自身抗体介导的眼疾的治疗和诊断的制作方法

自身抗体介导的眼疾的治疗和诊断
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2018年11月8日提交的美国临时专利申请号62/757,641和于2019年5月31日提交的美国临时专利申请号62/855,253的权益，上述文献的全部内容通过引用并入本文。
3.关于联邦资助研究的声明
4.本公开是在由美国国家眼科研究所(national eye institute，nei)/美国国立卫生研究院(national institutes of health，nih)授予的授权号r01 ey024966下由政府支持进行的。政府对本公开享有一定权利。
技术领域
5.本公开涉及一种眼科制剂，所述眼科制剂能够降低在眼表和/或眼内的自身抗体的浓度或有害活动，以预防或治疗炎性、免疫性、过敏性、感染性和创伤性眼表和/或眼内眼疾病。


背景技术：

6.炎性、免疫性、过敏性、感染性和创伤性眼表和眼内疾病可引起各种体征和症状，包括但不限于：眼不适、眼发红、干眼综合症、结膜炎、角膜炎、睑球粘连形成(symblepheron formation)、穹窿透视缩短(fornix foreshortening)、睑缘/结膜角质化和结膜下纤维化。眼表疾病的更具体的类型包括：眼移植物抗宿主病(ogvhd)；史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnson syndrome)；眼瘢痕性类天疱疮(ocp)；轻度、中度和重度泪液缺乏性干眼病(ded)；睑板腺疾病；眼酒渣鼻；麦粒肿；睑缘炎；上缘角膜结膜炎(slk)；泪液充足的ded；眼睑松弛综合症；神经营养性眼疾；症状体征断开(symptom
‑
sign disconnect)(不一致的ded)；神经性疼痛；甲状腺眼疾(格雷夫氏眼病(grave’s ophthalmopathy))；类风湿性关节炎相关眼疾；狼疮相关眼疾；干燥综合症(sjogren’s syndrome)；继发性干燥综合症(secondary sjogren’s syndrome)；眼酒渣鼻；过敏性角膜结膜炎(春季)；病毒性角膜结膜炎(腺病毒ekc、疱疹病毒)；泰格森氏角膜炎(thygeson’s keratitis)；无虹膜；角膜炎或术后/伤后眼病状；边缘溃疡性角膜炎(peripheral ulcerative keratitis)；角膜炎；表层巩膜炎(episcleritis)；巩膜炎；视网膜胶质增生(retinal gliosis)；葡萄膜炎(前或后)；以及青光眼(开角型或闭角型或正常眼压型)。
7.针对这些眼表疾病中的一些(特别是干眼综合症)的常规治疗包括：(i)滴注人工泪液以补充和刺激泪液；以及(ii)使用抗炎药来减轻眼表炎症。通常，当前的干眼病治疗包括：局部应用人工泪液产品/润滑剂；泪液保持管理；刺激泪液分泌；局部应用抗生素(例如，红霉素或杆菌肽药膏)；口服给药四环素类(例如，四环素、多四环素或米诺环素)；应用抗炎化合物和皮质类固醇类。用于某些眼内疾病的常规治疗包括：(i)降低眼内压的治疗；以及(ii)类固醇眼内注射。这些治疗通常很费时，难以令人满意，并且常常无效或偶尔有效。此外，尽管常规治疗在某种程度上可有效减轻干眼综合症的症状，但它具有许多不希望有的
副作用，诸如烧灼感和刺痛感。减少局部副作用并提高患者的舒适度和对治疗的反应是本公开的目的之一。
8.眼表疾病治疗中的常规治疗的另一个缺点是活性药物成分摄取到角膜细胞中的程度及其在角膜中的停留时间不一致，从而无法在不连续应用的情况下有效治疗眼表疾病综合症。尽管药膏或乳膏制剂可允许停留较长时间，但这类制剂可能不会破坏角质层(皮肤的浅表角质化层)，并且可能无法到达存在于眼睑组织中更深处的血管和神经。
9.与常规治疗有关的另一个问题是没有直接解决根本原因。发现眼表疾病的原因使得可以进行更有效的治疗。大部分常规治疗仅治疗眼表疾病的症状。
10.因此，一直需要用于有效治疗与眼表和眼内疾病有关的临床病状的诊断试剂盒、组合物和方法。另外，需要解决眼表和眼内疾病的根本原因。


技术实现要素：

11.本公开的一些方面提供了一种眼科制剂，所述眼科制剂包含：(a)一种或多种药学上可接受的眼科赋形剂；以及(b)免疫球蛋白g(igg)或其片段。
12.本公开的一些方面提供了一种眼科制剂，所述眼科制剂包含：(a)一种或多种药学上可接受的眼科赋形剂；以及(b)合并血浆衍生的合并人免疫球蛋白g(igg)。
13.另外，本公开提供了一种眼科制剂，所述眼科制剂包含：(a)一种或多种药学上可接受的眼科赋形剂；以及(b)用于治疗临床病状的眼用药学活性化合物，所述临床病状选自由以下各项组成的组：炎性、感染性、免疫性、过敏性和/或创伤性眼表疾病或眼内疾病，其中，所述药学活性化合物包含igg。
14.在各个方面，本公开提供了一种包含药学活性化合物的眼科制剂，所述眼科制剂能够减少眼表或眼内的自身抗体的量或有害生物学作用，这类自身抗体是响应于瓜氨酸化蛋白而产生的(本文称为“acpa自身抗体”，其是响应于蛋白质的瓜氨酸化而产生的)，或者是响应于高瓜氨酸化蛋白(homocitrullinated
‑
protein)而产生的自身抗体(本文称为“抗carp抗体”，其是响应于蛋白质的氨甲酰化而产生的)，或者是响应于天然蛋白产生的天然自身抗体。瓜氨酸化和氨甲酰化是蛋白质的翻译后修饰(ptm)的两种类型。在相关方面，所述药学活性化合物包含免疫球蛋白g(igg)或其片段。这些眼科制剂还可以包含一种或多种药学上可接受的眼科赋形剂。
15.在各个方面，所公开的眼科制剂包含一种或多种药学上可接受的眼科赋形剂。例如，所述药学上可接受的眼科赋形剂选自：环糊精类；卡波普或卡波姆或丙烯酸聚合物；泊洛沙姆；木葡聚糖；甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素；乙基(羟乙基)纤维素；假胶乳；邻苯二甲酸乙酸纤维素(cellulose acetate phthalate)；结冷胶；藻朊酸盐(alginate)；卡拉胶类；透明质酸；乙酸钠；依地酸二钠；羟丙甲纤维素；乙酸；乙醇；海藻酸(alginic acid)；amerchol
‑
cab；安替比林；苯扎氯铵；苯扎溴铵(benzododecinium bromide)；硼酸；咖啡因；氯化钙；卡波姆1342；卡波姆934p；卡波姆940；卡波姆均聚物b型(季戊四醇烯丙基醚交联)；羧甲基纤维素钠；蓖麻油；鲸蜡醇；氯丁醇；柠檬酸；一水合柠檬酸；肌酸酐；苯乙烯二乙烯基苯共聚物(divinylbenzene styrene copolymer)；乙烯乙酸乙烯酯共聚物；结冷胶(低酰基)；甘油；甘油硬脂酸酯；羟丙甲纤维素类；羊毛脂；劳拉氯铵；月桂酰肌氨酸；氯化镁；对羟基苯甲酸甲酯；矿物油；壬苯醇醚
‑
9；辛苯聚醇
‑
40；矿脂；苯乙醇；乙酸苯汞；硝酸苯汞；泊利
氯铵；泊洛沙姆188或407；聚卡波非；聚乙二醇400或8000；聚乙二醇35蓖麻油；聚乙二醇40氢化蓖麻油；聚乙二醇40硬脂酸盐；聚丙二醇；聚山梨酯20；聚乙烯醇；氯化钾；山梨酸钾；聚维酮k29/32；聚维酮k30；聚维酮k90；聚维酮类；丙二醇；对羟基苯甲酸丙酯；纯碱；乙酸钠；硫酸氢钠；硼酸钠；硼酸钠十水合物；碳酸钠；氯化钠；柠檬酸钠；焦亚硫酸钠；硝酸钠；硫酸钠；亚硫酸钠；硫代硫酸钠；山梨酸；山梨醇；稳定的氯氧化络合物(stabilized oxychloro complex)；硫酸；硫柳汞；二氧化钛；托可索仑；柠檬酸三钠脱水物(trisodiumcitrate dehydrate)；氨丁三醇；泰洛沙泊；黄原胶；氯化锌；或它们的组合。
16.本公开的又一方面提供了一种眼科制剂，所述眼科制剂包含：(a)药学上可接受的眼科赋形剂；(b)治疗有效量的药学活性化合物，所述药学活性化合物包含合并人免疫球蛋白g(igg)；和/或(c)治疗有效量的合并人血浆蛋白、合并人血脂或它们的组合。如本文中所使用的，术语“治疗有效的”包括具有免疫调节作用或抵销(中和)自身抗体的能力。
17.在任何所公开的眼科制剂中，所述药学活性化合物可以包含：从自体血浆/血清中纯化的自体igg；多聚化的(multimerized)igg1 fc分子，igg1 fc六聚体；igg2a fc多聚体，斯塔都聚体(stradomer)；多价fc结构；糖蛋白工程化的(glycoengineered)唾液酸化的(sialylated)igg；igg
‑
fc糖基化；合成igg及其片段；或它们的组合。
18.在各个方面，任何所公开的眼科制剂可以进一步包含第二药学活性化合物，所述第二药学活性化合物选自：类固醇；抗炎剂，诸如甲基泼尼松、泼尼松、地塞米松、环孢菌素、非甾体抗炎药；粘液溶解剂，诸如n
‑
乙酰半胱氨酸、nacystelyn、n
‑
乙酰氨基葡萄糖；pad酶抑制剂，诸如紫杉醇、糖皮质激素类或cl
‑
脒(cl
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amidine)；或nets分解剂(dismantling agent)(dnase或肝素)；靶向fab抗体片段；fc受体阻滞肽；fc受体阻滞抗体；含有病原性表位的重组肽；常规合成dmard(甲氨蝶呤、来氟米特/特立氟胺、柳氮磺吡啶、氯喹/羟氯喹)；tnf
‑
α靶向治疗剂(英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗、赛妥珠单抗)；b细胞靶向治疗剂(利妥昔单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、他贝芦单抗)；t细胞靶向治疗剂(阿巴西普、贝拉西普)；白介素靶向治疗剂(托珠单抗、阿那白滞素、卡那奴单抗、利钠西普、苏金单抗)；生长和分化因子(地诺单抗、玛弗利木单抗(mavrilimumab))；jak通路抑制剂(托法替尼、巴瑞替尼、非洛替尼(filgotinib))；及它们的组合。
19.在一些实施方式中，存在于所述眼科制剂中的igg的浓度或量的范围为按重量计约0.01mg/ml至按重量计约1g/ml(1000mg/ml)，例如或按重量计约0.05mg/ml至约1g/ml、或按重量计约0.1mg/ml至约1g/ml、或按重量计约0.1mg/ml至约0.5mg/ml、或按重量计0.05mg/ml至按重量计约0.5mg/ml、或按重量计0.01mg/ml至按重量计约0.1mg/ml。在某些实施方式中，igg的浓度或量可以为约0.01mg/ml，在其他实施方式中，igg的浓度或量可以为约0.05mg/ml。在某些实施方式中，igg的浓度或量可以为约1mg/ml，在其他实施方式中，igg的浓度或量可以为约10mg/ml。
20.在各种实施方式中，igg的浓度或量可以为约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml、0.75mg/ml、0.8mg/ml、0.85mg/ml、0.9mg/ml、0.95mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、8.5mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml、
7.2、约ph 6.4至约ph 7.4、或约ph 6.5至约ph 7.5、约ph 6.6至约ph 7.6、约ph 6.8至约ph 7.8。例如，ph为约6.0、或约6.1、或约6.2、或约6.3、或约6.4、或约6.5、或约6.6、或约6.7、或约6.8、或约6.9、或约7.0、或约7.1、或约7.2、或约7.3、或约7.4、或约7.5、或约7.6、或约7.7、或约7.8、或约7.9、或约8.0。
30.在各个方面，任何所公开的眼科制剂包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，包括：聚乙烯醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆、多元醇、卡波普、普郎尼克类、卡波姆类、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、环糊精类、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、氯化钠、氯化钾、聚山梨酯80、植物油、防腐剂或它们的组合。
31.任何所公开的眼科制剂可以用于治疗粘膜处的炎性、感染性或免疫性疾病，或者在粘膜处表现出免疫调节作用。所述眼科制剂可以治疗炎性、感染性或免疫性疾病，或者在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上的粘膜处具有免疫调节作用。
32.在各个方面，所公开的眼科制剂包括具有防腐剂的多剂量小瓶或不含防腐剂的单剂量无菌容器。
33.在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者中的临床病状的方法，所述方法包括向所述患者给药本文所公开的眼科制剂的步骤，其中，所述临床病状是炎性眼表疾病或眼内眼疾、感染性眼表疾病或眼内眼疾、和/或免疫性眼表疾病或眼内眼疾。在各个方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者中的炎性、感染性和/或免疫性眼疾的方法，所述方法包括向患者给药本文所公开的眼科制剂的步骤。
34.在各个方面，本公开提供了一种减少、缓解或预防患有临床病状的患者的眼部不适的方法，所述方法包括向所述患者给药本文所公开的眼科制剂的步骤，其中，所述临床病状是炎性眼表疾病或眼内眼疾、感染性眼表疾病或眼内眼疾、和/或免疫性眼表疾病或眼内眼疾。在任何这些方法中，所述眼部不适包括以下各项中的一种或多种：异物感、光敏感、刺痛、刺激、酸痛、干燥、烧灼、发红、瘙痒或刺痒。
35.本公开提供了一种治疗有需要的患者中的临床病状的方法，所述方法包括向所述患者给药本文所公开的眼科制剂的步骤，其中，所述临床病状是在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上的粘膜处的炎性、感染性或免疫性疾病。
36.本公开还提供了一种在有需要的患者中的粘膜上诱导免疫调节作用的方法，所述方法包括向所述患者给药本文所公开的眼科制剂的步骤，其中，所述粘膜是在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上。
37.本公开还提供了任何所述眼科制剂在制备用于治疗有需要的患者的临床病状的药剂中的用途，其中，所述临床病状是炎性眼表疾病或眼内眼疾、感染性眼表疾病或眼内眼疾、和/或免疫性眼表疾病或眼内眼疾。在各个方面，本公开提供了任何所述眼科制剂在制备用于减少、缓解或预防患有临床病状的患者中的眼部不适的药剂中的用途，其中，所述临床病状是炎性眼表疾病或眼内眼疾、感染性眼表疾病或眼内眼疾、和/或免疫性眼表疾病或眼内眼疾。在任何这些用途中，所述眼部不适包括以下各项中的一种或多种：异物感、疼痛、光敏感、刺痛、刺激、酸痛、干燥、烧灼、发红、瘙痒或刺痒。
