一种提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性的方法与流程

1.本发明涉及牛乳生产技术领域，具体涉及一种提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性的方法。


背景技术：

2.酪蛋白作为牛奶中最主要的蛋白质，也是一种最为常见的动物蛋白，约占牛奶蛋白的80％左右，由α
s1-、α
s2-、β-和κ-酪蛋白组成，分子量在19-24kda之间，他们各自具有独特的结构和功能特性。并且酪蛋白具有作为载体的潜力，可用于食品和制药行业敏感物质的递送。但牛乳也是联合国粮农组织公布的八大过敏原之一，大约有2％～6％的婴幼儿对牛奶过敏，成人中的过敏人数也达0.1％～0.5％。牛奶中含有超过20种可引起过敏反应的蛋白质过敏原。除β-乳球蛋白外，酪蛋白是牛奶中的主要过敏原，其中α
s1-酪蛋白致敏性最强，牛奶过敏人群中约有65％对α
s1
酪蛋白过敏。
3.目前，可通过一些物理、化学手段对蛋白进行改性，破坏牛乳蛋白的三维结构，从而改变蛋白的过敏性。这种改性方法包括：加热、远红外、超高压、糖基化等。但上述物理方法操作复杂、能耗高，化学改性后的产品存在食用安全问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性的方法。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性的方法，使汉麻籽蛋白与酪蛋白通过转谷氨酰胺酶交联。
6.用低敏植物蛋白替代乳蛋白为降低牛乳致敏性最直接且简便的方法。汉麻籽蛋白来源与工业汉麻籽，是一种未被充分利用的优质蛋白质资源，被认为是酪蛋白理想替代品，其主要由70％左右的麻仁球蛋白和30％左右的白蛋白组成。汉麻籽蛋白具有丰富的氨基酸组成，包含所有必需氨基酸(eaa)。其中含有较多的天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸且赖氨酸为第一限制性氨基酸。汉麻籽蛋白中远高于酪蛋白和大豆蛋白的精氨酸/赖氨酸比(4.7-6.1)决定其具有降低胆固醇血症和动脉粥样硬化等慢性疾病风险的功效。在大麻蛋白中观察到的eaa占总氨基酸的比例显著高于大豆蛋白，表明汉麻籽蛋白具有优越的氨基酸模式。并且据报道，汉麻籽蛋白的必须氨基酸指数(》80)也显著高于其他植物蛋白，例如板栗蛋白(76-79)、藜麦种子蛋白(79)。除此之外，汉麻籽蛋白几乎没有致敏性且抗营养因子含量极低。因此用汉麻籽蛋白替代酪蛋白不仅能降低牛乳致敏性，也符合动物蛋白的可持续发展原则。
7.优选地，所述的酪蛋白为牛乳酪蛋白；所述的转谷氨酰胺酶来源于微生物，酶活为140u/g。
8.具体地，该方法包括以下步骤：汉麻籽蛋白的提取、酪蛋白和汉麻籽蛋白混合溶液配制、交联反应、终止交联。
9.优选地，所述的提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性的方法具体包括以下步骤：
10.(1)配制酪蛋白与汉麻籽蛋白的混合溶液；
11.(2)向酪蛋白与汉麻籽蛋白的混合溶液中加入转谷氨酰胺酶，进行交联反应，得到经交联的酪蛋白溶液；
12.(3)将经交联的酪蛋白溶液置于3-5℃环境中，终止交联。
13.优选地，所述的汉麻籽蛋白通过碱溶酸沉法制备。
14.进一步优选地，所述的汉麻籽蛋白的制备方法具体包括以下步骤：
15.s1：在经粉碎后汉麻籽中添加正己烷进行脱脂；
16.s2：将脱脂后的汉麻籽粉分散在去离子水中，用碱液调节ph至11-12，并在室温下连续搅拌2-3h，得到混合物；
17.s3：将混合物离心，并使用酸液将上清液的ph调节至4-5，并在3-5℃下过夜以沉淀得到所述的汉麻籽蛋白。
18.更进一步优选地，得到所述的汉麻籽蛋白后，将汉麻籽蛋白与溶液通过离心分离，然后分散于蒸馏水中并调节ph至中性，然后将混合物冻干并在4℃下储存，直至使用。
