一种阻断性多肽Q肽及其应用的制作方法

一种阻断性多肽q肽及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种阻断性多肽q肽及其应用。


背景技术：

2.pi3k参与多种重要的病理生理学过程，在肿瘤细胞代谢、生长、增殖、血管生成和肿瘤转移过程中都起重要的作用。pi3k的过度活化与30-50％的人类肿瘤病例相关，抑制pi3k的活化可以被用作治疗肿瘤的靶标。
3.pi3k抑制剂可以通过抑制pi3k活化达到抑制肿瘤的作用，目前针对pi3k的小分子抑制剂包括泛pi3k抑制剂，pi3k亚型特异性抑制剂和pi3k/mtor双抑制剂。泛pi3k抑制剂是一种atp竞争性抑制剂，可以无选择性的抑制i型pi3k的所有亚型(α，β，δ，γ)，特异性较差从而导致较多副反应的产生，如疲劳、腹泻、皮疹和高血糖等，呈剂量依赖性毒性。因此，泛pi3k抑制剂很多都终止于不同阶段的临床试验，只有copanlisib被fda批准应用于临床。pi3k亚型特异性抑制剂可以针对pi3k不同亚型进行选择性抑制，因此治疗范围比较狭窄，但减少了一定的由于抑制剂脱靶效应而导致的毒性作用。这类抑制剂的副反应主要取决于其对pi3k异构体的特异性，例如，pi3kα抑制剂的副作用主要是导致皮疹和高血糖症，pi3kδ抑制剂的副作用主要是胃肠道反应，转氨酶升高和骨髓抑制。pi3k亚型特异性抑制剂中，艾德拉尼(idelalisib)、umbralisib、度恩西布(duvelisib)和阿吡利塞(alpelisib)已经被批准应用于临床，idelalisib作为第一个被fda批准的pi3kδ抑制剂，可以用于慢性粒细胞性白血病治疗，但是在治疗的过程中会出现不同程度的由于抑制剂脱靶效应导致的自身免疫性反应、感染、肝毒性和腹泻等副反应。pi3k/mtor双抑制剂毒性作用更为广泛，还没有药物通过fda批准应用于临床。因此，通过pi3k抑制剂抑制pi3k活化存在诸多问题，我们有必要从新的方向设计抑制pi3k活化的药物。
4.pi3k分子可以根据其底物特异性和结构特征被分为3大类，ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型。ⅰ型pi3ks根据调节方式的不同被分为两种亚型(a和b)，其中，ia型在肿瘤中起重要作用，ia型pi3k由调节亚基(p85α，p85β，p55α，p55γ，p50α)和催化亚基(p110α，p110β，p110δ)组成，调节亚基与催化亚基结合形成二聚体是ia型pi3k分子结构完整及发生活化的基础。目前，还没有关于通过竞争性阻断pi3k调节亚基与催化亚基的结合来抑制pi3k分子的活化的相关报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阻断性多肽q肽及其应用，本发明的阻断性多肽q肽竞争性阻断pi3k调节亚基与催化亚基的结合，从而抑制pi3k分子的活化。
6.本发明提供了一种阻断性多肽q肽，氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了上述方案所述的阻断性多肽q肽在制备pi3k抑制剂中的应用。
8.优选的，所述pi3k抑制剂包括pi3k竞争性抑制剂。
9.本发明还提供了上述方案所述的阻断性多肽q肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.优选的，所述抗肿瘤包括抑制肿瘤细胞增殖。
11.优选的，所述肿瘤包括胃肠间质瘤和/或神经母细胞瘤。
12.本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括上述方案所述的阻断性多肽q肽和药学上可接受的辅料。
13.优选的，所述药物的剂型包括注射剂或栓剂。
14.本发明还提供了一种pi3k抑制剂，包括上述方案所述的阻断性多肽q肽和药学上可接受的辅料。
15.本发明提供了一种阻断性多肽q肽。本发明的阻断性多肽q肽竞争性阻断pi3k调节亚基与催化亚基的结合，从而抑制pi3k分子的活化，抑制肿瘤细胞增殖。本发明为治疗肿瘤提供了一种新的思路。
附图说明
16.图1为阻断性多肽处理人胃肠间质瘤细胞系gist-t1细胞48h后细胞的存活率；
17.图2为阻断性多肽处理人细胞系be(2)c细胞48h后细胞的存活率；
18.图3为阻断性多肽处理人神经母细胞瘤细胞系kelly细胞48h后细胞的存活率。
具体实施方式
19.本发明提供了一种阻断性多肽q肽，氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：nfaeiatrkmqpprrrqrrkkrgy。
20.在本发明中，所述阻断性多肽q肽包括一段pi3k阻断序列，如seq id no.2所示，具体为：nfaeiatrkmq，pi3k阻断序列可以竞争性阻断pi3k分子p85亚基与p110亚基结合从而抑制pi3k分子活化。但是pi3k阻断序列本身无法进入细胞，因此又添加了一段来源于hiv的tat短肽序列，如seq id no.3所示，具体为：pprrrqrrkkrgy，来源于hiv的tat短肽序列辅助pi3k阻断序列进入细胞发挥阻断作用。本发明的阻断性多肽q肽竞争性阻断pi3k调节亚基与催化亚基的结合，从而抑制pi3k分子的活化，抑制肿瘤细胞增殖。