38.本公开还提供了本文所公开的眼科制剂在制备用于治疗有需要的患者中的临床
病状的药剂中的用途，其中，所述临床病状是在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上的粘膜处的炎性、感染性和/或免疫性疾病。另外，本公开提供了本文所公开的眼科制剂在制备用于在有需要的患者中的粘膜处诱导免疫调节作用的药剂中的用途，其中，所述粘膜是在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上。
39.本公开还提供了包含本文所述的任何眼科制剂的用于治疗临床病状的组合物。在各个方面，所述组合物可以用于治疗有需要的患者中的炎性、感染性和/或免疫性眼疾。在各个方面，包含本文所述的任何眼科制剂的组合物可以用于减少、缓解或预防患有临床病状的患者中的眼部不适，其中，所述临床病状是炎性眼表疾病或眼内眼疾、感染性眼表疾病或眼内眼疾、和/或免疫性眼表疾病或眼内眼疾。在相关方面，所述眼部不适包括以下各项中的一种或多种：异物感、疼痛、光敏感、刺痛、刺激、酸痛、烧灼、干燥、发红、瘙痒或刺痒。
40.本公开提供了用于治疗有需要的患者中的临床病状的组合物，其中，所述组合物包含本文所公开的眼科制剂，其中，所述临床病状是在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上的粘膜处的炎性、感染性或免疫性疾病。另外，本公开提供了用于在有需要的患者中的粘膜处诱导免疫调节作用的组合物，其中，所述组合物包含本文所公开的眼科制剂，其中，所述粘膜是在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上。
41.根据本文的示例性方法、用途和组合物可治疗的示例性临床病状包括但不限于免疫性眼疾、代谢性眼疾、过敏性眼疾、创伤性眼疾、感染性眼疾和遗传性眼疾，诸如但不限于；眼移植物抗宿主病(ogvhd)；史蒂文
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约翰逊综合症(steven johnson syndrome)；眼瘢痕性类天疱疮(ocp)；轻度、中度和重度泪液缺乏性干眼病(ded)；睑板腺疾病；麦粒肿；眼酒渣鼻；睑缘炎；上缘角膜结膜炎(slk)；泪液充足的ded；眼睑松弛综合症；神经营养性眼疾；症状体征断开(symptom
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sign disconnect)(不一致的ded)；神经性疼痛；甲状腺眼疾(格雷夫氏眼病(grave’s ophthalmopathy))；类风湿性关节炎相关眼疾；狼疮相关眼疾；干燥综合症(sjogren’s syndrome)；继发性干燥综合症(secondary sjogren’s syndrome)；眼酒渣鼻；过敏性角膜结膜炎(春季)；病毒性角膜结膜炎(腺病毒ekc、疱疹病毒)；泰格森氏角膜炎(thygeson’s keratitis)；视网膜胶质增生(retinal gliosis)；病毒性角膜结膜炎(腺病毒ekc)；泰格森氏角膜炎(thygeson’s keratitis)；无虹膜；角膜炎或术后/伤后眼病状；边缘溃疡性角膜炎(peripheral ulcerative keratitis)；角膜炎；表层巩膜炎(episcleritis)；巩膜炎；葡萄膜炎(前或后)；视网膜炎；以及青光眼(开角型或窄角型或正常眼压型)。例如，本文的示例性方法可以用于治疗由多种情况引起的疾病，诸如：由于无菌性炎症(例如puk)引起的角膜炎，或由于病毒感染(例如腺病毒上皮下浸润、疱疹病毒树状上皮溃疡)、细菌感染(例如葡萄球菌、假单胞菌)或真菌感染(例如念珠菌、棘阿米巴)引起的角膜炎。另外，本文的示例性方法可以用于治疗术后/创伤后眼病状或与以下各项有关的眼病状：眼表后重建手术；对眼表的抗代谢物应用；翼状胬肉手术；青光眼手术；白内障手术；屈光手术(lasik、lasek或prk)；人工角膜手术；玻璃体视网膜手术；或者辐射或化学(碱性或酸性)或创伤性损伤。
42.在各个方面，所述患者具有存在于生物学样本中的自身抗体。在相关方面，存在于所述生物学样本中的自身抗体是抗瓜氨酸化的蛋白抗体。在某些方面，所述生物学样本是
眼液。在各个方面，所述眼液是泪液、洗眼液、前房水或后玻璃体液。
43.本公开提供了用于治疗眼疾的方法，所述方法包括以下步骤：向需要这种治疗的患者给药治疗有效量的治疗量的同种异体或自体igg眼科制剂。本公开还提供了治疗量的同种异体或自体igg眼科制剂在制备用于治疗需要这种治疗的患者中的眼疾的药剂中的用途。另外，本公开提供了用于治疗需要这种治疗的患者的眼疾的组合物，所述组合物包含治疗有效量的治疗量的同种异体或自体igg眼科制剂。
44.在任何所公开的方法、用途或组合物中，所述眼科制剂以滴眼制剂、局部液体、凝胶制剂、乳液制剂、悬浮液制剂、药膏制剂或可注射制剂的形式给药。眼科制剂、药剂或组合物可以每天至少一次给药于受试者。在各种实施方式中，将igg眼科制剂每天一次、两次、三次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次给药于受试者。在实施方式中，将igg眼科制剂每一周至三周至少一次给药于受试者。在各种实施方式中，将一个或多个剂量的igg眼科制剂每周、每两周、每月或每两月给药。在各个方面，igg的浓度由5％、10％或20％的眼表免疫球蛋白(osig)溶液定义。在各种实施方式中，所给药的igg的浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的osig溶液。在又一实施方式中，将igg眼科制剂作为眼内注射剂在眼内给药。在实施方式中，将igg眼科制剂作为滴眼剂或药膏给药至眼表。
45.在某些实施方式中，使用来自人类受试者的血液制造合并的igg眼科制剂(修饰的或未修饰的)，然后以特定的浓度将其给药于相同受试者的眼表或眼内。为了使osig跨组织递送，给药结膜下或肌腱下注射，或者可以对osig制剂进行修饰(使用纳米技术，诸如聚合物/生物球体、颗粒或膜(具有或不具有表面修饰))。其他增强osig渗透的方法包括：使用渗透剂，诸如苯甲烃铵；基于电荷的策略，诸如离子电渗疗法；或者增加在眼表上的停留时间，诸如通过提高粘性或在隐形眼镜或泪点塞(punctal plugs)中的吸附。osig滴眼剂可以调配成微乳剂。通过使用不扩散通过生物膜并在水中形成三维网络的高分子量亲水性聚合物来提高粘度，可以增加与角膜接触的时间和osig滴眼剂的生物利用度。这类聚合物的实例包括聚乙烯醇、泊洛沙姆、透明质酸、卡波姆、卡波普和多糖，即纤维素衍生物、结冷胶和黄原胶。通过使用螯合剂、防腐剂(如苯扎氯铵)、表面活性剂和胆汁酸盐来改变角膜上皮结构的连续性或通过使用环糊精络合物，可以提高osig滴眼剂的角膜和眼内渗透性。对于眼内递送或向角膜、结膜下或泪腺的递送，使用osig的聚合物、固体、多室药物递送系统。
46.纳米颗粒是聚合物载体，由经常具有粘膜粘附性质的可生物降解的、生物相容的、天然的或合成的聚合物建立。为了应用于眼球，在其开发中所使用的成分有：聚(烷基氰基丙烯酸酯)、聚乳酸、聚(ε
‑
己内酯)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)、壳聚糖、明胶、海藻酸钠和白蛋白。这些形式可以分为：纳米球；由致密的聚合物基质建立的固体、整体球(其中分散有osig)；以及由osig周围的固体或液体形式的聚合物膜建立的构成储库的纳米胶囊。脂质体还用于跨眼部组织递送osig。脂质体是磷脂药物载体，通常由磷脂酰胆碱、硬脂胺和各种量的胆固醇或卵磷脂和α
‑
l
‑
二棕榈酰基
‑
磷脂酰胆碱建立。囊泡(niosomes)、discosomes和树状聚合物(dendrimers)也用于跨眼部组织递送osig。
47.在另一实施方式中，本公开提供了一种检测受试者中自身抗体的存在的方法，所述方法包括检测获自所述受试者的眼液样本中的自身抗体的水平，其中，所述受试者患有眼表病症或处于发展眼表病症的风险。在相关方面，所述方法进一步包括将获自所述受试
者的样本中的自身抗体的水平与对照自身抗体的水平进行比较的步骤。例如，所述眼液是泪液、洗眼液、前房房水或后房玻璃体液。
48.本公开还提供了对受试者中的眼表病症进行诊断、确定发展风险或监测的方法，所述方法包括：检测获自所述受试者的样本中的自身抗体的水平；以及比较获自所述受试者的样本中的抗体的水平与所述自身抗体的对照水平，其中，所述自身抗体的对照水平用于对所述受试者中的眼表病症进行诊断、确定发展风险或监测。在相关方面，所述自身抗体是天然自身抗体、抗carp自身抗体或acpa抗体。在各个方面，所述自身抗体包括多种自身抗体。在相关方面，检测所述自身抗体的抗原包括瓜氨酸化蛋白、瓜氨酸化肽序列或它们的组合。在相关方面，检测所述自身抗体的抗原包括氨甲酰化蛋白、氨甲酰化肽序列或它们的组合。
49.在任何所公开的方法中，所述样本是眼液，其中，眼液是泪液、洗眼液、前房房水或后房玻璃体液。
50.在任何所公开的方法中，通过酶法、光谱法、色谱法、免疫学方法或它们的组合来检测自身抗体的水平。在示例性实施方式中，一种方法可以包括在患有、疑似患有或易患眼表病症的受试者中确定所述眼表病症的进展或确定治疗功效的步骤。在任何所公开的方法中，所述自身抗体的对照水平包括：在治疗开始之前所述受试者中的所述自身抗体的水平；在治疗的较早阶段所述受试者中的所述自身抗体的水平；或它们的组合。
51.本公开还提供了一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括用于检测自身抗体的抗原板阵列，所述自身抗体包括瓜氨酸化蛋白、瓜氨酸化肽序列或它们的组合。所述诊断试剂盒可以用于实施本文所述的任何方法。
52.在示例性实施方式中，可以将fc受体阻滞组合物调配用于眼部应用。例如，所述fc受体阻滞组合物可以进一步由fc受体阻滞眼肽浓度以及任选地合适的载体来定义。在另一实施方式中，所述fc受体阻滞组合物可以进一步由fc受体阻滞眼抗体浓度以及任选地合适的载体来定义。另外，所述fc阻滞组合物可以用于治疗粘膜处的炎性、感染性或免疫性疾病，或者在粘膜处表现出免疫调节作用。所述fc阻滞组合物可以治疗炎性、感染性或免疫性疾病，或者在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上的粘膜处具有免疫调节作用。
53.本公开还提供了一种浓缩的眼部或粘膜部igg组合物。根据本文的原理，提出了一种浓缩的眼igg组合物。所述组合物可以进一步包含抗炎剂。
54.本公开还提供了一种用于治疗眼免疫疾病的治疗剂量，其中，所述眼免疫疾病由从治疗部位去除的眼液确定的抗瓜氨酸化蛋白自身抗体的水平来指示，并且所述治疗剂量可以使用浓缩的眼igg组合物来调配。在某些实施方式中，可以基于从受试者中去除的泪液来确定所述治疗剂量，其中，所述受试者患有免疫疾病，诸如干眼病。在某些实施方式中，一种治疗剂量可以包括由浓缩的眼igg组合物进一步定义的组合物，其浓度为减少acpa抗体的浓缩量和/或经由在治疗部位处施用而产生的作用。例如，所述治疗剂量可以包括的浓缩的眼igg组合物的范围为按重量计约0.01mg/ml至按重量计约1g/ml。
55.在一些实施方式中，一种诊断试剂盒包括：测试装置，所述测试装置用于确定眼液(诸如泪液)中的抗瓜氨酸化蛋白自身抗体的浓度；以及配量装置，所述配量装置用于指示足以治疗和/或减少所述眼液中的所述抗瓜氨酸化蛋白自身抗体的浓度的损害作用的治疗
剂量和方案。在相关方面，所述眼液是泪液、洗眼液、前房水或后玻璃体液。
56.在示例性实施方式中，一种制备用于在从治疗部位去除的眼液中检测到的免疫损伤的治疗剂量的方法，所述方法包括：提供一定浓度的igg，所述一定浓度的igg被配置成当给药于所述治疗部位时降低抗瓜氨酸化蛋白自身抗体的水平和/或作用；以及将载体加入到所述一定浓度的igg中，从而形成被配置成能够将所述igg递送至所述治疗部位的治疗剂量。
57.在另一示例性实施方式中，一种制备治疗剂量的方法可以包括提供在范围为约0.01％至约20％的眼表免疫球蛋白(osig)溶液、或范围为约0.1％至约0.5％的osig溶液、或范围为约0.4％至约1％的osig溶液中的一定浓度的igg。例如，约0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的osig溶液的一定浓度的igg。在一个实施方式中，使用osig flebogamma 5％dif形成制剂以测试其对人细胞的毒性(图19)。浓度为4mg/ml的flebogamma 5％dif对人上皮细胞无毒性，并且因此是合适的示例性实施方式。osig溶液可以用任何可商购的igg或合并的血浆igg制备。根据本文的原理，使用可商购的配制品以无毒性浓度的osig溶液调配的其他实施方式也是合适的实例。在相关方面，所述方法进一步包括针对治疗期将所述治疗剂量周期性地递送至所述治疗部位的步骤，以实现改善免疫或炎性病状或直到所述测试装置指示浓度在正常范围内，所述治疗期由利用所述诊断试剂盒以每天两次和每月两次中的至少一种或任何其他合适的时间段检测到的反应定义。
58.在实施方式中，靶向b细胞的眼组合物可以包括被调配为滴眼剂的合适的b细胞组合物(诸如利妥昔单抗)或其他合适的递送方法以治疗眼疾或其他粘膜疾病。例如，靶向b细胞的眼组合物在诸如口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上的粘膜处具有免疫调节作用。
59.除了将本文所述的组合物应用于眼部外，这些igg组合物还可以应用于其他部位中的粘膜，例如在口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔中或在皮肤上。所述igg组合物可以用于治疗在这些粘膜部位处的炎性和/或免疫性疾病。具体而言，可以将所述igg组合物调配用于递送至各种部位(诸如眼部、口腔、鼻腔、膀胱、气管支气管通道、耳道和耳腔、滑膜(关节)腔、阴道腔)中或皮肤上的粘膜，以治疗在这些粘膜部位处的炎性和/或免疫性疾病。
60.在又一示例性实施方式中，靶向b细胞的治疗剂(利妥昔单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、阿塞西普、他贝芦单抗)可以形成用于治疗免疫性眼疾、代谢性眼疾、过敏性眼疾、创伤性眼疾、感染性眼疾和遗传性眼疾的组合物，诸如但不限于眼移植物抗宿主病(ogvhd)；史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnson syndrome)；眼瘢痕性类天疱疮(ocp)；轻度、中度和重度泪液缺乏性干眼病(ded)；睑板腺疾病；上缘角膜结膜炎(slk)；泪液充足的ded；眼睑松弛综合症；神经营养性眼疾；症状体征断开(symptom
‑
