一株侧孢短芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物应用技术，特别是含有特定侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)菌株及其应用。


背景技术：

2.侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)，是一类好氧细菌，在寒带、温带、热带均有分布，存在于植物表面、昆虫体内、土壤、淡水或海水中。侧孢短芽孢杆菌菌体生长过程中会产生不同水平的多种代谢产物，芽孢菌胺、肽类抗生素、聚酮化合物以及几丁质酶等，一些优良菌种根据其特性被制成抑菌剂、免疫调节剂、土壤改良剂等在医药、农业、养殖业领域广泛应用。
3.侧孢短芽孢杆菌制剂产品的品质和功效主要依赖于菌种本身的特性，筛选到好的菌种是提供优质产品的前提。菌种在传代过程中可能会发生退化、变异等；因此，有必要持续开发筛选优良菌种，为侧孢短芽孢杆菌制剂产品提供候选材料。


技术实现要素：

4.为丰富本领域可用产品，提供优质农业用生防菌剂，本发明研发并筛选获得一株多功能侧孢短芽孢杆菌，具体如下：
5.一株侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)菌株cb202103-8，保藏号为cgmccno.22964。
6.含有上述侧孢短芽孢杆菌的发酵液。
7.所述侧孢短芽孢杆菌在抗番茄灰霉病中的用途，其特征在于，包括以下任一措施
8.(1)在番茄生长发育期的任何阶段向番茄植株喷洒上述发酵液；
9.(2)向采摘后的番茄上喷洒上述发酵液；
10.(3)在番茄栽培地块的土壤喷洒上述发酵液；
11.所述发酵液，的侧孢短芽孢杆菌有效浓度在1
×
105～1
×
107cfu/ml之间；或5
×
105～ 5
×
106cfu/ml之间。
12.所述侧孢短芽孢杆菌在制备土壤调理剂中的用途。
13.所述侧孢短芽孢杆菌在治理土壤有机农药污染中的用途，其特征在于，向待治理农田中喷施侧孢短芽孢杆菌的发酵液。
14.本发明对分离自取自农田环境中的150份菌株进行抗番茄灰霉病病原菌筛选和氨基甲酸酯降解测试，选到一株侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)，经试验检测确定其能够抗番茄灰霉病病原菌，并大幅度降解土壤中所含氨基甲酸酯类农药。采用该菌剂，有助于防治番茄灰霉病，提高产量和番茄质量，减少损失；因此将该分离菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，据此请求保护一下技术方案：
15.保藏信息：
16.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
17.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101
18.保藏日期：2021年7月27日
19.菌株名称为：cb202103-8
20.保藏号为：cgmcc no.22964.
21.分类命名：侧孢短芽孢杆菌brevibacillus laterosporus
具体实施方式
22.以下通过具体实施例对本发明进行说明。
23.1.菌株的分离
24.取样时间：2021年3月
25.取样地点：河南郑州
26.在多处农田土壤进行取样共150份，每处5-10g，每份样品装入一个三角瓶中，加入200ml灭菌水，搅拌均匀后，震荡10分钟制成悬浮液，取悬浮液1ml，加9ml双蒸水，然后用双蒸水进行梯度稀释；取200ul稀释液涂布于lb平板培养基上，于25-35摄氏度培养20-50 小时，挑取形态一致的优势单菌落转至lb平板培养基划线纯化，取部分进行分析、检测和筛选，其余保存于-70摄氏度冰箱。
27.2.菌株筛选和鉴定
28.2.1番茄灰霉病病原菌拮抗菌筛选
29.灰葡萄孢(botrytis cinerea)斜面菌种，cgmcc no.3.4583，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
30.培养基：pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，自来水1 000ml，自然ph；pdb液体培养基：不加琼脂，其它成分同pda培养基。
31.将病原菌接种于pda培养基上，22℃倒置培养。
32.采用平板对峙法。用打孔器取活化的病原菌菌饼(直径为6mm)置于pda平板中央，22℃培养24h；用灭菌的牙签挑取纯化好的待测菌种点接在距平皿中心3cm处的4个角点上， 30℃培养3-5d。每处理设3个重复，以只接种病原菌的平板作对照，观察病原菌的生长状态，选出对病原菌生长有抑制作用，且被抑病原菌丝边缘平齐、拮抗作用持久的菌株，测量病原菌菌落直径，计算菌株的抑制率：
33.抑制率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-原菌饼直径)]x 100％。
[0034]
实验中选出20个候选菌株,其抑制率在65.05-80.31％之间，本发明请求保护的 cb202103-8抑制率达到78.85％。
[0035]
2.2拮抗菌形态鉴定
[0036]
对选出的候选拮抗菌株进行形态鉴定。
[0037]
在lb培养基上，本发明请求保护的cb202103-8，菌落边缘圆滑，不透明灰白色，表面无褶皱。在电镜下观察：菌体杆状、周生鞭毛、菌落大小约(0.6～1)μm
×
(2.0～4.0) μm,可见芽孢侧生。
[0038]
革兰氏染色结果可变：延迟期g-、对数期g

