平。多种此类方法是本领域已知的。例如，可以通过测量样品中生物标志物的蛋白质的水平或量，或者测量样品中生物标志物的rna的水平或量来测定生物标志物的表达水平。
71.在一些实施方案中，将食管癌对使用erbb3抑制剂的处理分类为敏感的或抗性的，完全基于生物标志物在由食管癌得到的组织样品中的表达情况。在另一个实施方案中，除了本发明的生物标志物的表达以外，还测量一种或多种其他基因的表达，从而将肿瘤分类为对使用erbb3抑制剂的处理是敏感的或抗性的。在本发明中考虑了在一些实施方案中，当除了本发明的生物标志物以外还测量了一种或多种其他基因的表达时，一种或多种其他基
因不包括erbb1、erbb2和erbb3(例如erbb1、erbb2和erbb3的任何的单体、异源二聚体和/或同源二聚体，和/或单体或二聚体形式的磷酸化的erbb1、erbb2和erbb3)。本发明中进一步考虑了除了本发明生物标志物以外，测量一种或多种其他基因的表达可以包括起到对照或标准品作用的基因，例如用于数据的标准化。
72.rna分析
73.用于测定本发明生物标志物的mrna表达水平的方法包括但不限于传统的微阵列分析、数字pcr、rnaseq和定量聚合酶链式反应(pcr)。在一些实施方案中，使用标准方案由目标细胞、肿瘤或组织提取rna。在其他的实施方案中，使用不需要分离rna的技术进行rna分析。
74.由组织样品快速且有效地提取真核生物mrna的方法是本领域的那些技术人员所公知的。例如参见ausubel et al.,1997,current protocols of molecular biology,john wiley&sons。组织样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的石蜡包埋(ffpe)的样品，例如临床研究的食管癌患者样本。通常，由新鲜或冷冻的组织样品分离得到的rna往往比由ffpe样品得到的rna形成的碎片少。但是，肿瘤材料的ffpe样品更容易获得，并且ffpe样品是在本发明的方法中使用的合适的rna来源。就对ffpe样品作为rna来源以便通过rt
‑
pcr进行基因表达谱的讨论而言，例如参见clark
‑
langone等,2007,bmc genomics8:279。此外，参见de andr
é
s等,1995,biotechniques18:42044；和baker等,美国专利申请公开号2005/0095634。可使用商购的试剂盒(具有供应商提供的用于rna提取和制备的说明书)。多种rna分离产物和完整试剂盒的销售供应商包括qiagen(valencia,ca)、invitrogen(carlsbad,ca)、ambion(austin,tx)和exiqon(woburn,ma)。
75.通常，rna的分离以组织/细胞破碎开始。在组织/细胞破碎过程中，理想的是减少rnase对rna的降解。在rna分离过程中限制rnase活性的一种方法是确保一旦细胞被破碎，便将变性剂与细胞内容物接触。另一种惯例是在rna分离过程中包括一种或多种蛋白酶。可任选地，一旦收集到新鲜的组织样品，便将其在室温下浸渍在rna稳定溶液中。稳定溶液快速地渗透细胞，从而稳定rna以便在4℃下储存，以备随后的分离。一种此类的稳定溶液为市售可得的(ambion,austin,tx)。
76.在一些方案中，总rna通过氯化铯密度梯度离心由破碎的肿瘤材料分离得到。通常，mrna占细胞总rna的大约1％至5％。固定化的oligo(dt)(例如oligo(dt)纤维素)通常用于将mrna与核糖体rna和转移rna分离。如果在分离后储存，则必须将rna储存在不含rnase的条件下。用于稳定储存所分离的rna的方法是本领域已知的。用于稳定储存rna的多种市售产品是可得的。
77.微阵列
78.可以使用传统的dna微阵列表达谱技术来测量生物标志物的mrna表达水平。dna微阵列是特定的dna节段或探针的集合，其固定在固体表面或基底上，例如玻璃、塑料或硅；并且各特定的dna节段占据阵列中已知的位置。与标记的rna样品的杂交通常在严谨的杂交条件下进行，其允许对相应于阵列中各探针的rna分子进行检测和定量。在严谨洗涤以除去非特异性结合的样品材料之后，通过共聚焦激光显微镜或其他合适的检测方法扫描微阵列。当今市售的dna微阵列(也称为dna芯片)通常包括数以万计的探针，并由此可以同时测量数以万计的基因的表达。此类为阵列可以用于实施本发明。备选地，包括测量nrg1所必须的少