sign disconnect)(不一致的ded)；神经性疼痛；甲状腺眼疾(格雷夫氏眼病(grave’s ophthalmopathy))；类风湿性关节炎相关眼疾；狼疮相关眼疾；干燥综合症(sjogren’s syndrome)；继发性干燥综合症(secondary sjogren’s syndrome)；眼酒渣鼻；过敏性角膜结膜炎(春季)；病毒性角膜结膜炎(腺病毒ekc)；泰格森氏角膜炎(thygeson’s keratitis)；视网膜胶质增生(retinal gliosis)；无
虹膜；角膜炎或术后/伤后眼病状；边缘溃疡性角膜炎(peripheral ulcerative keratitis)；角膜炎；表层巩膜炎(episcleritis)；巩膜炎；葡萄膜炎；视网膜炎；以及青光眼。例如，利妥昔单抗可以被调配为滴眼剂或其他合适的递送方法以治疗眼疾。
附图说明
61.图1是显示健康受试者的眼表清洗剂中acpa的存在数据的箱线图。
62.图2是显示患有几种眼表疾病的患者的眼表清洗剂中acpa自身抗体的存在数据的箱线图。
63.图3是显示眼表清洗剂中所有acpa阳性的患有特定眼表疾病的患者的百分比的图。
64.图4是显示在开始治疗之前和之后干燥综合症患者的泪液中的acpa水平的数据的箱线图。
65.图5是显示在开始治疗之前和之后眼gvhd患者的泪液中的acpa水平的数据的箱线图。
66.图6是来自眼表的印迹细胞学标本的免疫荧光染色照片，其显示了在干燥综合症患者的非上皮细胞中存在瓜氨酸化蛋白。干燥综合症
‑
cit/k14或cit/ne
→
n＝5；健康
–
cit/k14
→
n＝2。
67.图7是来自眼表的印迹细胞学标本的免疫荧光染色的照片，显示了干燥综合症患者中的嗜中性粒细胞中存在瓜氨酸化蛋白。cit/ne
→
n＝2。
68.图8是来自眼表的印迹细胞学标本的免疫荧光染色的照片，显示了眼gvhd(ogvhd)患者中的上皮细胞中存在瓜氨酸化蛋白。def.ogvhd,cit/k14
→
n＝4；无ogvhd,cit/k14
→
n＝2。
69.图9是眼表粘液膜的免疫荧光染色的照片，显示了在嗜中性粒细胞上存在可诱导的fc
‑
γ受体。分离的嗜中性粒细胞n＝1；pt粘液n＝2
70.图10是来自眼表的印迹细胞学标本的免疫荧光染色的照片，显示了在非上皮细胞(嗜中性粒细胞和单核细胞)上存在fc
‑
γ受体。fcr ne:n＝5个不同的个体，4种不同的疾病。
71.图11是斑点印迹分析的照片，以及显示泪液中的acpa对net
‑
瓜氨酸化蛋白具有反应性的图。
72.图12是斑点印迹分析的照片，以及显示acpa阳性泪液显示自身抗体多克隆性的图。
73.图13是眼表粘液膜的免疫荧光染色的照片，显示了患者的粘液细胞聚集体上存在瓜氨酸化蛋白h4r3cit。
74.图14是小鼠角膜的照片，显示了用荧光素染色的眼表染色以显示角膜上皮疾病。数据显示acpa抗体可引起角膜上皮疾病，但并非所有acpa抗体均可如此。
75.图15是来自小鼠角膜眼表的印迹细胞学标本的免疫荧光染色的照片，显示了acpa抗体#1引起netosis并诱导小鼠角膜上皮的瓜氨酸化。
76.图16是小鼠角膜的照片，显示了用荧光素染色的眼表染色以显示角膜上皮疾病。数据显示，acpa诱导的对角膜的病理作用是经由fc受体介导的。小鼠igg与acpa抗体竞争与
fc受体的结合，并且fc受体阻滞剂可阻滞所有fc受体。这种竞争性和肽阻滞作用可能会使acpa对角膜的病理作用消失，这表明使用防止acpa抗体与fc受体相互作用的方法，可能是治疗瓜氨酸化相关眼疾的潜在治疗策略。
77.图17是嗜中性粒细胞的免疫荧光染色的照片，显示了acpa
‑
h4r3cit在体外诱导netosis。
78.图18是显示osig对人角膜上皮细胞的细胞毒性的数据。1mg/ml至4mg/ml的osig浓度不会引起细胞毒性，如通过ldh水平未升高所证明的。
79.图19提供了在泪液和严重的眼表疾病中具有高自身抗体(acpa)的眼睛的示例性图像。
80.图20a和20b提供了在泪液中具有高自身抗体(acpa)但没有系统性自身免疫疾病并且acpa自身抗体和类风湿关节炎的血清阴性的眼睛的示例性图像。
81.图21a和21b提供了具有不对称眼疾的眼睛的示例性图像；眼表疾病较严重的眼睛的泪液中的自身抗体(acpa)水平较高。
82.图22a和22b提供了来自56岁女性的图像，该女性因眼移植物抗宿主病而患有严重的泪液缺乏症和严重的眼表疾病(案例研究1)。这些图像证明，osig治疗减轻了严重干眼病体征和症状，并降低了泪液中炎性生物标志物的水平。
83.图23提供了来自31岁女性的图像，其眼移植物抗宿主病而患有严重的泪液缺乏症和严重的眼表疾病(案例编号2)。这些图像证明，osig治疗减轻了神经营养性角膜炎的症状。
84.图24提供了来自74岁男性的图像，其因早前在左眼进行过lasik眼科手术历史而患有神经营养性角膜炎(案例研究3)。这些图像证明，osig治疗减轻了严重干眼病的体征和症状，并降低了泪液中炎性生物标志物的水平。
85.图25提供了来自29岁男性的图像，其因史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnsons syndrome)而患有泪液缺乏症和严重的眼表疾病(案例研究6)。这些图像证明，osig治疗减轻了史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnson syndrome)引起的严重干眼病的体征和症状。
具体实施方式
86.根据本文的原理，发现患有以下疾病的患者的泪液中存在自身抗体(诸如抗瓜氨酸化蛋白抗体(acpa))：眼疾，诸如干眼病(ded)、干燥综合症(sjogren’s syndrome)、睑板腺疾病、上缘角膜结膜炎(slk)、眼瘢痕性类天疱疮、史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnson syndrome)、眼移植物抗宿主病、边缘溃疡性角膜炎(peripheral ulcerative keratitis)、表层巩膜炎(episcleritis)、巩膜炎；以及这类自身免疫性疾病。出人意料的是，即使在血清中未检测到acpa和类风湿因子，患者的泪液中仍存在acpa自身抗体，这表明泪液自身抗体是在眼组织内/周围产生的。这一结果出人意料，因为人们并未预料到眼疾患者的泪液中会存在acpa自身抗体，因为他们的血清中没有acpa或类风湿因子，并且他们没有证据表明有系统性自身免疫性疾病。疾病较为严重的单方面疾病患者的泪液中的acpa水平较高。此外，泪液中acpa水平非常高的眼睛经常有证据表明有严重疾病(诸如角膜融化和疤痕)，并且尽管进行了积极的治疗，但控制不力。在本文所述的研究中，标识了这些患者眼
表的瓜氨酸化蛋白以及fc受体的存在。实验室实验证实，将小鼠角膜暴露于acpa会引起眼表疾病，并且通过使用igg或fc受体阻滞剂来靶向acpa与眼组织的相互作用降低了acpa对眼表疾病的有害影响。总之，合并的igg和/或其合成的变体是用于由自身抗体引起或受自身抗体影响的眼疾的治疗剂的合适形式。另外，在泪液中标识自身抗体的多克隆性(例如，泪液中存在cit组蛋白、citα
‑
烯醇酶，cit纤维蛋白原等)，这使得合并的igg成为有吸引力的治疗剂，因为靶向单独抗体缺乏吸引力并且费力。
87.如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有清楚指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包含复数指示物。
88.在示例性实施方式中，一种眼科制剂包含：(a)能够减少眼表或眼内的自身抗体的量的药学活性化合物，这类自身抗体是响应于瓜氨酸化蛋白而产生的(由于蛋白质的瓜氨酸化而产生的acpa自身抗体)，或者是响应于高瓜氨酸化蛋白(homocitrullinated
‑
protein)而产生的自身抗体(由于蛋白质的氨甲酰化而产生的抗carp抗体)，或者是响应于天然蛋白产生的天然自身抗体；(b)任选的第二药学活性化合物，所述第二药学活性化合物选自由以下各项组成的组：pad酶抑制剂、nets分解剂(dismantling agent)和fc受体阻滞剂、以及它们的组合；以及(c)药学上可接受的眼科赋形剂。除非上下文另有要求，否则术语“药学活性化合物”是指当局部应用于眼表或注入眼内时具有药学活性的化合物。因此，例如，术语“药学活性nsaid”是指当局部应用于眼表或注入眼内时具有药学活性的nsaid。
89.本公开的又一方面提供了一种眼科制剂，所述眼科制剂包含：(a)药学上可接受的眼科赋形剂；(b)治疗有效量的包含免疫球蛋白g(igg)的药学活性化合物；以及(c)任选的选自由以下各项组成的组的第二药学活性化合物：类固醇、抗炎剂、粘液溶解剂、pad酶抑制剂、nets分解剂(dismantling agent)和fc受体阻滞剂以及它们的组合以及它们的组合。包含免疫球蛋白g(igg)的药学活性化合物能够治疗选自由可引起以下症状的炎性和免疫性眼表疾病组成的组的临床病状：眼不适、干眼综合症、角膜炎、睑球粘连形成(symblepheron formation)、穹窿透视缩短(fornix foreshortening)、睑缘/结膜角质化和结膜下纤维化。“治疗有效量”是指当给药于哺乳动物以治疗疾病或临床病状时足以实现对疾病进行这种治疗的化合物的量。“治疗有效量”将取决于化合物、疾病或临床病状及其严重性以及所治疗的哺乳动物的年龄、体重等而变化。对临床病状或疾病的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防临床病状或疾病，即，使该病状或疾病的临床症状在可能易患临床病状或疾病但尚未经历或表现出临床病状或疾病的症状的哺乳动物中不发展；(2)抑制临床病状或疾病，即，阻止或减少临床病状或疾病或其症状的发展；或(3)减轻临床病状或疾病，即，使临床病状或疾病或其症状消退。
90.本公开的另一方面提供了一种眼科制剂，所述眼科制剂包含：(a)药学上可接受的眼科赋形剂；(b)治疗有效量的药学活性化合物，所述药学活性化合物包含合并的人免疫球蛋白g(igg)；和/或(c)治疗有效量的合并的人血浆蛋白(稀释度范围为人血浆蛋白的0.1％至99％)和合并的人血脂(稀释度范围为0.1％至99％)。
91.本公开的眼科制剂可用于治疗与炎性和免疫性眼表疾病有关的各种临床病状。可以通过本公开的眼科制剂治疗的示例性临床病状包括但不限于可引起以下症状的眼表疾病：眼不适、干眼综合症、泪液膜中的粘液细胞聚集体/碎屑、睑球粘连形成(symblepheron formation)、穹窿透视缩短(fornix foreshortening)、睑缘/结膜角质化和结膜下纤维化。
眼表疾病的更具体的类型包括：眼移植物抗宿主病(ogvhd)；史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnson syndrome)；眼瘢痕性类天疱疮(ocp)；轻度、中度和重度泪液缺乏性干眼病(ded)；睑板腺疾病；上缘角膜结膜炎(slk)；泪液充足的ded；眼睑松弛综合症；神经营养性眼疾；症状体征断开(symptom
‑
sign disconnect)(不一致的ded)；神经性疼痛；甲状腺眼疾(格雷夫氏眼病(grave’s ophthalmopathy))；类风湿性关节炎相关眼疾；狼疮相关眼疾；干燥综合症(sjogren’ssyndrome)；继发性干燥综合症(secondary sjogren’s syndrome)；眼酒渣鼻；过敏性角膜结膜炎(春季)；无虹膜；因无菌炎症或因病毒、细菌或真菌感染引起的角膜炎；术后/伤后眼病状；边缘溃疡性角膜炎(peripheral ulcerative keratitis)；表层巩膜炎(episcleritis)；巩膜炎；葡萄膜炎；以及青光眼。可以使用本公开的眼科制剂治疗的示例性术后/伤后眼病状包括但不限于与以下各项有关的眼病状：眼表后重建手术；对眼表的抗代谢物应用；翼状胬肉手术；青光眼手术；白内障手术；激光视力矫正手术(lasik、lasek、epi
‑
lasik)；人工角膜手术；以及辐射损伤。
92.可以使用本公开的眼科制剂治疗的其他眼科临床病状包括但不限于：干眼综合症(干燥性角膜结膜炎)；干燥综合症(sjogren’s syndrome)；先天性泪缺乏；干眼病(因缺乏维生素a导致的干眼症)；角膜软化；甲状腺眼疾；眼酒渣鼻；眼睑病症；睑板腺疾病；睑板腺功能障碍；睑外翻；睑缘炎；眼睑皮肤松弛症；结节病；麦粒肿；睑腺炎；睑板腺囊肿；眼睑下垂症；翼状胬肉；眼睑浮肿；眼睑皮肤炎；倒睫症；睫毛脱落；泪腺炎；史蒂文
·
约翰逊综合症(stevens
‑
johnson syndrome)；眼移植物抗宿主病；泪囊炎；结膜炎；角膜结膜炎；睑结膜炎；睑角膜结膜炎(blepharokeratoconjunctivitis)；过敏性结膜炎；春季结膜炎；结膜充血(conjunctival suffusion)；结膜松弛症(conjunctivochalasis)；结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)；翼状胬肉；结膜黄斑；结膜水肿；虹膜炎；虹膜睫状体炎；前葡萄膜炎；青光眼；红眼；角膜炎；巩膜炎；巩膜外层炎；边缘溃疡性角膜炎(peripheral ulcerative keratitis)；神经营养性角膜炎；神经营养性眼疾；角膜溃疡；溃疡性角膜炎；角膜擦伤；光性角膜炎(photokeratitis)；紫外线性角膜炎(ultraviolet keratitis)；暴露性角膜炎；浅层点状角膜炎(superficial punctuate keratitis)；泰格森氏浅层点状角膜病(thygeson’s superficial punctuate keratopathy)；单纯疱疹病毒性角膜炎；带状疱疹性角膜炎；酒糟鼻；眼部手术后的术后炎症(即，眼睑手术、白内障手术、角膜手术、屈光手术(包括光性屈光性角膜切削术)、青光眼手术、泪腺手术、结膜手术、眼部肌肉手术)；由化学灼伤、热灼伤或物理创伤引起的眼表病状；由以下自身免疫或血管病症引起的眼部病状：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、莱特尔氏综合症(reiter’s syndrome)、肠源性关节炎(enteropathic arthritis)、银屑病性关节炎(psoriatic arthritis)、盘状和系统性红斑狼疮、多发性硬化症、格雷夫氏病(graves’disease)、抗磷脂综合症、结节病、韦格纳氏肉芽肿(wegner’s granulomatosis)、白塞氏综合症(behcet’s syndrome)、结节性多动脉炎、高安氏动脉炎(takayasu’s arteritis)、皮肌炎、银屑病、复发性多软骨炎、血管炎以及镰状细胞性贫血。
93.在一些实施方式中，本公开的眼科制剂用于治疗干眼综合症。干眼综合症主要分为两类：(i)泪液缺乏性干眼症(adde)，以及(ii)蒸发性干眼症(ede)。也有混合机制干眼症的情况(即，adde和ede两者)。adde主要是由于泪液分泌失败而引起的。adde可以进一步细分为干燥综合症(sjogren syndrome)干眼病(其中，通过自身免疫过程(例如，类风湿性关
节炎)靶向泪腺和唾液腺)和非干燥综合症(non