、稳定期为g-。
[0039]
用phoenixtm 100型全自动微生物分析仪对进行鉴定，参照《伯杰细菌鉴定手册》
的菌株生理生化检测方法对选出的菌株cb202103-8进行检测：
[0040]
菌株cb202103-8在10-40摄氏度范围，ph7-9范围内能正常生长，最适生长温度为20-30 摄氏度，ph7.2～8.0。初步鉴定确定为侧孢短芽孢杆菌。
[0041]
2.3 16s rdna序列分析鉴定
[0042]
16s rdna序列扩增特异性引物如下，为委托合成：
[0043]
正向引物primer a 5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
(seq id no.1)，
[0044]
反向引物primer b：5
′‑
tacggataccttgttacgactt-3
′
(seq id no.2)。
[0045]
用takara
tm
细菌基因组dna提取试剂盒提取候选菌株的基因组dna，以此为模板进行 pcr扩增。
[0046]
pcr反应体系(50μl)：takara la-taq 0.5μl，dna模板2μl，10
×
pcr buffer 5 μl，dntp mixture 8μl，上、下游引物各2μl，双蒸水30.5μl。
[0047]
pcr程序：94℃预变性5min，94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸7min。
[0048]
pcr产物纯化后进行测序，所得测序结果通过ncbi数据库进行blast比对分析。
[0049]
结果表明：本发明选出的菌株cb202103-8的16s rdna片段大小为1526bp，将其与已知侧孢短芽孢杆菌进行比对，相似性为99％。
[0050]
通过mega5.0软件分析进化关系，结果显示，cb202103-8与侧孢短芽孢杆菌亲缘关系最近，确定为侧孢短芽孢杆菌。
[0051]
将该分离菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，菌株名称为：cb202103-8，保藏号为：cgmcc no.22964.
[0052]
3.菌株检测
[0053]
3.1侧孢短芽孢杆菌cb202103-8对番茄灰霉病防效检测
[0054]
将保存的cb202103-8菌株于lb培养基上活化24小时，挑取单菌落接种于20ml lb液体培养基中，为菌种液。再按1％接种到100ml培养基中培37摄氏度，200r/min恒温振荡培养 24小时，得到cb202103-8培养液。用无菌水稀释成1x107cfu/ml。
[0055]
用打孔器在pad培养基上生长5天的灰葡萄孢菌边缘打孔，取菌块接入50ml无菌水中， 28摄氏度、180rpm振荡培养10分钟，稀释成1x106cfu/ml。
[0056]
对番茄果实表面进行消毒：75％酒精擦拭30s，无菌水清洗3次。用灭菌枪头打孔，每个果实表面6个孔；每个处理10个果实。处理组cb202103-8培养液浓度分别为1
×
107、 5
×
106、1
×
106、5
×
105和1
×
105cfu/ml，先在孔中分别加入20μl培养液，2h后加入20 μl 1
×
106cfu/ml的灰葡萄孢菌悬液，仅接种灰葡萄孢菌为阳性对照ck1，无菌水为阴性对照ck2。测定拮抗菌cb202103-8对番茄灰霉病(灰葡萄孢菌)的防治效果，黑暗保湿48 h，28℃恒温培养，观察发病情况，计算发病率和病情指数。
[0057]
病害严重度分级标准如下：0级无病；1级1个发病孔；2级2个发病孔；3级3个发病孔；4级4个发病孔；5级5-6个发病孔。