数几种探针、加上必须的对照或标准品(例如用于数据的标准化)的定制芯片可以用于实施所公开的方法。
79.为了有利于数据的标准化，可以使用双色微阵列读取器。在双色(双通道)系统中，使用发射第一波长的第一荧光团来标记样品，同时使用发射不同波长的第二荧光团标记rna或cdna标准品。例如，cy3(570nm)和cy5(670nm)通常在双色微阵列系统中一起使用。
80.dna微阵列技术是良好发展的、市售可得的且广泛使用的。因此，在实施所公开的方法时，本领域的普通技术人员可以使用微阵列技术测量编码生物标志物蛋白质的基因的表达水平，而无需过度的实验。dna微阵列芯片、试剂(例如用于rna或cdna制备、rna或cdna标记、杂交和洗涤溶液的那些)、仪器(例如微阵列读取器)以及方案是本领域公知的，并可得自多种市售来源。微阵列系统的市售供应商包括agilent technologies(santa clara,ca)和affymetrix(santa clara,ca)，但是可以使用其他的pcr系统。
81.定量pcr
82.可以使用传统的定量逆转录酶聚合物链式反应(qrt
‑
pcr)技术来测量本发明生物标志物的mrna水平。qrt
‑
pcr的优点包括敏感性、灵活性、定量精确性以及能够分辨密切相关的mrna的能力。关于处理用于定量pcr的组织样品的指导可得自多种来源，包括用于qrt
‑
pcr的市售的仪器和试剂的制造商和供应商(例如qiagen(valencia,ca)和ambion(austin,tx))。用于自动化实施qrt
‑
pcr的仪器和系统是市售可得的，并且在许多实验室中是常规使用的。公知的市售系统的实例为the applied biosystems7900ht fast real
‑
time pcr system(applied biosystems,foster city,ca)。
83.一旦分离出mrna，通过rt
‑
pcr进行基因表达测量中的第一步是将mrna模板逆转录为cdna，其接着在pcr反应中呈指数扩增。两种常用的逆转录酶为禽成髓细胞性白血病病毒逆转录酶(amv
‑
rt)和莫罗尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(mmlv
‑
rt)。逆转录反应通常使用特定的引物、随机的六聚体或oligo(dt)引物来作为引物。合适的引入是市售可得的，例如rna pcr kit(perkin elmer,waltham,ma)。所得的cdna产物在随后的聚合酶链式反应中用作模板。
84.使用热稳定的dna依赖的dna聚合酶实施pcr步骤。大部分在pcr系统中常用的聚合酶为水生栖热菌(thermus aquaticus，taq)聚合酶。pcr的选择性源自引物的使用，所述的引物与扩增所靶向的dna区域互补，即，由编码目标蛋白质的基因所逆转录的cdna的区域。因此，当本发明使用qrt
‑
pcr时，对各标记物基因特异性的引物是基于该基因的cdna序列。可以根据供应商提供的说明书来使用诸如green或(applied biosystems,foster city,ca)之类的市售的技术。可以通过比较管家基因(例如β肌动蛋白或gapdh)的水平，针对加载样品中的差异将信使rna的水平标准化。可以将mrna的表达水平表示为相对于任何单一对照样品，例如得自正常的非肿瘤组织或细胞的mrna。备选地，其可以表示为相对于由一套肿瘤样品或肿瘤细胞系得到的mrna、或由市售可得的一组对照mrna得到的mrna。
85.可以设计用于pcr分析nrg1和/或本发明生物标志物的表达情况的多组合适的引物组，并且由本领域的任一技术人员合成，而无需过度的实验。备选地，用于实施本发明的多组pcr引物组可以购自多个市售的来源，例如applied biosystems。pcr引物优选地长度