‑
sjogren's syndrome)干眼病(泪功能障碍，但不包括干燥综合症(sjogren's syndrome)的系统性自身免疫特征，例如，与年龄有关的干眼症)。相反，ede主要是由于在正常的泪分泌功能存在的情况下因眼表暴露导致水分过多流失而引起的。其原因可能是外在的(例如，由于某些外在的暴露、隐形眼镜磨损或维生素a缺乏引起的眼表病症)或内在的(例如，睑板腺功能障碍和眼睑孔病症)。睑板腺分泌脂质和形成眼前泪膜外层的其他成分的混合物。该脂质层起到减少泪膜蒸发的作用。睑板腺功能障碍(mgd)导致蒸发性干眼病。mgd中最广为人知的临床发现之一是，眼睑边缘存在许多毛细血管扩张型血管。mgd也可伴有泪液缺乏性干眼病，如眼移植物抗宿主疾病(ogvhd)中所见。可以使用本公开内容的组合物治疗的其他具体的干眼综合症包括：角膜结膜炎；由结膜炎引起的干眼症；由过敏性结膜炎引起的干眼症；由睑缘炎引起的干眼症；由角膜炎引起的干眼症；由泪腺炎引起的干眼症；由眼酒渣鼻引起的干眼症；由勃姆综合症(boehm syndrome)引起的干眼症；由结膜松弛症(conjunctivochalasis)引起的干眼症；由睑结膜炎引起的干眼症；由睑角膜结膜炎(blepharokeratoconjunctivitis)引起的干眼症；由浅层点状角膜炎(superficial punctuate keratitis)引起的干眼症；由泰格森氏浅层点状角膜病(thygeson’s superficial punctuate keratopathy)引起的干眼症；由ogvhd引起的干眼症；干眼综合症(sjogren’s dry eye syndrome)；由史蒂文
·
约翰逊综合症(stevens
‑
johnson syndrome)引起的干眼症；mgd；由睑板腺疾病引起的干眼症；维生素a缺乏引起的干眼症；药理作用(即，激素替代治疗剂、血压药物(blood pressure medication)、抗组胺剂、抗抑郁剂、抗胆碱能药物、青光眼药物、降压药、利尿剂、镇静剂、异维甲酸、鼻减充血剂(nasal decongestants)、口服避孕药、β阻滞剂、吩噻嗪类、阿托品、疼痛缓解鸦片)引起的干眼症；妊娠引起的干眼症；lasik手术或屈光手术引起的干眼症；由胶原血管病(即，系统性红斑狼疮、韦格纳氏肉芽肿病(wegener’s granulomatosis)、类风湿性关节炎、复发性多软骨炎(relapsing polychondritis))引起的干眼症；由肿瘤或结节病引起的泪腺浸润引起的干眼症；由泪腺放射后纤维化引起的干眼症；由泪腺、睑板腺或杯状细胞消融引起的干眼症；由感觉性去神经支配(sensory denervation)引起的干眼症；由热烧灼或化学烧灼引起的干眼症；由潜在的糖尿病病状引起的干眼症；由病毒、真菌或细菌感染引起的干眼症；由长时间佩戴隐形眼镜引起的干眼症；由眼睑病症或眼睑损伤(即，眼凸出、睑下垂)引起的干眼症；由角膜营养不良引起的干眼症；由自身免疫病症引起的干眼症；因年龄引起的干眼症；以及它们的组合。
94.在一些特定的实施方式中，本公开的眼科制剂用于治疗睑板腺功能障碍(mgd)。在其他实施方式中，本公开的眼科制剂用于治疗泪液缺乏性干眼症(adde)。在一些情况下，用于治疗adde的方法包括治疗需要治疗舍格伦干眼综合症、眼移植物抗宿主疾病(ogvhd)或非舍格伦干眼综合症的患者。在其他实施方式中，用于治疗干眼综合症的方法包括治疗需要治疗蒸发性干眼症(ede)的患者。仍然在其他实施方式中，本公开的方法包括治疗需要治疗由adde和ede组成的混合机制干眼症的患者。仍然在其他实施方式中，本公开的方法包括治疗由于屈光眼手术的并发症或由于以下一种或多种原因而引起的干眼症的患者：维生素a缺乏症、眼表疾病、过敏、衰老、佩戴隐形眼镜、药物使用或眼睑疾病。
95.翻译后修饰(ptm)的两种形式(瓜氨酸化和氨基甲酰化)分别在多肽中产生两个化学上高度相关的非标准氨基酸——瓜氨酸和高瓜氨酸。越来越多的证据表明蛋白质瓜氨酸
化和氨基甲酰化具有病理生理作用，诸如类风湿性关节炎中针对这些蛋白质的自身抗体的作用。然而，瓜氨酸化和氨基甲酰化以及acpa在眼表疾病中的作用以前没有被描述过。本文提供的研究标识了眼表液中acpa的存在。
96.在一些实施方式中，眼科制剂包含免疫球蛋白g(igg)作为药学活性成分。可以在本公开的眼科制剂中使用的igg的类型包括但不限于：(i)血清/血浆来源的合并的免疫球蛋白g(osig)；(ii)从自体血浆/血清中纯化的自体igg；(iii)多聚化的igg1 fc分子(igg1 fc六聚体)；(iv)igg2a fc多聚体(斯塔都聚体))；(v)多价fc结构；(vi)糖工程化的唾液酸化igg；以及(vii)igg
‑
fc糖基化或它们的组合。在一些实施方式中，将可商购的osig制剂与眼科赋形剂(根据需要稀释或浓缩)一起调配，以使igg浓度达到应用部位(生理或病理)正常存在的igg浓度的三至六倍，然后以滴眼剂、注射剂或其他适当的递送方法分配。可商购的igg溶液的实例包括“bivigam 10％、cuvitru(20％)、flebogamma dif 5％&10％、gammagard liquid 10％、gammagard s/d 5％&10％、gammaked 10％、gammaplex 5％&10％、gamunex
–
c 10％、hizentra 20％、hyqvia 10％、octagam 5％&10％、privigen 10％”。这些可商购的igg溶液可以与眼科赋形剂混合至所需的igg浓度(例如4mg/ml)以及所需的至少为6.0的ph，以制备所公开的osig组合物。
97.在一些实施方式中，眼科制剂由完整igg抗体的功能等价物组成，诸如其中一个或多个抗体结构域被截短或不存在的抗原结合片段(例如，fv、fab、fab'或f(ab)2片段)，以及基因工程抗体或其蛋白结合片段，包括单链抗体或可以与多于一个的表位结合的抗体(例如，双特异性抗体)或可以与一种或多种不同抗原结合的抗体(例如，双特异性抗体或多特异性抗体)，也可用于本公开中。
98.免疫球蛋白是一组紧密相关的糖蛋白，由82％
–
96％的蛋白质和4％
–
18％的碳水化合物组成。这些约150kda的糖蛋白以7至12g/l的平均浓度存在于血浆中，具体取决于个体变异和暴露于抗原的环境水平。免疫球蛋白g(igg)是人体液免疫反应的主要效应分子，约占健康个体血浆中总ig的75％。基本的ig分子具有四链结构，其包含通过链间二硫键连接在一起的两条相同的重(h)链和两条相同的轻(l)链。igg具有双重功能，其特征在于能够识别抗原并与之特异性反应并执行一系列非特异性效应子功能，从而使抗原无害并最终被消除。igg的这种功能二分法反映在分子的结构中，该分子结构包含两个负责抗原结合的可变区(fab)和介导特定效应子功能的恒定区(fc或可结晶片段)。复杂寡糖结构的存在可调节igg的功能，尤其是补体的激活和与fcγr的结合。在一些实施方式中，本公开的眼科制剂将由具有增强的唾液酸化作用的免疫球蛋白g(igg)(唾液酸化igg)组成，这种唾液酸化是使用标准化学方法实现的。
99.在一些实施方式中，本公开的眼科制剂中igg的浓度由10％眼表免疫球蛋白(osig)溶液或任何其他合适的浓度定义。osig是从大量健康供体的血清/血浆中获得的合并的正常多特异性人igg的治疗配制品。该配制品包含针对微生物抗原、自身抗原的抗体(天然自身抗体)和识别其他抗体的抗独特型抗体。osig生产中使用的血浆有两个来源：大约20％来自血液供体，而另外80％来自血浆供体。合并各个血浆；合并大小至少为1000个供体，但最多可以为100,000个供体。成千上万的供体贡献了用于分离免疫球蛋白的典型血浆库，代表了针对感染因子(诸如细菌、病毒)的大量抗体特异性，以及反映供体群体对环境的累积暴露的大量自身抗原。osig的配制品由完整的igg分子组成，其igg亚类(igg1、igg2、
igg3和igg4)的分布与正常血清相对应。用于osig生产的主要纯化工艺可以包括：(i)分离，例如聚乙二醇(peg)是一种合成聚合物，其也可以用于通过排除机制从天然混合物(如血浆)中通过分级沉淀来分离蛋白质；以及(ii)色谱法，例如阴离子交换色谱法、疏水性电荷诱导色谱法或尺寸排阻色谱法。可能有助于本公开的眼科制剂的功效的osig的生物学作用包括：(i)fc受体的功能性阻滞。由于fc介导的生物学作用，osig使fc受体饱和导致细胞破坏减少，(ii)自身抗体抵销和自身抗体产生的抑制。osig配制品包含抗独特型抗体，即能够与自身抗体的可变区(抗原识别位点)特异性相互作用的抗体。这种相互作用具有抵销自身抗体并经由与自身反应性b淋巴细胞结合而阻碍其产生的潜力，(iii)补体抑制作用。osig的fc部分可以结合补体的c3b和c4b片段，从而抑制其组织沉积以及c5转化酶的产生，(iv)细胞因子(包括il
‑
1、
‑
2、
‑
3、
‑
4、
‑
5、
‑
10，tnf
‑
α和gm
‑
csf)和细胞因子拮抗剂产生(il
‑
1受体拮抗剂)的调制；以及(v)通过抑制性fc受体fcγriib发出信号。
100.在本公开的眼科制剂中，igg的量可以在约0.01mg/ml至约1g/ml的范围内，典型地在约1mg/ml至约10mg/ml的范围内。在某些实施方式中，igg的浓度或量可以为约0.01mg/ml，在其他实施方式中，igg的浓度或量可以为约0.05mg/ml。在某些实施方式中，igg的浓度或量可以为约1mg/ml，在其他实施方式中，igg的浓度或量可以为约10mg/ml。在各种实施方式中，igg的浓度或量可以为1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、8.5mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml或10mg/ml。
101.本公开内容涵盖在各种眼疾中在眼表(泪液)或眼内(水和玻璃体)自身抗体的存在，其中抗瓜氨酸化蛋白抗体(acpa)是原型实例。本公开内容可能存在和涵盖的自身抗体包括针对以下蛋白质的抗体：β2
‑
糖蛋白、c1q、cenp
‑
b(着丝粒蛋白b)、cenp
‑
a(着丝粒蛋白a)、jo
‑
1、ku、mi
‑
2、髓过氧化物酶(mpo)、pcna(增殖细胞核抗原a)、pl
‑
12(丙氨酰
‑
trna合成酶)、pm/scl 100、蛋白酶3、rnp(核糖核蛋白)、rnp/smith((rnp/sm)、核糖体p、scl
‑
70、sm、ssb/la(干燥综合症相关抗原b/la)、ssa/ro60(干燥综合症相关抗原a/ro60 kda)、ssa/ro52(干燥综合症相关抗原a/ro52 kda)。尽管未设计为穷举/完整，但本公开内容涵盖的自身抗体(acpa或非acpa)可以衍生自表1中列出的蛋白质或其片段(瓜氨酸化或天然的)：
[0102][0103]“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的眼科赋形剂”是指可用于制备本公开的药物组合物的赋形剂。这种赋形剂被本领域技术人员认为通常是安全的、无毒性的并且既没有生物活性也并非不希望有的，并且包括兽医用以及人用药物可接受的赋形剂。如说明书和权利要求书中所使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种或多种这样的赋形剂。示例性的药学上可接受的赋形剂包括：盐(诸如氯化钠)或张度剂、胶、树脂、溶剂(诸如水)、非水溶剂(诸如乙醇、油、维持ph的缓冲液、ph调节剂(例如碱，诸如氢氧化钠；和酸，诸如盐酸)、乳化剂、增稠剂、微乳液或纳米乳液形成剂、防腐剂、表面活性剂等。可用于本公开的眼科制剂中的示例性的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：水、苯甲醇、氢氧化钠、盐酸、castrol油、柠檬酸盐缓冲剂、tris缓冲剂、磷酸盐缓冲剂以及本领域技术人员已知的其他赋形剂。
[0104]
在一些实施方式中，本公开的眼科制剂还可以包含盐，诸如氯化钠。在其他实施方式中，本发明的眼用制剂还可以包含非水溶剂，诸如苯甲醇、乙醇或本领域技术人员已知的其他非水溶剂。
[0105]
仍然在其他实施方式中，将本公开的眼科制剂从约5.0的ph调节至约8.5的ph，通常从约5.0的ph调节至约8.0的ph，并且通常从约5.0的ph调节至约7.5的ph。另外的示例性ph范围为约ph 6至约ph 8、或约ph 6.2至约ph 7.2、约ph 6.4至约ph 7.4、或约ph 6.5至约ph 7.5、约ph 6.6至约ph 7.6、约ph 6.8约ph 7.8。例如，ph为约5.0、约5.1、或约5.2、或约5.3、或约5.4、或约5.5、或约5.6、或约5.7、或约5.8、或约5.9、约6.0、或约6.1、或约6.2、或约6.3、或约6.4、或约6.5、或约6.6、或约6.7、或约6.8、或约6.9、或约7.0、或约7.1、或约7.2、或约7.3、或约7.4、或约7.5、或约7.6、或约7.7、或约7.8、或约7.9、或约8.0。可以根据需要使用例如氢氧化钠和/或盐酸来调节本公开的眼科制剂的ph，以达到期望的ph水平。
[0106]
眼科制剂可以调配成滴眼剂、局部用液体、药膏、乳液、悬浮液或凝胶(例如，水凝胶中的igg钠)。眼科制剂还可以调配成油或悬浮液的纳米乳液。另外，眼科制剂可以调配成可注射制剂。
[0107]
在一些实施方式中，本公开的眼科制剂不含防腐剂，并且被调配用于单次使用或在多剂量小瓶中。如果使用防腐剂，则合适的防腐剂包括但不限于：苯甲烃铵、purite、氯丁醇、过硼酸钠、稳定的氯氧化络合物(stabilized oxychloro complex，soc)、聚季铵盐
‑
1(polyquad，pq
‑
1)、硫柳汞、苯甲醇、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰(chlorhexidine)、edta二钠、sofzia和眼科或眼科制剂化学领域的技术人员已知的其他防腐剂。
[0108]
当存在时，第二药学活性化合物选自由以下各项组成的组：类固醇、抗炎剂、粘液溶解剂及它们的组合。适用于本公开的眼科制剂的示例性类固醇包括但不限于：甲泼尼松、泼尼松、地塞米松、氯替泼诺(loteprednol etabonate)、氟轻松、二氟泼尼酯、氟米龙、甲羟松、氟轻松、利美索龙去炎松及它们的组合。当在本公开的眼科制剂中使用类固醇时，制剂中存在的类固醇的量的范围为约0.01％w/w至2％w/w；通常为约0.05％w/w至1％w/w，并且通常为约0.1％w/w至约0.3％w/w。应当理解，本公开的范围不限于类固醇量的这些特定范围。特别地，在本公开的眼科制剂中存在的类固醇的量通常取决于所使用的类固醇。例如，类固醇的存在量可以取决于所使用的特定类固醇的活性、类固醇的分子量以及在本公开的眼科制剂中使用类固醇的目的而变化。
[0109]