19.更进一步优选地，步骤s1所述的汉麻籽与正己烷的质量体积比为1g:(2.5-3.5)ml；
20.步骤s2所述的汉麻籽粉与去离子水的质量体积比为1g:(9-11)ml。
21.更进一步优选地，步骤s2所述的碱液为naoh溶液；
22.步骤s3所述的酸液为hcl溶液。
23.优选地，所述的汉麻籽蛋白提取步骤为：首先在经粉碎后汉麻籽中添加正己烷(1:2.5-1:3.5，w/v)进行脱脂，搅拌2-3h，并重复该过程三次。然后在室温下，在通风橱中风干22-24h。将脱脂后的汉麻籽粉分散在去离子水中(1:9-1:11，w/v)，用6m naoh调节ph至11-12，并在25℃下连续搅拌2-3h。将混合物在6000
×
g下离心10-15min，并使用6m hcl将上清液的ph调节至4.5，并在4℃下过夜以沉淀蛋白质。沉淀通过6000
×
g离心10-15min分离，然后分散于蒸馏水中并调节ph至7.0。然后将混合物冻干并在4℃下储存，直至使用。
24.优选地，步骤(1)所述的酪蛋白与汉麻籽蛋白的混合溶液的配制过程具体为：分别配制质量浓度相同的酪蛋白溶液和汉麻籽蛋白溶液，将酪蛋白溶液与汉麻籽蛋白溶液按(6-8):1的质量比混合，搅拌，得到所述的酪蛋白与汉麻籽蛋白的混合溶液。
25.优选地，所述的酪蛋白和汉麻籽蛋白混合溶液配制步骤为：首先分别配制浓度为6％(w/v)的酪蛋白和汉麻籽蛋白溶液，以7:1的质量比混合，室温下用磁力搅拌器搅拌30min，转速为300r/min。得到酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液。
26.优选地，步骤(2)所述的交联反应过程具体为：将酪蛋白与汉麻籽蛋白的混合溶液置于40℃水浴锅中预热5-10min，称取并加入10-50u/g转谷氨酰胺酶，搅拌后孵育1-3h，完成交联。
27.优选地，所述的交联反应步骤为：将酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液置于40℃水浴锅中预热5-10min，称取并加入10-50u/g转谷氨酰胺酶至上述混合物溶液，用磁力搅拌器搅拌3min，转速为300r/min。置于40℃水浴锅中孵育1-3h，完成交联。
28.优选地，步骤(3)所述的终止交联过程具体为：将经交联的酪蛋白溶液置于3-5℃冰箱内孵育30-40min。
29.本发明选择4℃左右孵育以终止交联反应，相比于常规的80℃左右灭酶处理，不仅能耗更低，并且对蛋白质结构和性质影响更小。
30.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
31.1.本发明通过交联汉麻籽蛋白提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性，工艺步骤简单，充分利用汉麻籽蛋白这一新型食品资源，实现汉麻籽蛋白替代酪蛋白的同时，进一步降低酪蛋白致敏性并提高其抗酶解能力，有利于提升酪蛋白在食品和制药领域中对敏感物质的递送作用；
32.2.本发明基于和汉麻籽蛋白通过转谷氨酰胺酶交联的提高酪蛋白抗酶解能力、降低致敏性的方法，与现有的远红外、超高压、糖基化等方法相比，工艺简单、效果明显、操作安全、高效快捷、绿色环保，在有效提高酪蛋白抗酶解能力的同时，还能显著降低酪蛋白的致敏性；
33.3.本发明联合汉麻籽蛋白替代和转谷氨酰胺酶交联提高酪蛋白的抗酶解能力并降低其致敏性，有利于酪蛋白作为载体在体内对敏感物质的递送，有助于汉麻籽蛋白在食品领域中更广泛的应用，除此之外，本发明还具有改善乳制品加工特性的潜力；
34.4.本发明采用生物酶法，操作简便、能耗低、绿色安全，在降低乳蛋白致敏性方面具有更大的潜力；
35.5.本发明未使用蛋白酶对蛋白进行酶解，保留了酪蛋白的基本性质，避免了苦味肽的生成；
36.6.本发明通过动植物蛋白异源交联，不仅有效缓解动物蛋白资源紧缺的现状，同时丰富了蛋白体系的交联模式，相比于同源交联更具降低蛋白致敏性潜力；