为大约17至25个核苷酸。可以使用用于估计解链温度(tm)的常规算法将引物设计为具有特定的tm。用于设计引物和估计tm的软件是市售可得的，例如primer expresstm(applied biosystems)，并且还可以在互联网上获得，例如primer3(massachusetts institute of technology)。通过应用所建立的pcr引物设计的原理，可以使用大量不同的引物来测量任何给定基因的表达水平，包括nrg1和本发明的生物标志物。
86.rnaseq
87.还可以使用rnaseq技术来测量本发明生物标志物的mrna表达水平。rnaseq可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有以下优势：(1)直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题(即，具有数字化信号)；(2)能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本(即，灵敏度非常高)；(3)能够进行全基因组分析；(4)高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本(即，检测范围广泛)。基于以上优势，rnaseq已经成为精确测量rna表达水平的强有力的工具。
88.rnaseq的原理是：提取rna后纯化，逆转录成cdna，然后测序得到短读段(short reads)；将短读段比对到基因组相应的位置，然后对比对结果进行基因水平、外显子水平以及转录水平的拼接，最后对拼接结果进行数据统计，标准化之后得到基因在mrna水平上的表达水平。其中，比对步骤、拼接和统计步骤以及标准化步骤均可以使用本领域技术人员已知的各种软件来进行。例如比对步骤可以通过bfast、bowtie、gnumap、cloudburst、gmap/gsnap、rzaers、splicemap、tophat、mira、soap等软件来进行；拼接和统计步骤可以通过cufflinks、alexa
‑
seq等软件来进行；标准化步骤可以通过erange、myrna等软件来进行。比较常用的对rnaseq数据进行标准化的方法包括：rpkm(reads per kilobase of exon model per million mapped reads)、fpkm(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)和tpm(tag per million)。
89.常用的rnaseq平台包括illumina ga/hiseq,solid和roche454。
90.qnpa
tm
91.在一些实施方案中，使用不涉及rna提取或分离的技术来进行rna分析。一种此类技术为定量核酸酶保护测定，其是市售可得的，商品名为qnpatm(high throughput genomics,inc.,tucson,az)。当待分析的肿瘤组织样品为ffpe材料的形式时，所述的技术是有利的。例如参见roberts et al.,2007,laboratory investigation87:979
‑
997。
92.蛋白质分析
93.在其他的实施方案中，可以以蛋白质水平检测本发明生物标志物的表达。用来测量本发明生物标志物的蛋白质表达水平的方法包括酶联免疫吸附测试(elisa)、ihc分析、蛋白质免疫印迹、免疫荧光等。
94.elisa
95.实施elisa需要至少一种针对本发明生物标志物的抗体，即，检测抗体。以下以nrg1为例进行说明。将从待分析样品得到的nrg1蛋白质固定于固体支持物上，例如聚苯乙烯微量滴定板。这种固定是非特异性的结合，即，通过吸附在表面上。或者，可以通过特异性的结合来固定，即，在“夹心”elisa中，由样品得到的nrg1与捕获抗体(不同于检测抗体的抗nrg1抗体)结合。在nrg1固定后，加入检测抗体，并且检测抗体与结合的nrg1形成络合物。检
statistical evaluation of medical tests for classification and prediction,oxford press,new york。
102.用于阈值测定分析的数据组包括：(a)急性应答数据(应答的或非应答的)，和(b)由一组肿瘤得到的各肿瘤样品的本发明生物标志物的表达水平。在某些实施方案中，通过测量肿瘤的组织样品中生物标志物的表达水平来测定阈值表达水平，其中所述肿瘤得自以下人类患者：之前使用抗erbb3抑制剂处理过并且显示出对抗erbb3抑制剂是敏感的食管癌患者；以及之前使用抗erbb3抑制剂处理过并且显示出对抗erbb3抑制剂是抗性的食管癌患者。
