CircN4bp1的SiRNA在制备治疗脓毒症致ARDS药物中的应用的制作方法

circn4bp1的sirna在制备治疗脓毒症致ards药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，涉及一种急性呼吸窘迫综合征，具体来说是circn4bp1的 sirna在制备治疗脓毒症致ards药物中的应用。


背景技术：

2.急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ards)是一组涉及多学科的临床常见危重症。尽管呼吸支持治疗等危重病救治手段不断进步，ards的病死率仍高达40％左右。目前肺损伤炎症消退和损伤修复的机制并不完全清楚，ards的治疗措施也因此受到了限制，因此如何防治脓毒症致ards仍是呼吸和危重症领域内的难题，需要积极探索其分子机制，为寻找干预的新途径和新靶点奠定基础。
3.环状rna(circular rna,circrna)是新近发现的非编码rna，与多种炎症性疾病有密切关联。我们前期通过circrna微阵列芯片、qpcr验证发现circn4bp1高表达于脓毒症致ards 小鼠模型肺组织巨噬细胞(j cell mol med.2019；23(10):7111-7115)，且通过go和kegg 分析提示其可能参与了ards的病理生理过程。
4.circn4bp1是一种内含子环状rna，其基因符号是n4bp1，染色体位置为 chr8:86865721-86866760-。
[0005][0006]
伴随分子生物学技术的发展，基因沉默技术在人类基因功能研究和药物靶点鉴定等方面越来越凸显优势，具有潜在临床应用价值。
[0007]
本研究首先检测并比较了脓毒症致ards患者和正常对照外周血单个核细胞(pbmc)和 cd14 单核细胞circn4bp1的表达水平，并与疾病严重程度和死亡结局进行相关分析；进一步在动物水平干扰circn4bp1的表达，观察对肺损伤及炎症反应的影响，以期为circn4bp1为脓毒症ards治疗靶点提供新的理论依据。
[0008]
关于本发明circn4bp1的sirna抑制剂在制备治疗脓毒症致ards的药物中的应用目前还未见报道。