37.7.本发明在4℃冰箱内孵育来终止交联反应，相比于高温灭酶法对蛋白质结构和性质影响更小，同时操作更简便，能耗更低。
附图说明
38.图1为蛋白样品的cd光谱图；
39.图2为蛋白样品消化过程氮释放曲线；
40.图3为蛋白样品消化过程致敏性变化；
41.图4为酪蛋白的微观形貌(上100μm，下5μm)；
42.图5为汉麻籽蛋白的微观形貌(上100μm，下5μm)；
43.图6为混合蛋白的微观形貌(上100μm，下5μm)；
44.图7为经交联的酪蛋白的微观形貌(上100μm，下5μm)。
具体实施方式
45.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
46.实施例1
47.汉麻籽蛋白通过碱溶酸沉法制备。在经粉碎后汉麻籽中添加正己烷(1:3，w/v)进行脱脂，搅拌3h，并重复该过程三次。然后在室温下，在通风橱中风干24h。将脱脂后的汉麻籽粉分散在去离子水中(1:10，w/v)，用6m naoh调节ph至11，并在25℃下连续搅拌3h。将混合物在6000
×
g下离心10min，并使用6m hcl将上清液的ph调节至4.5，并在4℃下过夜以沉
淀蛋白质。沉淀通过6000
×
g离心10min分离，然后分散于蒸馏水中并调节ph至7.0。然后将混合物冻干并在4℃下储存，直至使用。
48.分别配制浓度为6％(w/v)的酪蛋白和汉麻籽蛋白溶液，以7:1的质量比混合，室温下用磁力搅拌器搅拌30min，转速为300r/min。得到酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液。
49.将上述酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液置于40℃水浴锅中预热5min，称取并加入30u/g转谷氨酰胺酶至上述混合物溶液，用磁力搅拌器搅拌3min，转速为300r/min。置于40℃水浴锅中孵育3h，完成交联。
50.将上述经交联的酪蛋白置于4℃冰箱内孵育30-40min以终止交联。
51.对经交联的酪蛋白进行性能测试：
52.(1)处理后对蛋白样品的二级结构进行分析测定，对照组为未经转谷氨酰胺酶处理的酪蛋白、汉麻籽蛋白混合蛋白。将蛋白样品用磷酸盐缓冲液稀释至0.1mg/ml，通过cd光谱仪测定190至260nm的cd光谱(图1)。通过磷酸盐缓冲液扫描对所有测量光谱进行基线校正，并用k2d程序计算样品的二级结构含量(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk)。蛋白样品二级结构中存在大量的无规则卷曲和β-折叠。其中，交联使得蛋白质α-螺旋结构含量从7.43％降低至6.88％，β-折叠含量从31.40％上升至34.90％，无规则卷曲含量从56.35％降低至53.48％。总体而言，转谷氨酰胺酶诱导的共价交联使得蛋白质二级结构中α-螺旋和无规则卷曲转化为β-折叠。这可能归因于转谷氨酰胺酶诱导的氨基酸链的多分支结构使蛋白质更易于形成β-折叠结构。β-折叠与蛋白质分子的折叠和聚集相关，被认为是最稳定的蛋白质构象。因此本技术中β-折叠含量的增大促进稳定共聚物的形成。
53.(2)用ans荧光探针对蛋白样品的表面疏水性进行测定。以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10％(w/v)的浓度梯度配制蛋白溶液。取20μl的ans(溶于8.0mm磷酸盐缓冲液)添加至4ml的蛋白样品中，样品荧光强度通过荧光分光光度计测定，设置激发波长为390nm，发射波长为470nm，荧光强度与蛋白浓度之间的初始斜率即为蛋白表面疏水特性(h0)。结果表明，交联后的蛋白样品表面疏水性从30.50上升至35.61。原因是转谷氨酰胺酶交联促使更多疏水性基团的暴露，证实与汉麻籽蛋白通过转谷氨酰胺酶交联改变了酪蛋白的三级结构。据报道，蛋白质致敏性与分子结构密切相关，酪蛋白二三级结构的变化将进一步导致其分子的ige结合能力发生变化。