103.可以按照以下方式进行roc曲线分析(以nrg1为例)。nrg1表达水平大于或等于阈值的任何样品都被分类为应答者(敏感的)，nrg1表达水平低于阈值的任何样品都被分类为非应答者(抗性的)。就由测试组样品得到的每一个nrg1表达水平而言，使用该表达水平作为阈值而将样品分类为“应答者”和“非应答者”(假设调用)。该方法通过将假设调用与用于数据组的实际应答数据相比较而能够计算各潜在阈值的tpr(y值)和fpr(x值)。然后通过使用tpr和fpr制作圆点图来构建roc曲线。如果roc曲线高于由(0,0)点至(1.0,0.5)点的斜线，则其显示nrg1测试结果与随机相比，是较好的测试结果。
104.roc曲线可以用于鉴别最佳的阈值点。最佳的阈值点为这样的点：其在假阳性成本权衡假阴性成本之间产生最佳平衡。这些成本不必是相等的。在roc空间中，在点x,y处的分类的平均预期成本(c)通过下式测定：
105.c＝(1
‑
p)α*x p*β(1
‑
y)
106.其中：α＝假阳性成本，β＝错过阳性(假阴性)成本，以及p＝阳性情况的比率。
107.可以通过对α和β指定不同的值来不同地权衡假阳性和假阴性。例如，如果决定在应答组中包括更多的患者(代价是治疗更多非应答者的患者)，则可以赋予α更高的权重。在这种情况下，假设假阳性成本和假阴性成本是相同的(α等于β)。因此，在roc空间中，在点x,y处的分类的平均预期成本为：
108.c’＝(1
‑
p)*x p*(1
‑
y)。
109.在使用所有成对的假阳性和假阴性(x,y)后可以计算最小的c’。最佳阈值计算为在c’下(x,y)的值。
110.通常，nrg1表达水平越高，则肿瘤越可能对erbb3抑制剂是敏感的；而nrg1表达水平越低，则肿瘤越可能对erbb3抑制剂是抗性的。上述阈值测定分析也可用于测定本发明的其他生物标志物的阈值表达水平。
111.测试试剂盒
112.此外，本发明还提供包括特定组分的诊断测试试剂盒，其用于实施本发明的方法。在实施诊断测定中，诊断测试试剂盒增加了方便、速度和可重复性。例如，在示例性基于qrt
‑
pcr的实施方案中，基本的诊断测试试剂盒包括用于分析本发明生物标志物的表达的pcr引物。在其他的实施方案中，更复杂的测试试剂盒不仅包括pcr引物，而且还包括用于使用pcr技术来测量生物标志物表达水平的缓冲剂、反应物和详细的说明书。在一些实施方案中，所述的试剂盒除了rna样品以外，还包括测试方案和测试所必须的所有消耗组分。
113.在示例性的基于dna微阵列的实施方案中，测试试剂盒包括被设计与特定的仪器一起使用的微流卡(阵列)。任选地，微流卡为定制装置，其特定设计用于测量本发明的生物
标志物。此类定制微流卡是市售可得的。例如，taqman为384孔微流卡(阵列)，其被设计与the applied biosystems7900ht fast real time pcr system(applied biosystems,foster city,ca)一起使用。应该理解的是微流卡上可以可任选地包括其他的探针，以测量一种或多种其他基因的表达。可以包括此类其他的基因以起到对照或标准品的作用(例如用于数据的标准化)，或者除了上述以外，还可以是提供信息的。
114.在一些实施方案中，测试试剂盒包括通过ihc测定本发明生物标志物含量的材料。例如，ihc试剂盒可以包括针对本发明生物标志物的一级抗体、以及与报告酶(例如辣根过氧化物酶)缀合的二级抗体。在一些实施方案中，使用缀合的聚合物替代二级抗体，其中所述的聚合物特异性地识别一级抗体。
具体实施方式
115.通过以下实例进一步说明本发明。提供以下实例仅为了说明，不应该被解释为以任何方式限定了本发明的范围或内容。
116.实施例1：食管癌异种移植生长对can017的应答
117.按照以下方式评估食管癌对can017的应答。