技术实现要素：

[0009]
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种circn4bp1的sirna在制备治疗脓毒症致ards药物中的应用，所述的这种药物要解决现有技术中对于治疗脓毒症致ards的效果不佳的技术问题。
[0010]
本发明提供了一种circn4bp1的sirna，其基因序列如seq id no.1所示。
[0011]
本发明还提供了上述的circn4bp1的sirna在制备用于治疗脓毒症致ards的药物中的应用。
[0012]
本发明还提供了circn4bp1在制备用于诊断脓毒症致ards的生物标记物中的用
途。
[0013]
本发明还提供了检测circn4bp1表达量的试剂在制备评估脓毒症致ards预后生存的试剂盒中的应用。
[0014]
进一步地，所述的circn4bp1表达量与脓毒症ards病情严重程度评分msofa和死亡结局呈正相关关系。
[0015]
优选地，所述试剂盒检测的样本为ards患者外周血pbmc或者cd14 单核细胞。
[0016]
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明首次通过实验研究了circn4bp1 可用于评估脓毒症致ards预后判断诊断标志物，为该类患者提供了一种新的预后评估方法，进而为该类患者的治疗提供了一种新的有效治疗方法，减少了该类患者的治疗成本且提高了生存率，有较好的应用前景。
附图说明
[0017]
图1显示了脓毒症致ards患者和健康对照外周血pbmc中circn4bp1的表达变化。
[0018]
图2显示了脓毒症致ards患者和健康对照外周血单核细胞中circn4bp1的表达变化。
[0019]
图3显示了脓毒症致ards患者外周血circn4bp1水平与msofa评分的相关性分析。
[0020]
图4显示了三条sirna干扰circn4bp1效率柱状图。
[0021]
图5显示了circn4bp1在clp和对照组小鼠模型肺组织和肺泡灌洗液中的表达情况。
[0022]
图6显示了circn4bp1在四组小鼠(对照组，circn4bp1的sirna(circn4bp1-kd) 对照组，ards模型组以及circn4bp1-kd ards组)肺组织中的表达情况。
[0023]
图7显示了四组小鼠(对照组，circn4bp1的sirna(circn4bp1-kd) 对照组，ards模型组以及circn4bp1-kd ards组)肺组织的he组织病理学损伤情况。
[0024]
图8显示了四组小鼠(对照组，circn4bp1的sirna(circn4bp1-kd) 对照组，ards模型组以及circn4bp1-kd ards组)肺干湿比和肺泡蛋白渗漏情况。
[0025]
图9显示了四组小鼠(对照组，circn4bp1的sirna(circn4bp1-kd) 对照组，ards模型组以及circn4bp1-kd ards组)肺组织悬液主要细胞因子水平(tnf-α、il-6和il-10)。
[0026]
图10显示了四组小鼠(对照组，circn4bp1的sirna(circn4bp1-kd) 对照组，ards模型组以及circn4bp1-kd ards组)肺组织悬液巨噬细胞相关表面蛋白及信号通路分子表达水平。
具体实施方式
[0027]
实施例1
[0028]
为了评估检测circn4bp1的表达对脓毒症致ards患者疾病严重程度及预后的评估价值，我们选取2020年1月至2021年2月入住上海市东方医院急诊icu和综合icu的40例脓毒症致 ards患者(根据sepsis3.0诊断标准和ards柏林定义诊断)，同时设健康对照组40例。收集脓毒症ards患者确诊当天和对照组患者血液标本20ml，分别用密度梯度离心法(ficoll法)分离外周血单核细胞(pbmc)和磁珠分选cd14 单核细胞，采用qrt-pcr法检测pbmc和cd4 单核细胞中circn4bp1的水平，计算msofa评分，利用pearson相关法评估
circn4bp1表达与msofa 之间的相关性。根据患者存活与否，分为存活组和死亡组，比较circn4bp1在二组之间的差异。研究发现，脓毒症ards组的pmbc和cd14 单核细胞中circn4bp1水平明显高于对照组，死亡组高于存活组，且circn4bp1与msofa评分正相关。
[0029]
对以上实施例涉及的实验，说明如下：
[0030]
研究人群：
[0031]
选取2020年1月至2021年2月入住上海市东方医院急诊icu和综合icu的根据 sepsis3.0诊断标准和ards柏林定义诊断的80例脓毒症致ards患者，纳入标准：
①
符合sepsis3.0中脓毒症的诊断标准；
②
年龄≥18岁；
③
符合ards柏林定义诊断标准；
④
icu 治疗时间超过48小时。排除标准：
①
年龄＜18岁；
②
精神病不合作者；
③
临床资料不全者；
④
诊断脓毒症ards后7天内死亡者。本次纳入男性患者28例，女性患者12例，年龄分布在56 (35-67)岁，并设立健康对照组40例。研究方案经本院医学伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。
[0032]
标本收集及检测：
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收集脓毒症ards患者确诊当天和对照组患者血液标本20ml，分别用密度梯度离心法(ficoll法)分离外周血单核细胞(pbmc)和磁珠分选cd14 单核细胞，采用qrt-pcr法检测 pbmc和cd14 单核细胞中circn4bp1(正向引物5
’‑
tgcggaaattagggtcggaa-3’，反向引物： 5
’‑