[0058]
病情指数(％)＝{σ[(各级病果数
×
相对级数值)]/调查总果数
×
5}
×
100％
[0059]
防治效果(％)＝{[阳性对照病情指数-处理病情指数]/阳性对照病情指数}
×
100％
[0060]
调查结果如下表1：
[0061]
表1:cb202103-8对番茄灰霉病(灰葡萄孢菌)的防效
[0062][0063]
从表1可以看出,加入高浓度拮抗菌cb202103-8的番茄，在第3天时未发病，达到 100％，第5天时88.2％，第7天仍可达到80.5％；当拮抗菌浓度降低为5
×
106cfu/ml 时，在第3天和第5天时防效与高浓度无显著性差异，但当第7天时防效明显降低，说明低浓度防效持效性有所降低；当拮抗菌a60浓度低于5
×
105cfu/ml时，虽然有所降低，仍然有显著防效。作为生防菌剂，使用浓度建议在1
×
105～1
×
107cfu/ml之间，优选，5
×
105～ 5
×
106cfu/ml之间。
[0064]
3.2对土壤氨基甲酸酯类农药吸附和降解功能测试
[0065]
先用技术中报道，侧孢短芽孢杆菌可能土壤有机污染物具有降解作用。氨基甲酸酯类化合物在农药上用作杀虫剂、杀螨剂、除草剂[灭草灵，n-(3，4－二氯苯基)氨基甲酸甲酯)] 和杀菌剂，被广泛使用，因此大面积农田存在氨基甲酸酯类农药累积，导致蔬果中农药残留，是时下蔬菜中农药残留的重点检测品种。
[0066]
因此，本发明对2.1中选出的20个候选拮抗菌株(包含cb202103-8)进行氨基甲酸酯类农药降解测试，希望从中选到兼顾番茄灰霉病抗性和有机污染物降解功能都较好的优势菌株。
[0067]
试剂：
[0068]
灭草灵(cas#:1918-18-9)，0.1mg/ml，北京百灵威科技有限公司
[0069]
实验设计：
[0070]
实验组1.在250ml具塞三角瓶中，加入100g土壤样品，加入拮抗菌株lb培养基培养液5
×
106cfu/ml 5ml，然后加入无菌水稀释的灭草灵100ml(浓度为100ug/kg)；然后置于25摄氏度水浴恒温振荡器中培养，于不同时间点取样在4，000g转速离心20分钟，取上清测定灭草灵浓度；
[0071]
实验组2.在250ml具塞三角瓶中，加入拮抗菌株lb培养基培养液5
×
106cfu/ml 5ml，然后加入无菌水稀释的灭草灵100ml(浓度为100ug/l)；然后置于28摄氏度水浴恒温振荡器中培养，于不同时间点取样在4，000g转速离心20分钟，取上清测定灭草灵浓度；
[0072]
对照组：在250ml具塞三角瓶中，加入100g土壤样品，加入无菌水稀释的灭草灵100ml (浓度为100ug/kg)；然后置于25摄氏度水浴恒温振荡器中培养，于不同时间点取样在4， 000g转速离心20分钟，取上清测定灭草灵浓度；
[0073]
灭草灵浓度的测定完全按照gb5085.6-2007附录h的标准操作流程。测定结果如表2。
[0074]
表2.cb202103-8处理中灭草灵浓度动态变化
[0075][0076]
测定结果显示，实验组1，2和对照组在24小时之后达到平衡；在12个小时，实验组1 中灭草灵的浓度比初始减少了44％，达到平衡时，减少65％以上；不加土壤的实验组2的结果接近于实验组1。说明灭草灵浓度的减少，主要是被所加拮抗菌(cb202103-8)生物利用降解，而不是土壤吸附；对照组随着时间推移，灭草灵浓度也在减少，这是因为其自然挥发和降解导致；总的来说，cb202103-8菌株在降解以灭草灵为代表的氨基甲酸酯类农药上，表现出明显的功效，是作为污染土壤的改良剂的优秀候选菌株。