118.将从食管癌患者手术后取得的新鲜肿瘤组织分成小的肿瘤块，接种于免疫缺陷小鼠(balb/c裸鼠)皮下，定期观察肿瘤生长状态。待肿瘤达到一定体积后，以人道主义方式处死小鼠，并将肿瘤接种至新的balb/c裸鼠皮下。根据肿瘤生长状态绘制生长曲线，同时收集肿瘤样品、冻存并观察肿瘤组织、然后在需要用于下一代接种时将其复苏。经过数代优化后，成功建立食管癌异种移植模型。将该模型通过皮下接种至9
‑
11周龄的雌性balb/c裸鼠的右侧，接种模型的直径为2
‑
3mm。
119.每周两次使用游标卡尺对肿瘤进行测量。用下式对肿瘤体积进行计算：宽x宽x长/2。当肿瘤达到大约158mm3时，将这些小鼠随机分为3组，每组10只小鼠。一组接受生理盐水，一组接受higg对照(20mg/kg体重)，另一组接受can017(20mg/kg体重)。每三天给药一次，通过腹膜内注射3周。记录肿瘤体积以及小鼠体重，每周两次。肿瘤生长表示为与生理盐水对照相比的抑制百分比。
120.总之，使用can017处理20个食管癌异种移植模型(每个模型10只小鼠)，其统计结果如图12所示。can017对全部20个异种移植模型的平均抑制百分比为43.6％左右，而对照higg对全部20个异种移植模型的平均抑制百分比为
‑
5.5％。统计学分析结果表示，与higg相比，can017对食管癌异种移植模型的抑制百分比达到显著水平(p<0.01)。这些结果表明，can017能有效抑制食管癌肿瘤的生长。
121.进一步分析单个食管癌异种移植模型对can017的应答，发现所述应答是变化的，其范围为
‑
40％的肿瘤生长抑制(tgi)至肿瘤消退。“肿瘤消退”是指与在处理前、在评价期开始时肿瘤的尺寸相比，在评价期结束时，肿瘤更小。基于所达到的肿瘤生长抑制，鉴别应答者(定义为tgi>70％的那些)和非应答者(定义为tgi<70％的那些)。在所评价的20个模型中，发现9个为应答者，11个是非应答者(表1)。这些组能够鉴别can017应答的分子标志物。
122.表1.can017对20个食管癌异种移植模型的肿瘤生长抑制的结果及其中nrg1的平均mrna表达水平
[0123][0124][0125]
实施例2：生物标志物nrg1的表达水平和阈值测定
[0126]
根据以下方案通过rnaseq来测定nrg1的表达水平：将肿瘤组织速冻后，用rneasy mini kit(qiagen，编号74106)提取并纯化rna，然后根据truseq
tm rna sample preparation guide(illumina，编号rs
‑
930
‑
2001)对纯化后的rna进行预处理，之后根据制造商的说明在hiseq x system(illumina)上进行测序，所得数据用fpkm进行标准化(以log2(fpkm 1)值表示)，获得nrg1的表达水平。
[0127]
在用can017处理之前测定20个食管癌异种移植模型(平均每个模型10只小鼠)中的nrg1表达水平值，每个模型的平均nrg1表达水平如表1所示。根据所得的nrg1表达水平值生成受试者工作特征(roc)曲线，并测定用于预测can017肿瘤应答的nrg1的阈值表达水平。roc分析结果表明，nrg1的阈值表达水平为2.05。即，高于该阈值表达水平则预测can017的肿瘤应答。实际上，nrg1的表达水平在测试的大多数异种移植模型中与can017的应答结果一致(即，等于或高于阈值表达水平2.05表示对can017产生应答；低于阈值表达水平2.05表示对can017不产生应答)。但在食管癌异种移植模型es0026、es2356和es0215中，虽然nrg1的表达水平均高于阈值表达水平，但这三个异种移植模型实际上对can017不应答。由此可见，尽管nrg1作为生物标志物可以在一定程度上预测食管癌是否对使用erbb3抗体的处理产生应答，但单独使用nrg1进行预测的有效性是有限的。
[0128]
实施例3：本发明的生物标志物的表达水平与can017应答之间的关系
[0129]
根据实施例2所述的rnaseq方法，分别测定20个食管癌异种移植模型(平均每个模型10只小鼠)中sdc2、gnaz、ptges、ncf2、nox1和card6的表达水平，并通过roc曲线测定各生物标志物的阈值表达水平。各生物标志物的阈值表达水平结果如下：sdc2的阈值表达水平为4.9，gnaz的阈值表达水平为1.1，ptges的阈值表达水平为2.75，ncf2的阈值表达水平为2.6，nox1的阈值表达水平为2.7，card6的阈值表达水平为1.0。