适用于本公开的眼科制剂的示例性抗炎剂包括但不限于：环孢素；他克莫司；白介素1受体拮抗剂(阿那白滞素)；其他nsaid，诸如酮咯酸、双氯芬酸、氟比洛芬、溴芬酸、奈帕芬酸；以及它们的组合。当在本公开的眼科制剂中使用抗炎剂时，在制剂中存在的抗炎剂的量的范围为约0.01％w/w至2％w/w；通常为约0.05％w/w至1％w/w，并且通常为约0.1％w/w至约0.3％w/w。应当理解，本公开的范围不限于抗炎剂的量的这些特定范围。特别地，在本公开的眼科制剂中存在的抗炎剂的量通常取决于所使用的特定抗炎剂，例如所使用的特定抗炎剂的活性、抗炎剂的分子量，等等。
[0110]
可用于本公开的眼科制剂中的示例性粘液溶解剂包括但不限于：n
‑
乙酰基半胱氨酸；nacystelyn；右旋糖酐；dnasei(链道酶α)；凝溶胶蛋白；胸腺素β4；14元和15元大环内酯类抗生素(例如，红霉素，红霉素的非抗微生物衍生物(例如，em703和em900)、克拉霉素、罗
红霉素、非达霉素、泰利霉素和阿奇霉素)；以及它们的组合。应当理解，当使用抗生素时，主要是因为其粘液溶解活性而使用抗生素。当粘液溶解剂用于本公开的眼科制剂中时，存在于制剂中的粘液溶解剂的量的范围为约0.01％w/w至2％w/w；通常为约0.05％w/w至1％w/w，并且通常为约0.1％w/w至约0.3％w/w。应当理解，本公开的范围不限于粘液溶解剂的量的这些特定范围。特别地，存在于本公开的眼科制剂中的粘液溶解剂的量通常取决于所使用的特定粘液溶解剂，诸如粘液溶解剂的活性、粘液溶解剂的分子量等。
[0111]
本公开的眼科制剂可以是均质的或异质的。在一些实施方式中，本公开的眼科制剂包含油或脂肪酸酯。脂肪酸酯具有本领域中通常理解的含义，是在醇和脂肪酸之间形成的酯。可用于本公开内容的制剂中的示例性脂肪酸酯包括但不限于：通常被称为植物油的甘油三酸酯；脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯；脂肪酸甲基酯；以及本领域技术人员已知的其他脂肪酸酯。应当理解，脂肪酸酯可以是几种化合物的混合物或基本上纯的化合物。通常，脂肪酸酯是植物油。可以使用的植物油的具体实例包括但不限于：蓖麻油、芝麻油、大豆油、棉籽油、橄榄油、花生油、红花油、向日葵油、棕榈油、棕榈仁油、芥花油和miglyol
[0112]
各种媒介物可以用于本公开的眼科制剂中。这些媒介物包括但不限于：纯净水(水)、聚乙烯醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、多元醇、透明质酸钠、普郎尼克、卡波普(corbopol)、环糊精、以及它们中的两种或更多种的混合物。在制剂中以所需的量使用赋形剂，以提供本文公开的活性化合物的浓度。在一个特定实施方式中，媒介物包括水。
[0113]
在本公开的一些实施方式中，使用乳液稳定聚合物。尽管无意限制本公开的范围，但是乳液稳定化聚合物通常包含亲水性基团，诸如纤维素、糖、环氧乙烷、氢氧化物、羧酸或其他聚电解质。不受任何理论的束缚，认为这些聚合物通过增加制剂的粘度以及降低界面张力来帮助稳定乳液。可以使用表面活性剂(诸如聚山梨酯80或眼科学可接受的其他表面活性剂)来稳定乳液。可用于本公开的乳液稳定聚合物的一些实例包括但不限于：卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、以及它们中的两种或更多种的混合物。
[0114]
本公开的眼科制剂可以以局部眼科领域中已知的各种包装形式包装。在一个特定的实施方式中，眼科制剂包装在无菌、无防腐剂的单次使用包装或小瓶或容器(即，单位剂量小瓶)中。每个小瓶(例如小至0.9ml)可以由低密度聚乙烯制成，以便包含少量制剂，例如单次使用为0.4ml。这样，在将眼科制剂灭菌并容纳在以滴剂形式局部使用的一次性单剂量容器中的情况下，可以将一组30小瓶、60小瓶等形式的多个小瓶包装在带盖的托盘中，例如，带有可剥铝盖的聚丙烯托盘。每个托盘的全部内容物可以原样分配，每次使用一个小瓶或包装，每次使用后立即丢弃。例如，可以使用吹填密封(bfs)技术制造塑料安瓿瓶或小瓶或容器。bfs方法可以在一个连续的操作中涉及塑料挤出、模制、无菌填充和气密密封，并且那些方法在本领域中是已知的。在另一实施方式中，将制剂包装在多剂量小瓶中，使得可以使用保持无菌完整性的专用容器/阻滞物每次以无菌方式分配材料。在又一个实施方式中，眼用制剂作为无菌产品包装在常规小瓶/容器中。
[0115]
在一些实施方式中，本公开的剂型是非均相水溶液的滴眼剂、滴眼制剂。
[0116]
在一个特定的实施方式中，将包含igg(osig)的眼科制剂配制成滴眼剂，并用于治疗炎症和免疫性眼表疾病，这些疾病可引起眼部不适、泪膜中的粘膜细胞聚集体/碎屑、睑
球粘连形成(symblepheron formation)、穹窿透视缩短(fornix foreshortening)、眼睑边缘/结膜角质化或结膜下纤维化。可以使用本公开的眼科制剂治疗的特定临床病状包括诸如以下疾病：眼移植物抗宿主病(ogvhd)；史蒂文
·
约翰逊综合症(steven johnson syndrome)；眼瘢痕性天疱疮(ocp)；轻度、中度和重度泪液缺乏性干眼病(ded)(继发于干燥综合症、非干燥综合症、特发性和其他原因)、睑板腺疾病(功能障碍或萎缩)；上缘角膜结膜炎(slk)；泪液充足的ded(一致或不一致)；眼睑松弛综合症；神经营养性眼病疾病；无虹膜；以及术后/伤后病理，例如眼表重建手术、对眼表应用抗代谢药物(丝裂霉素c、5
‑
氟尿嘧啶等)或人工角膜修复手术或放射损伤之后。
[0117]
本公开的另一方面提供了一种用于治疗需要这种治疗的对象的眼疾的方法。这样的方法通常涉及对受试者给药治疗有效量的抗凝剂的抗凝血剂量以下的亚型以治疗眼疾。在一些实施方式中，每天至少两次向所述受试者给药igg眼科制剂。仍然在其他实施方式中，每月至少两次向所述受试者给药igg眼科制剂。眼科制剂可以是水溶液、水悬浮液、凝胶等。
[0118]
本公开的另一方面提供了一种用于诊断或监测受试者的眼表疾病的方法。所述方法包括比较获自受试者的样本中的自身抗体的水平与所述自身抗体的对照水平，以诊断或监测受试者中的眼表病症。如本文中所使用的，术语“自身抗体的对照水平”是指可以与测试样本中的自身抗体水平进行比较的水平，包括：(i)没有眼表疾病的受试者的自身抗体，(ii)患有眼表疾病的受试者的自身抗体，(iii)在治疗之前，刚开始治疗之后或在出现任何眼表病症的症状之前，来自同一受试者的自身抗体水平。
[0119]
在一些实施方式中，对照水平可以是正常水平，意味着来自正常患者，即没有眼表疾病的受试者的样本中的水平。该对照水平可以更具体地称为“阴性对照”。这允许基于自身抗体的对照水平进行确定，其中与对照水平相比，待评估眼表疾病的样本的自身抗体水平具有可测量的差异或基本没有差异。
[0120]
在另一实施方式中，对照水平可以是在来自受试者或被认为患有眼表疾病的个体群体的样本中建立的自身抗体的水平。这可以更具体地称为“阳性对照水平”。如本文中所使用的，术语“阳性对照”是指在样本中建立的自身抗体表达或生物活性的水平，该样本来自受试者、来自另一个体或来自个体群体，其中，基于来自该样本的数据，该样本被认为患有疾病。
[0121]
在其他实施方式中，可以从来自待测受试者的先前样本中建立对照水平，从而可以随时间监测受试者的疾病进展或消退和/或可以评估治疗的功效。
[0122]
除非另有说明或上下文另外要求，否则术语“监测”是指确定眼表疾病的进展或确定特定治疗方案或药物的有效性。术语“诊断”是指确定受试者中是否存在眼表疾病的过程。它还可以包括确定受试者中存在哪种特定的眼表疾病。
[0123]
自身抗体可用于诊断眼表疾病以开始适当的治疗(therapy)或治疗(treatment)，例如，用igg滴眼剂或另一种适当的药物产品治疗。
[0124]
自身抗体水平的变化可用于评估对治疗的反应或疗效。也可以将治疗强度滴定至自身抗体水平。
[0125]
该方法可用于提供快速结果、办公室中测试(in
‑
office test)以诊断和管理眼表疾病，以及针对此类疾病启动/滴定igg滴眼剂治疗，既可作为单一药物，也可与其他活性药
理药物联合使用。该测试可以设计为测量泪液或其他眼液的成分。如关于图1所讨论的，迄今为止，小于5的浓度尚未被认为是显著的。然而，高于5的水平可以证明指示可治疗的病状，并且被认为在本公开的范围内。
[0126]
由于igg组合物可长时间稳定，因此治疗可以定期进行。可以将治疗设计为每天至少两次或每月至少两次，或者根据任何其他合适的治疗方案进行治疗，前提是该治疗足以降低水平或降低因眼液中自身抗体产生的有害生物作用。
[0127]
利用自身抗体的本公开的方法也可以用于诊断或监测眼表疾病，诸如ogvhd或干燥综合症(sjogren's syndrome)和其他干眼病。这样的方法通常包括测量存在于从测试对象获取的生物学样本(例如，泪液、血液/血清或眼表细胞)中的一种或多种自身抗体的水平，并与对照水平进行比较。对照水平可以是受试者先前的自身抗体水平、健康受试者的自身抗体水平或患有眼表疾病的受试者的自身抗体水平。
[0128]
本公开的另一方面提供了用于确定获自受试者的一种或多种自身抗体的水平的传感器、生物传感器、多分析物板、阵列、测定法和试剂盒。自身抗体及其使用方法可用于协助诊断以及评估眼表疾病的发作和发展。本公开还涉及自身抗体在临床筛选、预后评估、治疗评估、用于药物筛选和药物开发中的用途。
[0129]
在特定的方面，本公开提供了一种诊断或监测受试者的眼表疾病的方法，所述方法包括：从所述受试者获得生物学样本，并将所述生物学样本中一种或多种自身抗体的水平与对照水平进行比较。
[0130]
自身抗体的水平可以容易地使用本领域技术人员可用的任何常规方法确定。示例性方法包括但不限于直接或间接方法，诸如偶联或未偶联的酶促方法；电化学；光谱法(例如，诸如使用uv/vis光谱仪的分光光度法、荧光法、光度法、旋光法等)；色谱法(例如，hplc、气相色谱、mplc、lplc等)；免疫学方法(诸如elisa、dot
‑
blot分析等)。
[0131]
本公开的另一方面提供了一种诊断或监测眼表疾病或其倾向的方法。这样的方法包括比较存在于从测试对象获取的生物样本中的一种或多种自身抗体的水平，并将其与对照水平进行比较。在一个特定的实施方式中，本公开的方法用于监测在患有、疑似患有或易患眼表疾病的受试者中的治疗(例如治疗物质)的功效。
[0132]
本公开的另一方面提供了一种能够检测一个、两个、三个、四个或更多个(数百个)本公开的自身抗体的多分析物板或阵列。多分析物板能够检测多种不同的分析物。阵列能够检测多个样本中的单个分析物，或者作为多分析物阵列，能够检测样本中的许多不同分析物。根据本发明的多分析物组或多分析物阵列能够检测本文所述的一种或多种自身抗体，并且能够检测除本文具体描述的抗体外的自身抗体。检测方法可以包括基于珠子的(例如luminex平台)或phadia immunrcap。
[0133]
还提供了适于执行根据本公开的方法的诊断或监测测试试剂盒，可选地连同该试剂盒的使用说明书一起。诊断或监测试剂盒可以包括一个或多个根据本公开的生物传感器，试剂盒中可以包括单个传感器或生物传感器或者传感器和/或生物传感器的组合。诊断或监测试剂盒可以包括根据本公开的板或阵列。诊断或监测试剂盒可以包括根据本发明的测定法或测定法组合。
[0134]
还进一步提供了根据本公开内容的方法、传感器、生物传感器、多分析物板、阵列或试剂盒，以标识能够调节或治疗眼表疾病的物质的用途。能够调节或治疗眼表疾病的物
质可以是用于治疗眼表疾病的抗炎、免疫调节、免疫抑制、抗生素物质或姑息药(人工泪液、隐形眼镜或泪点塞)。
[0135]
在整个本说明书和所附权利要求书中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防疾病，即，导致该疾病的临床症状不在易患该疾病但尚未经历或未显示出该疾病的症状的受试者中发展；(2)抑制疾病，即阻止或减少疾病或其临床症状的发展；或(3)缓解疾病，即引起疾病或其临床症状消退。
[0136]
相对于阴性对照水平(例如，没有眼表疾病的受试者中的生物标志物水平)，测试生物学样本中较高水平的自身抗体表明存在眼表疾病，例如ogvhd、干燥综合症和其他干眼症。
[0137]
根据本发明的监测，确定发展风险和诊断风险的方法可用于确认眼表疾病的存在或易患眼表疾病；通过评估发病和进展来监测眼表疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。监测和诊断方法也可用于评估临床筛查、预后、治疗选择、评估治疗益处的方法，即用于药物筛选和药物开发。有效的诊断和监测方法通过建立正确的诊断，提供非常强大的“患者解决方案”，具有改善预后的潜力，可以快速确定最合适的治疗方法(从而减少不必要的有害药物副作用暴露)，从而减少“停机时间(down
‑
time)”和复发率。
[0138]
监测疗法功效的方法可用于监测现有疗法和新疗法在人类受试者和非人类动物(例如动物模型)中的疗效。可以将这些监视方法合并到新药物质和物质组合的筛选中。蛋白质生物标志物水平的调节可用作指示眼表疾病或易患眼表疾病状态的指标。自身抗体水平随时间的升高指示发病或进展，即疾病恶化，而蛋白质生物标志物水平降低表明疾病改善或缓解。眼表疾病的自身抗体的标识允许诊断程序和治疗方案的整合。
[0139]
当前，尚无方法可用于确定有效的治疗方法，并且迄今为止尚无法进行药物反应的快速评估。传统上，对于一种给定的治疗方法，许多眼表疾病疗法需要持续数周至数月的治疗试验。本公开内容的自身抗体的检测可以用于在受试者参与临床试验之前对其进行筛选。自身抗体提供了一种手段来指示治疗反应、反应失败、不良反应、药物依从性程度和达到足够的血清药物水平。自身抗体可用于警告药物不良反应，这是所有眼表疾病药物所遇到的主要问题。自身抗体可用于个性化眼表疾病治疗的开发，因为对反应的评估可用于微调剂量，减少处方药的数量，减少获得有效治疗的延迟并避免药物不良反应。因此，通过监测本公开内容的自身抗体，可以精确地定制患者护理以匹配由疾病和患者的药物基因组学特征确定的需求，因此可以使用自身抗体来滴定最佳剂量，预测阳性治疗反应，以及标识有严重副作用高风险的那些患者。
[0140]
自身抗体的测量可以通过直接或间接检测方法进行。可通过与一个或多个配体(诸如酶、结合受体或转运蛋白)、抗体、肽、适体、或寡核苷酸、或任何能够特异性结合物标志物的合成化学受体或化合物相互作用来直接或间接检测生物标志物。配体可以具有可检测的标记，诸如发光、荧光或放射性标记和/或亲和标记。
[0141]
在一个特定的实施方式中，使用以下各项来检测和测量本公开的自身抗体：基于质谱的技术；基于色谱的技术；酶检测系统(通过直接或间接测量)；或使用传感器，例如带有安培、电位、电导、阻抗、磁、光、声或热换能器的传感器系统。传感器可以结合物理、化学或生物检测系统。传感器的实例有生物传感器，即具有例如基于核酸的生物识别系统的传感器，例如寡核苷酸探针或适体，或蛋白质例如酶、结合蛋白、受体蛋白、转运蛋白蛋白质或
抗体。生物传感器可以结合用于检测生物标志物的免疫学方法、电学、热学、磁学、光学(例如全息图)或声学技术。使用这样的生物传感器，可以在生物样本中发现的预期浓度下检测目标自身抗体。本公开的方法适用于临床筛选、预后评估、监测治疗结果、标识最可能对特定治疗反应有反应的患者、进行药物筛选和开发、以及辅助鉴定药物治疗的新靶标。特定于疾病的关键自身抗体的鉴定对于诊断程序和治疗方案的整合至关重要。