54.(3)对处理后的蛋白样品进行体外消化率测试，并以酪蛋白、汉麻籽蛋白以及其混合物作为对照，通过体外消化过程中的氮释放分析，评估蛋白样品的体外消化率。整个消化过程在37℃水浴条件下进行以模仿人体内消化环境。首先配置浓度为1％的蛋白悬浮液，并用2m盐酸调节ph至2.0。随后加入胃蛋白酶(20mg/g蛋白)并振荡孵育1h。用1m naoh调节悬浮液ph至7.5以终止胃消化阶段，后加入胰蛋白酶(20mg/g蛋白)，振荡孵育2h。在体外消化1h、2h、3h时分别收集样品溶液，并用同体积的15％三氯乙酸洗涤，随后在8000
×
g下离心15min以收集上清液。通过凯氏定氮测定上清液的氮含量。根据以下公式计算样品体外消化率：
[0055][0056]
式中，n0为上清液n含量，n
total
为样品总氮含量。
[0057]
图2为蛋白样品消化过程中的氮释放曲线。四种蛋白样品显示出相似的氮释放特
性，其消化过程主要集中于胃消化阶段(0-1h)和肠道消化前半阶段(1-2h)。而在消化的2-3h阶段内，所有蛋白样品的氮释放曲线逐渐趋于平稳。在胃消化阶段中，能看到酪蛋白、汉麻籽蛋白以及对混合蛋白显示出较为相似的消化特性。胃消化阶段结束后，上述三种蛋白的消化率呈现酪蛋白》酪蛋白、汉麻籽蛋白混合物》汉麻籽蛋白的规律，但因释放曲线堆积而使此规律并不显著。但经交联后的酪蛋白在胃消化1h后的消化率显著降低。赖氨酸作为胃蛋白酶酶切位点之一，在转谷氨酰胺酶诱导下与谷氨酰胺残基共价交联形成异肽键，从而抑制胃蛋白酶的水解作用。进入肠道消化阶段后，四种蛋白的氮释放量持续增加证实了胰蛋白酶的水解作用。在肠道消化阶段，酪蛋白、混合蛋白和经交联的酪蛋白的氮释放增加了3至4倍，而汉麻籽蛋白显示出最平缓的释放曲线，其氮释放量仅增大一倍左右，消化结束后其最终的消化率仅有50％左右，这表明汉麻籽蛋白含有较少的胰蛋白酶酶切位点。酪蛋白在体外消化终点具有最高的消化率，混合蛋白体外消化率介于酪蛋白和汉麻籽蛋白之间。与上述胃消化阶段相似，与汉麻籽蛋白通过转谷氨酰胺酶交联显著降低了酪蛋白的体外消化率，归因于转谷氨酰胺酶酶诱导更大分子量的抗消化共聚物的形成。但是，酪蛋白消化率的降低有利于增强饱腹感，并且在胃肠道特异性药物递送方面具有更大的应用潜力。
[0058]
(4)通过酪蛋白试剂盒测定处理后的酪蛋白消化前后的致敏性，以酪蛋白和酪蛋白、汉麻籽蛋白混合物为对照。将消化前后的蛋白样品稀释适当倍数并吸取100μl加入至有特异性抗体包被的微孔板中，在室温下孵育10min，倒出孔中的液体，倒置微孔板并在吸水纸上拍打3次，加入250μl洗涤缓冲液，重复3次。加入酶标记的抗体并在室温下孵育10min，倒出并加入洗涤缓冲液，倒置微孔板并在吸水纸上拍打3次，重复洗涤3次后加入100μl底物，室温下避光孵育10min。最后加入100μl反应终止液并充分混合，于450nm处测量吸光值。根据标准曲线，计算样品的抗原性。
[0059]
如图3所示，酪蛋白和混合蛋白在体外消化前致敏性没有明显差异而转谷氨酰胺酶交联显著降低了酪蛋白体外消化前的致敏性。这是因为转谷氨酰胺酶能催化赖氨酸残基和谷氨酰胺残基生成异肽共价键，最终形成呈多分支结构的共聚物。当有足够多的交联位点参与交联时，转谷氨酰胺酶诱导的多分支结构可能会掩盖潜在的ige结合位点，进而降低蛋白质致敏性。天然状态下过敏原蛋白90％以上的表位具有构象性，有些线性表位是构象性表位的组成部分，所以本研究中酪蛋白的空间结构与抗原性密切相关。转谷氨酰胺酶交联显著影响了酪蛋白的二三级结构和表面特性，这些过敏原的构象变化能改变ige抗原决定簇进而引起免疫活性变化。消化作用显著降低了蛋白的致敏性，归因于消化酶的水解作用破坏了ige结合位点。消化结束后，酪蛋白、混合蛋白和经交联的酪蛋白显示出相似的致敏性。表明仍有未被消化酶水解的过敏原表位，并且这证实了转谷氨酰胺酶交联只能降低消化前或轻度水解时的致敏性，其交联作用并未破坏蛋白的ige结合位点，而是通过聚合作用掩埋其过敏原表位。因此随着消化的进行尤其是后期阶段，酪蛋白致敏性的降低主要是由于蛋白酶对过敏原表位的破坏作用而与转谷氨酰胺酶无关。上述致敏性实验是基于相同浓度的酪蛋白，因此实际与汉麻籽蛋白交联后的酪蛋白应当具有更低的致敏性。