ccgaccggaacttgagtctt-3’)的水平，提取pbmc和cd14 单核细胞总rna，进行纯度鉴定并测定rna浓度。反转录合成cdna，以cdna为模板进行pcr反应。
[0034]
反应条件：95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，循环40次。以2-δδct 法计算基因表达量。
[0035]
采集和记录患者一般临床特征如年龄、性别；脓毒症感染灶；呼吸指数(潮气量、氧合指数，peep等)；休克病因及调整序贯系统衰竭评分(msofa)等。根据患者28天存活与否分为存活组和死亡组。采用spss25.0软件进行统计学处理，graphpadprism8.0软件作图。
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结果：
[0037]
患者的一般临床资料见表1，与健康对照组相比，脓毒症致ards患者外周血pbmc和单核细胞中circn4bp1表达水平明显升高(图1a，图2b)，死亡组高于存活组(图1b,2c)，circn4bp1 主要表达于单核细胞(图2a)pearson相关分析发现circn4bp1水平与msofa评分呈正相关(图 3)。因此，本发明提供外周血circn4bp1水平作为判断脓毒症致ards病情严重程度和不良预后的指标。(图2a)
[0038]
为了评估circn4bp1的sirna抑制剂对脓毒症后ards的作用及机制，首先通过构建 sirna敲低质粒，pcr检测干扰circn4bp1转染raw264.7细胞的干扰效率；接着通过盲肠结扎穿孔(clp)手术建立ards小鼠模型，分为对照组，circn4bp1的sirna(circn4bp1-kd) 对照组，ards模型组以及circn4bp1-kd ards组。通过肺组织he染色、肺泡灌洗液蛋白渗漏、肺干/湿重比例以及elisa法检测促炎及抗炎细胞因子评估了解对急性肺损伤的作用；通过蛋白质免疫印迹试验(western blot)及逆转录酶pcr了解支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞的分型变化，并探索对细胞信号通路的影响。
[0039]
具体实施过程如下：
[0040]
(1)构建sirna敲低质粒，pcr检测干扰circn4bp1转染raw264.7细胞的干扰效率：我们使用广州锐博公司设计的3条特异性sirna干扰片段及对照序列转染raw246.7细胞系，
结果显示序列为5
’‑
tctgaaacaacctttctgg-3’(seq id no.1)的沉默效应最突出(p《0.01, 图4)，因此，选择此序列为后续的干扰实验使用。
[0041]
表2三条针对circn4bp1的干扰序列
[0042][0043]
(2)circn4bp的sirna抑制剂减轻脓毒症诱导的肺损伤和炎症反应
[0044]
我们将经过circn4bp的sirna(seq id no.1)抑制剂处理后的raw264.7巨噬细胞(200ul) 通过尾静脉分别输注到sham circn4bp1-kd和clp circn4bp1-kd group组，sham组合clp 组分别给与尾静脉输注等量生理盐水作为对照.24小时后各组小鼠予以假手术(sham)或盲肠结扎穿孔手术(clp)处理。
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我们首先发现circn4bp1在脓毒症致ards小鼠模型肺组织及肺泡灌洗液中表达增高(图 5，6)。与ards模型小鼠相比，circn4bp1-kd组ards小鼠在clp术后1天肺组织损伤减轻 (炎性细胞浸润减少，肺泡间隔增厚和水肿明显减低)(图7)，检测肺泡蛋白渗漏明显减轻 (图8a)，肺湿/干比明显降低(图8b)。elisa检测还发现，circn4bp1-kd组明显降低肺泡灌洗液中tnf-α和il-6水平,明显增加il-10水平(图9)。
[0046]
(3)circn4bp1的sirna抑制剂抑制脓毒症ards小鼠肺泡巨噬细胞m1极化，促进m2分化
[0047]
我们采集上述各组小鼠肺泡灌洗液，分离巨噬细胞，通过蛋白质免疫印迹试验检测m1 巨噬细胞表面标记蛋白inos和m2标记蛋白arg-1的水平。
[0048]
结果发现与模型组相比，circn4bp1-kd组小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞m1极化明显抑制，表现为inos含量明显降低，其相关细胞因子tnf-α和il-6也明显降低；出现明显的m2型巨噬细胞极化，表现为arg-1的水平明显上升，其相关细胞因子il-10含量上调(图9)。此外，我们还发现与模型组相比，m1极化相关信号通路蛋白p-stat1明显抑制，而m2极化相关信号通路蛋白ppar-γ明显激活(图10).
[0049]
综上所述，本发明发现circn4bp1在脓毒症致ards小鼠模型肺组织及肺泡灌洗液中表达增高，circn4bp1-sirna(seq id no.1)能明显减轻clp诱导ards小鼠肺损伤和炎症反应，抑制肺泡巨噬细胞m1极化，促进m2极化。本发明提供circn4bp1的sirna抑制剂作为治疗 ards候选药物的选择。
[0050]
表1：脓毒症致ards患者健康对照
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[0052][0053]
注：peep,positive end expiratory pressure,呼气末正压通气；msofa,modified sequentialorgan failure assessment,改良sofa评分(0-20,评分》8,提示病情较重)，p《0.05提示有统计学差异。
[0054]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。