[0142]
涉及检测和/或定量本公开的自身抗体的方法可以使用台式仪器进行，或者可以结合到可在非实验室环境中使用的一次性、诊断性或监测性平台上，例如在医师办公室或在病人的床边。用于执行本公开的方法的合适的传感器或生物传感器包括具有光学或声学读取器的“信用”卡。传感器或生物传感器可以配置为允许将收集到的数据以电子方式传输给医生以进行解释，因此可以构成电子医学的基础。
[0143]
为了说明和描述的目的，已经给出了本公开的前述讨论。前述内容并非旨在将本公开限制为本文公开的一种或多种形式。尽管本公开的描述已经包括对一个或多个实施方式以及某些变型和修改的描述，但是在理解本公开之后，其他变型和修改在本公开的范围内，例如，如可能在本领域技术人员的技术和知识之内。旨在获得在允许的范围内包括替代实施方式的权利，包括与所要求保护的替代、互换和/或等效结构、功能、范围或步骤，无论这种替代、互换和/或等效结构、功能、范围或步骤是否在本文公开，而无意公开致力于任何可获专利的主题。
[0144]
除以下实例外，与本公开相关的临床上显著的结果还提供于kwon等人,泪液中抗瓜氨酸化蛋白抗体的病理学后果以及合并的人类免疫球蛋白滴眼液在干眼病中的治疗潜力,《眼表面(ocul surf.)》2019年10月.(pii:s1542
‑
0124(19)30377
‑
5.doi:10.1016/j.jtos.2019.10.004)可见于https://doi.org/10.1016/j.jtos.2019.10.004中。kwon等人通过引用整体并入本文。
[0145]
实例
[0146]
实例1：健康受试者和眼表疾病中的自身抗体(acpa)的水平
[0147]
在健康受试者的眼表冲洗液中证明了自身抗体(acpa)的存在(图1)，以建立诊断受试者自身抗体acpa阳性的临界值。使用50μl人工泪液在健康受试者(无泪液不足的干眼病(ded))中进行眼表冲洗，并使用商业板(ccp3)通过elisa分析10μl回收的冲洗液的acpa水平。所有负值均视为0。平均值 3sd用于建立acpa正值的阈值。acpa，所有负数＝0的平均值为0.57并且3sd 1.2＝4.17。因此，确定的临界值为5.0。
[0148]
在患有眼表疾病的患者的眼表冲洗液中也证明了自身抗体(acpa)的存在(图2和图3)。如图2所示，在患有眼表疾病的患者的眼表冲洗液中确定了acpa的水平。这些患者正在接受适当的局部滴眼液治疗(人工泪液、(环孢素)、xiidra或类固醇)。在几种眼部自身免疫性疾病中，如干燥综合症(sjogren syndrome)、泪液缺乏性干眼病、混合机制ded、眼瘢痕类天疱疮(ocp)、史蒂文
·
约翰逊综合症和眼移植物抗宿主病(ogvhd)，泪液acpa水平为正(即，acpa>5.0)。蒸发性ded患者(诸如睑板腺功能障碍)也具有较高的acpa水平。上缘性角膜结膜炎(slk)和神经营养性角膜炎也具有较高的acpa水平。出乎意料的是，症状体征断开(不协调ded(discordant ded))的患者也具有较高的acpa水平。因此，所有这些眼部疾病，包括其他眼内自身免疫/炎性眼性青光眼，都将从osig滴眼液治疗中受益，以减少自身抗体对眼部疾病征兆和症状的贡献。图3中的数据显示了在眼表清洗液中所有acpa阳性的特定
眼病患者的百分比。
[0149]
实例2：常规治疗对acpa水平的作用不足
[0150]
进行实验以显示常规治疗对眼表清洗液中acpa含量的影响不足(图4和5)。图4显示了在开始常规治疗之前和之后，干燥综合症患者的泪液中的acpa水平。与已经接受治疗的干燥症患者的acpa水平相比，那些尚未接受治疗的患者(干燥症，前
‑
rx)的acpa水平明显更高。与健康受试者相比，开始治疗后(干燥症，后
‑
rx)水平较低，但仍显著较高。该数据表明，即使干燥症患者正在接受治疗，眼泪液中的acpa水平仍然很高，因此，有针对性地针对acpa(例如osig治疗)以减少acpa对眼表疾病的贡献的情况就变得如此。
[0151]
开始治疗前后患者ogvhd泪液中的acpa水平。尚未接受治疗的ogvhd患者(ogvhd前
‑
rx)的acpa水平显著高于开始治疗后(ogvhd后
‑
rx)的acpa水平(图5)。开始治疗后一个月后，acp水平显著高于健康受试者。该数据表明，即使ogvhd患者正在接受治疗，泪液中的acpa水平仍然很高，因此，有针对性地针对acpa(例如osig治疗)以减少acpa对眼表疾病的贡献的情况就变得如此。
[0152]
实例3：在眼表疾病患者的眼表存在瓜氨酸化蛋白
[0153]
接下来，证实了在眼表疾病患者的眼表中存在瓜氨酸化蛋白。如图6所示，瓜氨酸在干燥症的非上皮细胞中表达——印迹细胞学。该实验的目的是检查干燥患者的眼表细胞是否被瓜氨酸化。研究批准是从伊利诺伊州芝加哥大学(uic)的机构审查委员会获得的。在解释了研究的性质和可能的后果后，从所有参与者获得了知情同意。根据《健康保险携带和责任法案》(hipaa)的要求以及《赫尔辛基宣言》的宗旨进行了研究。
[0154]
将抗生素涂在患者的眼睛上，将滤纸(pall，#60298)涂在颞结膜和下眼睑上，以去除眼表上皮的浅层。将滤纸用4％低聚甲醛(pfa)固定在培养皿中20分钟，然后在1x pbs中洗涤5分钟，然后通过粘贴片连接到显微镜载玻片上。用巴氏笔在样本周围画防水层，然后用pbs
‑
t(1x pbs中的0.025％triton)渗透1小时。将滤纸用1x pbs轻轻摇动清洗5分钟，然后用2.5％驴血清(次生的宿主菌种)和1x pbs中的1％bsa的阻滞至少1小时。然后将滤纸与一抗在4℃下温育过夜。使用的一抗是小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体(1:1000；millipore，mabn328)和兔多克隆抗细胞角蛋白14抗体(1:1000；biolegend，#905301)。
[0155]
第二天，将滤纸用1x pbs洗涤3次，并轻轻摇动5分钟，然后在室温下将二抗温育1小时。使用的二抗如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
585
‑
150)和alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#711
‑
546
‑
152)。温育后，滤纸用1x pbs洗涤3次，每次5分钟，在黑暗中轻轻摇动。将载玻片干燥并用具有dapi的prolong
tm gold防褪色固定剂(invitrogen，p36931)固定。放置盖玻片并用指甲油密封。载玻片在成像前已完全干燥。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以63倍放大倍数捕获图像，并使用zeiss lsm image software进行分析。对干燥症患者进行了印迹细胞学检查，发现瓜氨酸在非上皮细胞(嗜中性粒细胞)上表达。非上皮细胞可能是嗜中性粒细胞，受到nets的支持。这些数据表明，干燥症患者的非上皮细胞被瓜氨酸化。
[0156]
实例4：健康受试者中不存在瓜氨酸化蛋白
[0157]
在干燥症中，瓜氨酸化蛋白似乎主要是嗜中性的(图6和7)。该实验的目的是验证瓜氨酸化的非上皮细胞是否为嗜中性粒细胞(图7)。如上文实例3中所述进行印迹细胞学检
查。
[0158]
使用的一抗是小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体(1:1000；millipore，mabn328)和兔单克隆抗中性粒细胞蛋白酶抗体(1:500；abcam，ab131260)。第二天，将滤纸用1x pbs洗涤3次，并轻轻摇动5分钟，然后在室温下将二抗温育1小时。使用的二抗如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
585
‑
150)和alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#711
‑
546
‑
152)。温育后，滤纸用1x pbs洗涤3次，每次5分钟，在黑暗中轻轻摇动。将载玻片干燥并用具有dapi的prolong
tm gold防褪色固定剂(invitrogen，p36931)固定。放置盖玻片并用指甲油密封。在成像前将载玻片完全干燥。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以63倍放大倍数捕获图像，并使用zeiss lsm图像软件进行分析。
[0159]
瓜氨酸阳性细胞是多叶核提示的嗜中性粒细胞。这意味着在眼表面瓜氨酸的一种主要来源是嗜中性粒细胞。瓜氨酸化的中性粒细胞蛋白可能是acpa反应的来源。这点通过斑点印迹测定法acpa阳性眼泪与瓜氨酸化的中性粒细胞蛋白发生反应而得到证实。这些数据表明嗜中性粒细胞是瓜氨酸化的来源，而瓜氨酸化的嗜中性粒细胞蛋白可能是acpa反应的来源。
[0160]
实例5：在ogvhd中，瓜氨酸化蛋白似乎主要是上皮的
[0161]
接下来证明瓜氨酸在确定的ogvhd中在上皮细胞上表达。本实验的目的是比较干燥症和明确的ogvhd患者之间瓜氨酸的表达(图8)。将抗生素涂在患者的眼睛上，将滤纸(pall，#60298)涂在颞结膜和下眼睑上，以去除眼表上皮的浅层。将滤纸在培养皿中用4％多聚甲醛(pfa)固定20分钟。然后将它们在1x pbs中洗涤5分钟，然后通过粘性标签连接到显微镜载玻片上。用巴氏笔在样本周围画防水层，然后用pbs
‑
t(1x pbs中的0.025％triton)渗透1小时。将滤纸用1x pbs轻轻摇动清洗5分钟，然后用2.5％驴血清(次生的宿主菌种)和1x pbs中的1％bsa的阻滞至少1小时。然后将滤纸与一抗在4℃下温育过夜。使用的一抗是小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体(1:1000；millipore，mabn328)和兔多克隆抗细胞角蛋白14抗体(1:1000；biolegend，#905301)。第二天，将滤纸用1x pbs洗涤3次，并轻轻摇动5分钟，然后在室温下将二抗温育1小时。使用的二抗如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
585
‑
150)和alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#711
‑
546
‑
152)。
[0162]
温育后，滤纸用1x pbs洗涤3次，每次5分钟，在黑暗中轻轻摇动。将载玻片干燥并用具有dapi的prolong
tm gold防褪色固定剂(invitrogen，p36931)固定。放置盖玻片并用指甲油密封。载玻片在成像前已完全干燥。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以63倍放大倍数捕获图像，并使用zeiss lsm image software进行分析。与嗜中性粒细胞是瓜氨酸的主要来源的干燥症不同，明确的ogvhd患者的整个上皮细胞都被瓜氨酸化，这与瓜氨酸和pad4酶的高水平相关。这些数据表明上皮细胞的强烈瓜氨酸化支持了高水平的瓜氨酸和pad4酶。在测试的患者中，两个不同的干燥症患者中没有瓜氨酸和k14的共定位，但是在ogvhd患者中有瓜氨酸和k14的共定位。此外，在两名不同的干燥症患者中观察到瓜氨酸与嗜中性粒细胞共定位。
[0163]
实例6：在嗜中性粒细胞上表达的诱导型fc受体
[0164]
无ogvhd的患者中缺少瓜氨酸化蛋白。这些发现表明，在ded患者中，自身抗体产生
的一种来源是瓜氨酸化的嗜中性粒细胞和/或眼表细胞。还证明了在眼表面上存在fc受体(igg的受体)，并且acpa抗体与fc受体相互作用以产生表面疾病。假设fc受体在幼稚的中性粒细胞中不表达但可诱导。fc受体在黏膜细胞聚集物中的嗜中性粒细胞中表达。
[0165]
该实验的目的是支持嗜中性粒细胞上可诱导的fc受体的假说。通过静脉穿刺在bd真空钠肝素管(bd biosciences，#367878)中收集外周血，并立即运送到实验室进行嗜中性粒细胞分离。根据制造商的说明，使用macsxpress磁珠(macsxpress中性粒细胞分离试剂盒，miltenyi biotech，#130
‑
104
‑
434)通过对非靶细胞进行免疫磁性消耗来分离嗜中性粒细胞。使用macsxpress红细胞清除试剂盒(miltenyi biotec，#130
‑
094
‑
183)去除残留的红细胞。将分离的嗜中性粒细胞重悬于3ml无血清的无酚红的rpmi
‑
1640培养基(gibco，#11835
‑
030)。测量细胞数后，将50,000个细胞/200μl嗜中性粒细胞装入ez单细胞漏斗(thermo scientific，#a78710003)。用100μl溶液中的4u/ml dnasei和1x buffer制备患者的粘液样，并在37℃下温育30分钟以实现单细胞悬液。将10倍稀释的粘液样样本装入ez单细胞漏斗(thermo scientific，#a78710003)。将样本通过cytospin 4(thermo scientific，kalamazoo，mi)以1000rpm的速度离心5分钟，以在限定的区域内实现单层细胞沉积(thermo scientific，#5991056)。离心后，将载玻片风干5分钟，然后用4％多聚甲醛(pfa)(electron microscopy sciences，hatfield，pa，#15710)溶液固定20分钟。用巴氏笔在样本周围画防水层，然后用pbs
‑
t(1xpbs中的0.025％triton)渗透1小时。样本用1x pbs轻轻摇动清洗5分钟，然后用2.5％驴血清(次生宿主物种)和1x pbs中的1％bsa阻滞至少1小时。然后将样本与一级抗体在4℃温育过夜。使用的第一抗体是小鼠单克隆抗cd64抗体(1:1000；santa cruz，sc
‑
1184)，小鼠单克隆抗igmκ抗体(1:2500；novus biologicals，nbp1
‑
96975)，兔单克隆抗中性粒细胞蛋白酶抗体(1:500；abcam，ab131260)和兔单克隆igg抗体(0.03ug/ml；abcam，ab172730)。
[0166]
第二天，将样本用1x pbs轻轻摇动清洗3次，每次5分钟，然后在室温下将二抗温育1小时。使用的二抗如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
585
‑
150)和alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#711
‑
546
‑
152)。温育后，将样本用1x pbs洗涤3次，每次5分钟，在黑暗中轻轻摇动。将载玻片干燥并用具有dapi的prolong