[0060]
(5)首先将干燥的蛋白样品进行喷金处理，随后用扫描电子显微镜在电压为5kv条件下观察蛋白样品的微观结构，以酪蛋白和汉麻籽蛋白以及混合蛋白为对照。如图4～7所示，酪蛋白呈现表面光滑的片状微观结构。而汉麻籽蛋白的表面相对粗糙，可能是碱溶酸沉法提取汉麻籽蛋白过程中蛋白质有轻微变性。交联后的酪蛋白显示出不同于其他三种蛋白
的微观结构，其表面出现明显的颗粒状突起。证明转谷氨酰胺酶交联显著改变了复合蛋白的微观形貌，这主要归因转谷氨酰胺酶对酪蛋白的结构修饰。
[0061]
实施例2
[0062]
汉麻籽蛋白的提取：汉麻籽蛋白通过碱溶酸沉法制备。首先在经粉碎后汉麻籽中添加正己烷(1:2.5，w/v)进行脱脂，搅拌2h，并重复该过程三次。然后在室温下，在通风橱中风干22h。将脱脂后的汉麻籽粉分散在去离子水中(1:9，w/v)，用6m naoh调节ph至12，并在25℃下连续搅拌2h。将混合物在6000
×
g下离心15min，并使用6m hcl将上清液的ph调节至4.5，并在3℃下过夜以沉淀蛋白质。沉淀通过6000
×
g离心15min分离，然后分散于蒸馏水中并调节ph至7.0。然后将混合物冻干并在3℃下储存，直至使用。
[0063]
酪蛋白和汉麻籽蛋白混合溶液配制：首先分别配制浓度为6％(w/v)的酪蛋白和汉麻籽蛋白溶液，以6:1的质量比混合，室温下用磁力搅拌器搅拌30min，转速为300r/min。得到酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液。
[0064]
交联反应：将上述酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液置于40℃水浴锅中预热8min，称取并加入50u/g转谷氨酰胺酶至上述混合物溶液，用磁力搅拌器搅拌3min，转速为300r/min。置于40℃水浴锅中孵育1h，完成交联。
[0065]
终止交联：将上述经交联的酪蛋白溶液置于3℃冰箱内孵育30min。
[0066]
实施例3
[0067]
汉麻籽蛋白的提取：汉麻籽蛋白通过碱溶酸沉法制备。首先在经粉碎后汉麻籽中添加正己烷(1:3.5，w/v)进行脱脂，搅拌2.5h，并重复该过程三次。然后在室温下，在通风橱中风干23h。将脱脂后的汉麻籽粉分散在去离子水中(1:11，w/v)，用6m naoh调节ph至11.5，并在25℃下连续搅拌2.5h。将混合物在6000
×
g下离心12min，并使用6m hcl将上清液的ph调节至4.5，并在5℃下过夜以沉淀蛋白质。沉淀通过6000
×
g离心12min分离，然后分散于蒸馏水中并调节ph至7.0。然后将混合物冻干并在5℃下储存，直至使用。
[0068]
酪蛋白和汉麻籽蛋白混合溶液配制：首先分别配制浓度为6％(w/v)的酪蛋白和汉麻籽蛋白溶液，以8:1的质量比混合，室温下用磁力搅拌器搅拌30min，转速为300r/min。得到酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液。
[0069]
交联反应：将上述酪蛋白、汉麻籽蛋白混合溶液置于40℃水浴锅中预热10min，称取并加入10u/g转谷氨酰胺酶至上述混合物溶液，用磁力搅拌器搅拌3min，转速为300r/min。置于40℃水浴锅中孵育2h，完成交联。
[0070]
终止交联：将上述经交联的酪蛋白溶液置于5℃冰箱内孵育40min。
[0071]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。