[0130]
根据各模型中各生物标志物的平均表达水平来绘制在这些模型中的can017肿瘤生长抑制，并通过回归分析检测各生物标志物的表达水平与肿瘤生长抑制之间的相关性的显著性。结果如图13
‑
18所示。
[0131]
具体地，如图13所示，在肿瘤生长抑制和sdc2表达之间观察到负相关。更具体而言，在使用can017处理后肿瘤生长抑制的增加与sdc2表达的降低相关。回归分析发现这种相关具有高度的统计学意义(显著性f<0.05)。图14表明，肿瘤生长抑制和gnaz表达之间呈现负相关，即肿瘤生长抑制随gnaz表达水平的增高而降低，并且这种相关性在统计学上也是显著的(显著性f<0.05)。
[0132]
图15
‑
18则分别表明，肿瘤生长抑制和ncf2、noxa1、ptges、card6表达之间均呈现正相关，即肿瘤生长抑制随这些生物标志物表达水平的增高而增高，并且这种相关性在统计学上也是显著的(显著性f<0.05)。
[0133]
以上结果表明，本发明的生物标志物sdc2、gnaz、ptges、ncf2、nox1和card6中每一个的表达水平与肿瘤生长抑制均显著相关。因此，这些生物标志物均可以用于预测肿瘤对can017处理是否应答。
[0134]
实施例4：食管癌异种移植模型对抗erbb3的抗体can017的应答
[0135]
根据实施例3中所得的各生物标志物的阈值表达水平，选择预测会对can017产生应答的异种移植模型，同时选择预测对can017不产生应答的异种移植模型。具体地，对于阈值表达水平为4.9的sdc2，选择高表达的异种移植模型es0195和es0204(sdc2表达水平分别为5.8和5.2)，并预测所述模型对can017不产生应答；同时选择低表达的异种移植模型es0042和es0190(sdc2表达水平分别为0.6和4.3)，并预测所述模型对can017产生应答。类似地，对于阈值表达水平为1.1的gnaz，选择高表达的异种移植模型es0201和es2411(gnaz表达水平分别为1.3和1.9)，并预测所述模型对can017不产生应答；同时选择低表达的异种移植模型es0184和es0199(gnaz表达水平分别为0.2和0.5)，并预测所述模型对can017产生应答。对于阈值表达水平为2.6的ncf2，选择高表达的异种移植模型es0191和es0176(ncf2表达水平分别为5.1和3.2)，并预测所述模型对can017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型es0204和es0026(ncf2表达水平分别为0.1和0.9)，并预测所述模型对can017不产生应答。对于阈值表达水平为2.7的noxa1，选择高表达的异种移植模型es2311和es0214(noxa1表达水平分别为2.98和3.9)，并预测所述模型对can017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型es11087和es0148(noxa1表达水平分别为2.14和1.6)，并预测所述模型对can017不产生应答。对于阈值表达水平为2.75的ptges，选择高表达的异种移植模型es0159和es0141(ptges表达水平分别为5.69和3.9)，并预测所述模型对can017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型es10084和es0172(ptges表达水平分别为0.55和1.7)，并预测所述模型对can017不产生应答。对于阈值表达水平为1.0的card6，选择高表达的异种移植模型es11069和es0147(card6表达水平分别为4.01和1.1)，并预测所述模型对can017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型es0212和es0136(card6表达水平分别为0.09和0.1)，并预测所述模型对can017不产生应答。
[0136]
按照实施例1所述的方法，用20mg/kg抗体can017处理上述选择的异种移植模型(每个模型5只小鼠)，在3周后统计各模型的肿瘤生长抑制情况，结果如表3所示。
[0137]