tm gold防褪色固定剂(invitrogen，p36931)固定。放置盖玻片并用指甲油密封。在成像前将载玻片完全干燥。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以63倍放大倍数捕获图像，并使用zeiss lsm image software进行分析。
[0167]
如图9所示，fc受体仅在pma刺激的嗜中性粒细胞和患者的粘液样体上表达，这表明嗜中性粒细胞已被激活。用同型对照和阴性对照确认染色为阳性。总之，幼稚的嗜中性粒细胞不表达fc受体，而活化的中性粒细胞则表达，这证实了fc受体的表达是可诱导的。
[0168]
作为另外的实验进行，以确认眼表面上fc受体阳性嗜中性粒细胞的存在。)。如上文实例3中所述进行印迹细胞学检查。使用的第一抗体是小鼠单克隆抗cd64抗体(1:1000；santa cruz，sc
‑
1184)和兔多克隆抗细胞角蛋白14抗体(1:1000；biolegend，#905301)。第二天，将滤纸用1x pbs洗涤3次，并轻轻摇动5分钟，然后在室温下将二抗温育1小时。使用的二抗如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
585
‑
150)和alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#711
‑
546
‑
152)。温育后，滤纸用1x pbs洗涤3次，每次5分钟，在黑暗中轻轻摇动。将载玻片干燥并用具有dapi的prolong
tm gold防褪色固定剂(invitrogen，p36931)固定。放置盖玻片并用指甲油密封。载玻片在成像前已完全干燥。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以63倍放大倍率捕获图像，并使用zeiss lsm image software进行分析。免疫荧光染色后，将相同的滤纸用苏木精和曙红染色。滤纸用苏木精(fisher scientific，sh26
‑
500d)染色，用酸冲洗，浸入上蓝溶液中，并用曙红(thermo scientific，waltham，ma)染色。使用立式axioscope 100显微镜(carl zeiss meditec gmbh，汉堡，德国)检查玻片，使用zeiss mrc彩色相机成像，然后使用zeiss axiovision分析。
[0169]
图10证明fc受体在与上皮细胞混合的k14阴性细胞(非上皮细胞)上表达。这些非上皮细胞中的一些具有多叶核(白框)，使人联想起嗜中性粒细胞，暗示嗜中性粒细胞，并通过h&e染色进一步证实。其他细胞是大的单核细胞，可能是t细胞。文献已证实k14阳性细胞不显示fc受体。
[0170]
此外，进行了一项实验以确定泪液中的acpa是否对net瓜氨酸化的蛋白质具有反应性。使用具有硝酸纤维素膜(公司，目录号)的bio
‑
dot微滤装置(bio
‑
rad,#170
‑
6545)进行斑点印迹测定。总体方案后附有制造商的说明。将该膜在tbs中预湿；必要时将其重新水化。将来自裂解物的1μg/100μl总蛋白施加到膜上，在真空室中通气的情况下温育一个小时，使蛋白在重力作用下穿过膜。向每个孔中加入200μl阻滞液(1％bsa
‑
tbs)，使其在重力作用下过滤，然后洗涤。加入200μl洗涤溶液(0.05％tween
‑
tbs)并抽真空，再重复一次。加入100μl 1:80稀释的患者眼泪(用1％bsa
‑
ttbs稀释)，并通过重力过滤，然后用200μlttbs清洗膜。膜与100μl结合hrp的人igg抗体(#a112p，emd)温育。将印迹与增强的化学发光supersignal west femto最大灵敏度底物(34095，thermo fisher)一起温育，并用imagequant las 4000系统(ge lifesciences inc)检测信号。斑点印迹的强度用image j软件确定。
[0171]
用钙离子载体模拟嗜中性粒细胞3小时，因为它在相同的时间段内诱导了超瓜氨酸化和rpmi，作为对照。刺激后，中性粒细胞被裂解以提取总蛋白，然后将其固定在膜上。如图11所示，泪液中的acpa被发现与net蛋白发生反应，从而证实嗜中性瓜氨酸化蛋白可能是acpa刺激的一种来源。结果表示为通过使用以下公式计算的折叠比：折叠＝瓜氨酸化蛋白的强度/野生型蛋白的强度。acpa阳性泪液对刺激的net蛋白表现出更高的反应性(92.8
±
7.85)，比未刺激的网眼蛋白质(54.1
±
5.46)更高，而acpa阴性眼泪没有表现出差异(45.0
±
3.19对49.3
±
4.79)。总之，泪液中的acpa对net蛋白具有反应性。
[0172]
进行了另一项实验以确定泪液中是否存在多克隆acpa。使用从millipore(billiton，ma)获得的直接检测测定免费卡(#ddac00010
‑
gr)进行斑点印迹测定。将2μl重组蛋白(1μg)应用于膜，并使其在室温(rt)下干燥20分钟。然后在室温下用在1x pbs(ph 7.4)中制备的10％bsa和0.05tween
‑
20阻滞膜30分钟。用冲洗缓冲液(1x pbs中的1％bsa和0.05％tween 20)冲洗膜，并用患者泪液样本(稀释度1:40，用无菌水稀释)探测膜，并在室温下温育30分钟。用冲洗缓冲液将膜洗涤三次，然后与结合了hrp的人igg抗体(#a112p，emd)在室温下温育30分钟。用冲洗缓冲液将膜洗涤三次。将印迹与增强的化学发光supersignal west femto最大灵敏度底物(34095，thermo fisher)一起温育，并用imagequant las 4000系统(ge lifesciences inc)检测信号。斑点印迹的强度用image j
软件确定。表2中所示的结果表示为使用以下公式计算的倍数比：倍数＝瓜氨酸化蛋白的强度/野生型蛋白的强度(表2)。
[0173]
如图12所示，acpa阳性泪液表明存在多克隆性，并且acpa与几种瓜氨酸化蛋白发生反应。在干燥症患者和确定的ogvhd患者as中，瓜氨酸化纤维蛋白原或烯醇化酶相对于野生型的倍数变化均大于1.5。在干燥症患者中，瓜氨酸化波形蛋白比其野生型变化大1.5倍，而在确定的ogvhd中，瓜氨酸化组蛋白h4大于野生型。两名患病患者的泪液表明，他们的泪液中有acpa的多克隆性，而神经性和健康的泪液则对acpa呈阴性。总而言之，acpa阳性泪液表现出多克隆性。( ):>1.5。
[0174]
表2：瓜氨酸化蛋白相对于野生型蛋白的倍数变化
[0175][0176]
实例7：眼表疾病中的acpa h4r3cit抗血清
[0177]
接下来，在实验模型中检查了特定的自身抗体acpa(h4r3cit抗血清)是否引起眼表疾病。具体而言，该实验研究了患者的粘膜细胞聚集体上是否存在f h4r3cit。使用无菌jeweler's镊子从患者的眼睛中收集粘液细胞聚集体(mca)，并将其转移至装有refresh optive的无菌0.2ml pcr管中，并保存在冰箱中。将新鲜的mca样本包埋在oct化合物(sakura finetek，torrance，ca，#4583)中并快速冷冻。使用低温恒温器(thermo scientific，cryostar nx50，#957130)将冷冻切片切成10μm的厚度。特定的mca是从诊断为确定的oghvd的患者中收集的。为了进行免疫染色，将载玻片风干，然后用4％pfa固定20分钟。然后将样本用0.025％triton x
‑
100(fisher scientific，#bp151
‑
100)渗透，并用新鲜制备的10％驴血清和1％牛血清白蛋白(gemini bio
‑
products，#700
‑
100p)阻滞2小时。将样本与一抗在4℃下温育过夜。使用了以下一级抗体：小鼠单克隆抗人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)(1:100；dako，#m0752)，兔多克隆抗组蛋白h4(瓜氨酸r3)抗血清(1:1000；abcam，ab81797)和兔多克隆igg(1:1000；abcam，ab37415)。将载玻片用1x pbs洗涤三次，并轻轻摇动5分钟，并与在阻滞缓冲液中稀释的二抗在室温下温育1.5小时。使用的二级抗体如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
585
‑
150)和alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#711
‑
546
‑
152)。将载玻片用1x pbs洗涤两次，用hoechst 33342(2μl/ml)(thermo scientific，#62249)复染10分钟，然后快速pbs洗涤并用一滴prolong
tm gold抗褪色试剂(invitrogen，#p36930)覆盖。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以100倍放大倍率捕获图像，并使用zeiss lsm image software进行分析。
[0178]
为了确认患者眼表中是否存在h4r3cit，从诊断为确定的ogvhd的患者中收集mca，并进行免疫荧光染色分析。免疫荧光染色的细胞显示大量具有多裂核的嗜中性粒细胞，并
通过嗜中性粒细胞弹性蛋白酶阳性染色得到证实。在本领域中已知，h4r3cit在核周围(核周围)表达，如图6所示。如图13所示，h4r3cit在h处免疫定位在眼表面，使用ogvhd患者的泪液进行的斑点印迹分析显示与h4cit有反应。图13还显示了患者粘膜细胞聚集体上存在h4r3cit，染色被确认为阳性，同种型对照显示为阴性染色。总之，患者的粘膜细胞聚集体具有h4r3cit抗原，这可能是acpa反应的来源。
[0179]
为了研究acpa抗体是否引起眼表疾病，将8
‑
10周龄的thy1
‑
yfp小鼠用于治疗实验。通过腹膜内注射氯胺酮(20mg/kg；phoenix scientific,st.joseph,mo)和赛拉嗪(6mg/kg；phoenix scientific)的组合麻醉thy1
‑
yfp小鼠(n＝5/组)。为了评估acpa的病理作用，将acpa抗体应用于小鼠角膜，并确定由该抗体诱导的角膜表面疾病的程度，并将其与非acpa抗体的应用进行比较。使用以下条件：1)非acpa抗体：抗组蛋白h4抗体(100ng/ml；cell signaling#2592，2)acpa抗体#1：抗组蛋白h4(瓜氨酸r3)(h4r3cit)抗血清(100ng/ml；abcam#ab81797)，3)acpa抗体#2：抗组蛋白h3(瓜氨酸r2 r8 r17)抗血清(100ng/ml；novus biologicals#nb100
‑
57135ss)应用于鼠角膜(10ul/角膜)的表面，并连续7天温育40分钟。由于在兔抗血清中使用了acpa抗体，因此将正常兔血清应用(100ng/ml；abcam#ab7487)用作对照。所有抗体的稀释液均在refresh optive中进行。对于荧光素染色实验，将10μl 0.2％荧光素滴注到小鼠角膜上1分钟，并用1x pbs洗涤两次。使用钴蓝色照明和阻隔黄色滤光片检测荧光素染色并用裂隙灯(haag streit，伯尔尼，瑞士)拍摄。收集每组(n＝5)的图像，并通过metamorph图像系统测量荧光素染色的强度。(metamorph，universal imaging，downington，pa)。
[0180]
将h4r3cit抗血清涂在小鼠角膜上，证明其眼表疾病显著增加，这是由角膜的荧光素染色所证明的。在几个对照中(兔血清、h3cit抗血清和野生型h4抗体)，荧光素染色显著增加(图14)。如图14所示，面板a1和a5显示，连续7天在小鼠角膜上应用非acpa抗体不会导致角膜上皮疾病，这在第7天没有荧光素染色的情况下得到了证实(2.59x106±
5.41x104)。在使用的两种acpa抗体中，只有一种导致角膜上皮疾病，第7天角膜荧光素染色显著增加证明了这一点。引起角膜上皮疾病的acpa抗体是acpa#1
‑
h4r3cit抗血清(与第0天(3.00x106±
6.05x104)相比，第7天的荧光强度为1.85x107±
3.19x106；p＝0.0006；图14.a2和a6)，然而acpa#2
‑
h3cit抗血清未引起角膜上皮疾病(与第0天(3.36x106±
3.05x105)相比，第7天的荧光强度为3.34x106±
4.90x105；p＝0.97；图14.a3和a7)。媒介物对照也未引起角膜上皮疾病，如在第7天缺乏荧光素染色所证明的(3.11x106±
3.49x105；图14.a4和a8)。总之，这些数据表明acpa抗体引起了角膜上皮疾病，但是并非所有的acpa抗体都能如此。
[0181]
表3：来自小鼠角膜的荧光素染色的荧光测量
[0182]
[0183]
还进行了一项实验以确定acpa抗体是否可以诱导netosis。将8
‑
10周龄的thy1
‑
yfp小鼠用于治疗实验。通过腹膜内注射氯胺酮(20mg/kg；phoenix scientific,st.joseph,mo)和赛拉嗪(6mg/kg；phoenix scientific)的组合麻醉thy1
‑
yfp小鼠(n＝5/组)。将小鼠分为三组：1)rpmi(gibco#11835030)处理，作为对照组，2)acpa抗体#1：h4r3cit抗血清或3)acpa抗体#2：h3cit抗血清处理。每种处理均将10μl应用于鼠角膜。对眼睛连续治疗7天。在实验结束时，使用滤纸染色来进行鼠角膜的印迹细胞学检查。在显微镜载玻片上，粘贴了粘性标签(ems，#76760)。将滤纸(millipore，#jhwp02500)切成最佳尺寸。当小鼠在麻醉下时，将一滴普罗卡因在眼球上涂抹一分钟，然后用kimwipe轻轻将其除去。将一片滤纸放在角膜上并轻轻按压30秒。然后将其轻轻提起并放在粘性水龙头上，触摸的区域朝上。除清洗步骤外，以下所有步骤均在潮湿的室内完成。用巴氏笔画防水层，滤纸用4％多聚甲醛(pfa)固定20分钟。滤纸在缓慢摇动下用1x pbs洗涤5分钟，然后用pbs
‑
t(1x pbs中的0.025％triton)渗透10分钟。将滤纸用1x pbs轻轻摇动清洗5分钟，然后用2.5％驴血清(次生的宿主菌种)和1x pbs中的1％bsa的阻滞至少1小时。然后将滤纸与一抗在4℃下温育过夜。使用的一抗是小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体(1:1000；millipore，mabn328)和兔多克隆抗组蛋白h4(瓜氨酸r3)抗血清(1:1000；abcam，ab81797)。第二天，将滤纸用1x pbs洗涤3次，并轻轻摇动5分钟，然后在室温下将二抗温育1小时。使用的二抗如下：alexa fluor 594驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immu
‑
noresearch lab，#715
‑
585
‑
150)，alexa fluor 488驴抗兔igg(1:1000；jackson immu
‑
noresearch lab，#711
‑
546
‑