21.本发明对所述阻断性多肽q肽的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规多肽的合成方法即可。在本发明具体实施过程中，所述阻断性多肽q肽为全合成的全d型氨基酸序列。
22.本发明还提供了上述方案所述的阻断性多肽q肽在制备pi3k抑制剂中的应用。
23.在本发明中，所述pi3k抑制剂优选的包括pi3k竞争性抑制剂。
24.本发明还提供了上述方案所述的阻断性多肽q肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
25.在本发明中，所述抗肿瘤包括抑制肿瘤细胞增殖。
26.本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括上述方案所述的阻断性多肽q肽和药学上可接受的辅料。本发明对所述辅料没有特殊限制，采用本领域的常规辅料即可。
27.在本发明中，所述药物的剂型优选的包括注射剂或栓剂。
28.在本发明中，所述肿瘤优选的包括胃肠间质瘤和/或神经母细胞瘤，更优选的包括人胃肠间质瘤或人神经母细胞瘤。在本发明中，所述人神经母细胞瘤优选的包括be(2)c细胞或人神经母细胞瘤细胞系kelly。
29.本发明还提供了一种pi3k抑制剂，包括上述方案所述的阻断性多肽q肽和药学上
可接受的辅料。
30.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
31.实施例1
32.1、阻断性多肽q肽，为全合成的全d型氨基酸序列，氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：nfaeiatrkmqpprrrqrrkkrgy。
33.多肽溶液配制：用市售无菌pbs溶液(0.0067mol/l po4，不含钙镁离子，ph 7.0～7.2)分别溶解全合成的d型q肽和tat短肽(pprrrqrrkkrgy，seq id no.4，tat短肽是现有技术中用于辅助短肽进入细胞的一段氨基酸序列)粉末，配制成浓度为5mmol/l的多肽储存液，-80℃保存，暂时储存可放置在-20℃。加入无菌pbs溶液的体积按(1)计算：
[0034][0035]
其中，v表示加入无菌pbs的体积(l)；m表示全合成的d型多肽的质量(g)；p表示全合成的d型多肽的纯度(％)；mw表示全合成的d型多肽的分子量(g/mol)。
[0036]
2、通过细胞增殖(mtt)实验，确认q肽与对照组tat短肽相比，具有明确的抑制肿瘤细胞增殖的作用。
[0037]
细胞增殖实验步骤如下：
[0038]
(1)准备好gist-t1细胞、be(2)c细胞、kelly细胞、移液枪、灭菌枪头、无菌96孔板、胰酶、dmem培养基、gibco胎牛血清、100
×
青链霉素等；
[0039]
(2)在生物安全柜中分别将三种肿瘤细胞消化、离心取沉淀，加入培养基重悬成细胞悬液，用细胞计数板对细胞进行计数，将细胞悬液稀释为8
×
104个细胞/ml，将稀释后的细胞悬液混匀，接种于96孔板中，每孔100μl，每种肿瘤细胞接种36孔，其余空孔用pbs补充体积；
[0040]
(3)配制三种细胞培养基：a.gist-t1细胞培养基配方：dmem培养基，15％胎牛血清，1％青链霉素；b.be(2)c细胞培养基配方：dme/f-12培养基，10％胎牛血清，1％青链霉素；c.kelly细胞培养基配方：1640培养基，10％胎牛血清，1％青链霉素。24h后细胞贴壁，用gist-t1细胞培养基将阻断性多肽q肽及对照组多肽稀释，使其终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40μm。分别用be(2)c细胞培养基和kelly细胞培养基将阻断性多肽q肽及对照组多肽稀释，使其终浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100μm，将三种肿瘤细胞的培养基分别吸出，并分别加入含有不同浓度多肽的细胞培养基，放入37℃培养箱中继续培养48h；
[0041]
(4)向上述2块96孔板的108个孔中分别加入mtt试剂，每孔50μl，放入37℃培养箱中孵育4h；
[0042]
(5)将这108个孔中的液体吸出，加入150μl dmso溶解形成的蓝紫色沉淀，轻轻摇晃96孔板使沉淀溶解，用酶标仪测定490nm处溶液的吸光度值并按照(2)计算细胞存活率：
[0043][0044]
其中，指的是多肽浓度为0的对照组所有孔在490nm处吸光度值的平均值；n指的是不同浓度多肽处理的实验孔在490nm处的吸光度值；k指的是多肽浓度为0的对照孔在
490nm处的吸光度值。
[0045]
(6)根据计算得出的细胞存活率绘制存活率曲线图。
[0046]
实验结果参见图1～图3。由图1～图3可以看出，q肽与对照组tat短肽相比，具有明确的抑制肿瘤细胞增殖的作用。
[0047]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。