表3.使用抗体can017处理的异种移植模型的结果统计。
[0138][0139][0140]
以上数据表明，可以通过测量sdc2、gnaz、ptges、ncf2、nox1和card6的表达水平来有效预测肿瘤对使用can017的处理的应答。
[0141]
实施例5：本发明的生物标志物与nrg1的组合使用
[0142]
本发明人还发现，将本发明的生物标志物和nrg1组合使用将能够进一步提高预测
肿瘤对can017处理是否应答的准确性。如上所述，单独的nrg1作为标志物不能准确预测食管癌异种移植模型es0026、es2356和es0215的应答(即，虽然nrg1的表达水平高于阈值，但用can017处理后却不应答(tgi<70％))。本发明人测定了这三个模型中本发明的生物标志物的表达水平，结果如下表4所示。
[0143]
表4.异种移植模型es0026、es2356和es0215中生物标志物的表达水平。
[0144]
模型编号sdc2gnazncf2noxa1ptgescard6es00266.11.70.91.92.30.8es23567.71.42.41.83.13.3es02158.12.42.50.41.82.1
[0145]
以上数据显示，这三个模型中，sdc2和gnaz的表达水平均高于其相应的阈值表达水平，ncf2和noxa1的表达水平均低于其相应的阈值表达水平，表明当用这些生物标志物来预测时，异种移植模型es0026、es2356和es0215将被预测为对can017处理不产生应答。换言之，当nrg1高于其阈值表达水平时，测量本发明的生物标志物的表达水平可以进一步提高预测肿瘤对can017处理是否应答的准确性(例如，在异种移植模型es0026、es2356和es0215的情况下，考虑本发明的生物标志物可以准确地预测其对can017处理不产生应答)。
[0146]
本发明人还发现，当同时使用至少一个与tgi正相关的生物标志物和一个与tgi负相关的生物标志物时，预测准确率将进一步提高。在20个食管癌异种移植模型中，单独用nrg1作为标志物预测的准确率为85％，单独用gnaz作为标志物预测的准确率为90％。但同时使用nrg1和gnaz作为标志物进行预测，准确率达到95％(图19)。
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实施例6：食管癌异种移植模型对抗erbb3的抗体11g01的应答
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为了证实对其他抗erbb3抗体的应答的预测方法，使用作用机制不同于can017的抗erbb3抗体(抗体11g01)处理实施例4中所选择的12个食管癌异种移植模型。具体地，使用20mg/kg抗体11g01按照实施例1所述的方式处理选择的12个食管癌异种移植模型，并在3周后统计各模型的肿瘤生长抑制百分比，结果与实施例4类似(即根据各生物标志物预测的肿瘤对抗体的应答情况与实际观察到的肿瘤对抗体的应答情况一致，数据未显示)。这表明本发明的生物标志物可以有效预测食管癌对使用作用机制不同于can017的其他抗erbb3抗体的处理的应答。
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通过引用进行结合
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出于所有的目的，在此所提到的专利文件和科学论文中的每一篇的完整披露内容均通过引用结合在此。
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等效物
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可以用其他的具体形式实施本发明而不背离本发明的精神或本质特征。因此，上述的实施方案必须被认为在所有方面是用作说明的而不是对在此所说明的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书而不是通过上述的说明来指明的，并且在该权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化均旨在涵盖于其中。