152)，alexa fluor 594驴抗兔igg(1:1000；invitrogen，#a21207)和alexa fluor 488驴抗小鼠igg(1:1000；jackson immunoresearch lab，#715
‑
547
‑
003)。温育后，滤纸用1x pbs洗涤3次，每次5分钟，在黑暗中轻轻摇动。干燥载玻片，并用具有dapi的prolong
tm gold防褪色固定剂(invitogen，p36931)固定。放置盖玻片并用指甲油密封。载玻片在成像前已完全干燥。使用zeiss lsm 710共焦显微镜(leica，uic ophthalmology core设备)以63倍放大倍数捕获图像，并使用zeiss lsm图像软件进行分析。用1)rpmi，2)acpa#2
‑
h3cit抗血清或3)acpa#1
‑
h4r3cit抗血清治疗7天后，将小鼠角膜上皮在滤纸上提起，以研究其他病理作用。
[0184]
如图15所示，netosis是由acpa
‑
h4r3cit抗血清诱导的。仅在acpa#1
‑
h4r3cit抗血清治疗组中观察到嗜中性粒细胞和嗜中性粒细胞胞外陷阱(nets)的存在(图15.a1)；用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶染色证实了nets(图15.a2)。这表明h4r3cit抗血清诱导了netosis。总之，acpa#1抗体在小鼠角膜上皮细胞上引起netosis并诱导瓜氨酸化。该数据表明acpa抗体有助于瓜氨酸化的前馈循环，以进一步放大与瓜氨酸化有关的眼病。
[0185]
实例8：acpa(h4r3cit)的阻滞相互作用
‑
用fc受体阻滞策略消除了acpa
‑
h4r3cit引起的眼表疾病
[0186]
为了确定acpa对角膜的病理作用是否通过fc受体介导，将8
‑
10周龄的thy1
‑
yfp小鼠用于治疗实验。使用阻滞所有fc受体的肽，然后应用acpa抗体。使用10μl的1)无叠氮化物fc受体阻滞剂(innovex biosciences#nb355)或2)乱序肽，将其涂在鼠角膜上并温育30分钟。在没有麻醉的情况下进行了与肽的预温育。然后，将thy1
‑
yfp小鼠(n＝5/组)麻醉，将10μlacpa#1
‑
h4r3cit抗血清同时用于fc受体阻滞组和乱序肽阻滞组，并连续10天温育40分钟。在refresh optive中进行稀释。对鼠角膜进行荧光素染色，监测并用裂隙灯成像。通过metamorph成像系统测量荧光素强度。为了研究竞争性阻滞fc受体是否会产生与阻滞fc受
体的肽相同的结果，将小鼠igg和acpa抗体一起添加。对于igg竞争实验，将10μl acpa抗体(h4r3cit抗血清)和小鼠igg(abcam#ab188776)的1:1比例的混合物涂在鼠角膜上，并连续40天温育40分钟。在对照实验中，仅使用了acpa抗体。对鼠角膜进行荧光素染色，监测并用裂隙灯成像。通过metamorph成像系统测量荧光素强度。10天后，收获角膜，将其裂解并进行luminex以检测细胞因子。
[0187]
如图16所示，两种策略均显著减少了h4r3cit引起的眼表疾病。对角膜中表达的细胞因子的分析表明，il
‑
2在acpa条件下显著增加，但在对照中则没有(图16)。用肽阻滞剂阻滞fc受体可产生h4r3cit抗血清的反向作用。在实验结束时收集角膜，将其裂解并进行细胞因子分析。竞争性和肽阻滞性小鼠角膜中的il
‑
2水平均显著低于未阻滞的小鼠。总之，小鼠igg与acpa抗体竞争与fc受体的结合，而fc受体阻滞剂可阻滞所有fc受体。这种竞争性和肽类阻滞作用消除了acpa对角膜的病理作用，这表明使用防止acpa抗体与fc受体相互作用的方法可能是治疗与瓜氨酸化相关的眼部疾病的潜在治疗策略。
[0188]
实例9：acpa
‑
h4r3cit在体外诱导netosis。
[0189]
为了确定acpa是否能在体外诱导netosis，通过静脉穿刺在bd真空容器钠肝素管(bd biosciences，#367878)中收集外周血，然后立即运送到实验室进行嗜中性粒细胞分离。根据制造商的说明，使用macsxpress磁珠(macsxpress嗜中性粒细胞分离试剂盒，miltenyi biotech，#130
‑
104
‑
434)通过对非靶细胞进行免疫磁性消耗来分离嗜中性粒细胞。使用macsxpress红细胞清除试剂盒(miltenyi biotec，#130
‑
094
‑
183)去除残留的红细胞。将分离的嗜中性粒细胞重悬于3ml无血清的无酚红的rpmi
‑
1640培养基(gibco，#11835
‑
030)。测量细胞数后，将1.0x 106细胞/ml铺板在玻璃载玻片(millipore，#pezgs0416)中，并与以下抗体以及对照一起温育：1)rpmi，作为阴性对照，2)1nm pma作为阳性对照，3)100ng/ml正常兔血清(abcam，ab7487)，4)100ng/ml h3cit抗血清(novusbio，nb100
‑
57135ss)，5)100ng/ml h4r3cit抗血清(abcam，ab81797)，6)100ng/ml瓜氨酸化纤维蛋白原抗体(cayman chemical，17088)，7)100ng/ml瓜氨酸化波形蛋白抗体(cayman chemical，22054)，8)100ng/ml瓜氨酸化α
‑
烯醇酶抗体(cayman chemical，23000)或9)ccp抗体(bioss，bs
‑
1053r)。将嗜中性粒细胞温育过夜，并用1μm sytox绿(molecular probes，invitrogen，目录号s7020)和5μm hoechst(fisherscientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，#33342)染色。立即将其以20x的zeiss observer z1成像。
[0190]
如图17所示，使用分离的人类嗜中性粒细胞的体外实验表明，acpa
‑
h4r3cit刺激导致细胞外dna链显著增加，但对对照(其他acpa)却没有。仅pma刺激，acpa
‑
h4r3cit刺激和ccp acpa刺激产生明显的细胞外dna链。总之，acpa
‑
h4r3cit在体外诱导netosis。
[0191]
实例10：确定在正常或应激条件下眼表免疫球蛋白(osig)对人角膜上皮细胞的细胞毒性。
[0192]
在正常或应激条件下，使用原代人角膜上皮细胞确定对人角膜上皮细胞的细胞毒性osig。原代人角膜上皮细胞购自emd millipore(emd，#scce016)。细胞在epigro
tm
人眼上皮完全medum(emd，#scmc001)中生长。在伤口被刮伤的前一天，将20,000个细胞/孔接种在96孔imagelock板(essen bioscience，#4379)中，并使其生长18小时以达到单层融合。imagelock板是经过特殊修改的板，其技术通过板底部的基准标记实现，这些标记提供了可精确参考图像位置的点。用incucyte 96针创口机(essen bioscience，#4493)进行伤口刮
伤(宽700
‑
800μm)。刮擦后，将细胞用100μl无酚红的rpmi
‑
1640培养基(gibco#11835030)洗涤两次。对于osig(flebogamma 5％dif)剂量依赖性实验，将培养基替换为200μl的以下条件培养基：(1)epigro，(2)4mg/ml osig或(3)8mg/ml osig。在epigro中进行osig稀释。将板在incucyte zoom活细胞分析系统(essen bioscience)中温育。每3小时捕获一次图像。用incucyte zoom软件确定69小时的相对伤口密度(％)。该度量依赖于在每个时间点相对于伤口区域外部的空间细胞密度来测量伤口区域中的空间细胞密度。它被设计为在t＝0时为0％，当伤口内部的细胞密度与初始伤口外部的细胞密度相同时为100％。它不依赖于发现细胞边界。通过ldh(乳糖脱氢酶)细胞毒性测定(thermo scientific，#88954)确定hce
‑
t细胞的细胞毒性。收集细胞培养物上清液，将50μl上清液与50μl反应混合物混合并温育30分钟，然后将混合物转移至96孔平底板中。用cytation5酶标仪在波长(490
‑
680nm)下的吸收率。
[0193]
使用人角膜上皮(hce
‑
t)细胞系进行上皮刮擦测定，该细胞系是sv40
‑
腺病毒载体转化的人角膜细胞(riken cell bank rcb2280，筑波，日本)。细胞在补充有10％fbs(invitrogen，#26140
‑
079)和1％抗生素和抗真菌溶液的dmem培养基(gibco，#11965
‑
092)中生长，该溶液含有10,000单位/ml的青霉素、10,000μg/ml的链霉素和25μg/ml的gibco两性霉素b(thermo fisher scientific，#15240062)，并在装有5％co2的37℃组织培养箱中温育。伤口刮伤的前一天，将30,000个细胞/孔接种到96孔imagelock板(essen bioscience，#4379)中，使其生长18小时以达到单层融合。imagelock板是经过特殊修改的板，其技术通过板底部的基准标记实现，这些标记提供了可精确参考图像位置的点。用incucyte 96针创口机(essen bioscience，#4493)进行伤口刮伤(宽700
‑
800μm)。刮擦后，将细胞用100μl无酚红的rpmi
‑
1640培养基(gibco#11835030)洗涤两次。对于osig(flebogamma 5％dif)剂量依赖性实验，将培养基替换为200μl的以下条件培养基：(1)在正常条件下(图b)：(i)完全培养基(cm)；(ii)4mg/ml osig或(iii)10mg/ml osig，(2)应激条件(图c)：(i)rpmi；(ii)4mg/ml osig或(iii)10mg/ml。将板在incucyte zoom活细胞分析系统(essen bioscience)中温育。每3小时捕获一次图像。用incucyte zoom软件测定相对伤口密度(％)，持续12小时。该度量依赖于在每个时间点相对于伤口区域外部的空间细胞密度来测量伤口区域中的空间细胞密度。它被设计为在t＝0时为0％，当伤口内部的细胞密度与初始伤口外部的细胞密度相同时为100％。它不依赖于发现细胞边界。通过ldh(乳糖脱氢酶)细胞毒性测定(thermo scientific，#88954)确定hce
‑
t细胞的细胞毒性。收集细胞培养物上清液，将50μl上清液与50μl反应混合物混合并温育30分钟，然后将混合物转移至96孔平底板中。用cytation5酶标仪在波长(490
‑
680nm)下的吸收率。10mg/ml的osig在所有三个条件下均显示毒性，而4mg/ml的则无毒，可作为工作浓度(有效且无毒)。如图18所示，无论细胞处于正常还是应激状态，毒性都没有改变。总而言之，osig是4mg/ml的最高浓度而没有毒性。
[0194]
实例11：眼表面的acpa反应是活性眼抗体产生反应
[0195]
研究了尽管在血清中没有这些acpa抗体并且类风湿因子阴性，但泪液中acpa也较高的眼表疾病患者的数量。166例患者中有49％的患者血清中环瓜氨酸肽(ccp)阴性，而泪液中acpa阳性。这些患者中有69％为类风湿因子阴性。这表明眼表上的acpa反应是一种主动的局部抗体产生反应，而不是血清中acpa的被动渗出，因此不需要伴随的全身性免疫疾
10％)进行制备，但是可以使用任何可商购的igg或血浆来源的合并的人免疫球蛋白g来制备osig制剂。这些案例研究提供了重要的临床意义与本文提供的眼科制剂有关的结果。
[0211]
案例研究1是56岁女性，因眼移植物抗宿主病而患有严重的泪液缺乏症和严重的眼表疾病(图22)。右眼的osdi为77.7，角膜染色为6/15。vbr显示右眼在70岁时出现眼部充血。存在角膜疤痕而没有任何角膜新血管形成。开始每天两次osig滴眼液0.4％。患者在治疗两周后报告眼部不适显著减少(osdi降至30.5)，角膜染色显著减少(2/15)和vbr显著减少(50)。在随后的两周治疗中，vbr降至30，角膜染色降至1/15。右眼中的泪液中的细胞外dna为56μg/ml，经osig处理后减少至12.3μg/ml。在该实例中，osig滴眼液减轻了严重干眼症的症状和体征，并减少了泪液中的炎症生物标志物。
[0212]
案例2是31岁女性，由于眼移植物抗宿主病而患有严重的泪液缺乏和严重的眼表疾病(图23)。该患者在prose角膜接触镜覆盖区域以外发生严重的结膜角化，但没有任何角膜新生血管形成，并有严重的眼部不适症状。开始每天两次osig滴眼液0.4％。治疗一个月后，结膜角质化减少，患者报告主观眼部症状“大大改善”。在该实例中，osig滴眼液可减轻由于严重干眼而导致的角质形成，并显著减轻眼睛不适。
[0213]
案例研究3是74随男性，因左眼有lasik手术史而患有神经营养性角膜炎(图24)。角膜的左眼染色为2/15，患者的眼部不适感强度为4/10。角膜在lasik皮瓣的边缘显示淡淡的疤痕，没有任何角膜新血管形成。总体而言，该检查与症状体征分离的诊断(不协调ded)一致。开始每天两次osig滴眼液0.4％。治疗一个月后，患者主观好转(sga)，症状强度降至3。左眼角膜染色消失(0/10)。在该实例中，osig滴眼液在导致症状征兆断开的术后并发症中是有益的。
[0214]
案例研究4是39岁男性，患有严重的泪液缺乏症和严重的眼表疾病眼瘢痕性类天疱疮。角膜的spk染色在右眼中为1/15，在左眼中为3/15，没有任何角膜新血管形成。患者报告眼部不适感强度为3/10。开始每天两次osig滴眼液0.4％。治疗一个月后，双眼的不适感降至2/10，角膜染色消失(0/10)。该实施例证实了osig滴眼剂在眼瘢痕性天疱疮中的有益作用。
[0215]
案例研究5是33岁患者，患有严重的泪液缺乏和严重的眼部不适症状，诊断为症状体征断开(不协调ded)。没有角膜染色，也没有角膜新血管形成。眼部不适强度为6/10。开始每天两次osig滴眼液0.4％。治疗一个月后，右眼的不适感降低到3/10，左眼降低到4/10。该实例证实了osig滴眼剂在减轻症状体征断开的患者的眼部不适中的有益作用。
[0216]
案例研究6是29岁男性，因史蒂文
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约翰逊综合症患有泪液缺乏和严重的眼表疾病(图25)。osdi为54.7，症状强度为8/10(严重的恐怖不适)。两只眼睛每天开始三次osig滴眼液0.4％。患者报告治疗两周后眼部不适明显减轻(osdi降至14.2)，症状强度降至0/10(无不适)。在进行osig治疗之前，“一直”都存在对眼睛的光敏性和坚硬感。经过osig治疗后，光敏感度只是“某些时候”，而根本没有沙砾感。osig治疗还可减少眼部充血。在该实例中，在史蒂文
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约翰逊综合症后，osig滴眼液大大减轻了干眼症的体征和症状。