一株降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌的驯化培育方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一株降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌及其驯化培育方法。


背景技术：

2.玉米赤霉烯酮(zearalenone， zen)是由多种镰刀菌产生并释放到环境中的真菌毒素，具有雌激素样作用，主要表现为慢性毒性，包括对生殖系统的毒性以及基因毒性和内分泌系统的影响。动物采食被玉米赤霉烯酮污染的饲料容易导致动物繁殖周期紊乱，甚至造成繁殖障碍，影响动物生产发育中的机体，尤其是在胎儿及新生儿期，体内一些保护性屏障及代谢、排泄等生理功能尚未完善，对玉米赤霉烯酮更具有易感性。玉米赤霉烯酮在1
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3 mg/kg时即能刺激雌激素受体转录，导致繁殖障碍。大多数动物对玉米赤霉烯酮都比较敏感，如猪、牛、绵羊、火鸡和鸡等。玉米赤霉烯酮可对雌性动物的生殖系统造成毒害，并通过胎盘的吸收从母体传给胎儿，损害幼体的健康甚至造成流产。在畜禽中，猪尤其是后备母猪对玉米赤霉烯酮最为敏感，当饲料中含有1mg/kg以上的玉米赤霉烯酮时就可以引起猪的雌性激素中毒。由于玉米赤霉烯酮是作物在田间生长期间由镰刀霉菌产生的，对其预防很难有成效，必须采取有效的脱毒技术来消除玉米赤霉烯酮的污染。
3.目前控制玉米赤霉烯酮的方法主要包括物理方法、化学方法及生物方法。常用的控制玉米赤霉烯酮的物理方法有剔除、水洗、脱壳、碾磨、热处理、压煮、辐照和吸附剂吸附等。对于轻微污染玉米赤霉烯酮的谷物可以采取剔除、水洗、脱壳和碾磨等手段清除部分毒素，一般适用于少量谷物中玉米赤霉烯酮的清除。采用热处理和压煮方法对产生玉米赤霉烯酮的真菌起到杀菌作用，但是由于玉米赤霉烯酮的性质很稳定，所以这两种方法对玉米赤霉烯酮的作用并不大，且高温处理会破坏食品或饲料的营养价值。辐照技术处理真菌毒素不但能有效清除毒素，还能同时杀死镰刀菌，但辐照降解后产物的组成、性质以及毒理等尚缺乏研究。吸附剂吸附也是一种能有效清除玉米赤霉烯酮污染的方法，但吸附方法在吸附毒素的同时也会吸附食物中的营养物质，并且由于毒素并未得到降解，会为环境带来污染。常用的清除玉米赤霉烯酮的化学方法包括臭氧处理、双氧水处理及碳酸钠浸泡等，但是化学试剂的添加会引入许多不确定因素，生成新产物的潜在毒性也需进一步研究。
4.现有技术的缺陷和不足：受制于菌株来源和发酵技术的制约，目前市场上的霉菌毒素降解菌产品稳定性层次不齐，降解率不高，且菌株的活菌数、代谢产物和抗逆性不能保持稳定，很难满足于饲料加工中的应用；本发明所要解决的技术问题：如何获得具有高效稳定性强的霉菌毒素降解菌迫在眉睫，通过驯化育种筛选降解率高、高产并且稳定性强的玉米赤霉烯酮降解菌——凝结芽孢杆菌，因此驯化育种筛选降解率高且传代稳定的凝结芽孢杆菌是解决目前霉菌毒素困扰饲料及畜禽养殖业问题的一种重要途径。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明公开了一株具有降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌及其驯化培育方法。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一株具有降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，编号为amnj008，所述的凝结芽孢杆菌用于饲料加工生产，且属于饲料添加剂目录收录菌种并对养殖动物健康具有促进作用。
7.菌种保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号gdmcc.gim1.645。该菌种是公知公用菌种，方便获得。
8.一种降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌的驯化培育方法，包括以下步骤：步骤一，提供16份含同一浓度玉米赤霉烯酮的mrs液体培养基分别接入公司菌种库保存的16份凝结芽孢杆菌菌株，然后37℃条件下进行混合培养24h，分别检测16份上述混合菌株液中上清液的玉米赤霉烯酮浓度，选取玉米赤霉烯酮浓度降解率最大的混合菌株液在mrs平板上进行划线扩增培养，挑选单菌得到目的菌株；步骤二，提供n份mrs液体培养基和上述凝结芽孢杆菌种子液；分别向n份所述mrs液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得n份不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基；步骤三，以相同接种量将所述凝结芽孢杆菌种子液分别接种到n个不同玉米赤霉烯酮浓度的所述驯化培养基中进行培养，得到n份一次诱导混合菌株液；分别检测n份所述一次诱导混合菌株液中上清液的玉米赤霉烯酮浓度，选取玉米赤霉烯酮浓度降解率最大的一次诱导混合菌株液在mrs培养平板上进行划线扩增培养，得到循环出发菌种；步骤四，依次采用n份所含玉米赤霉烯酮浓度由低到高的所述驯化培养基对所述循环菌种进行逐级传代培养，当逐级传代培养后的上清液中的玉米赤霉烯酮浓度不变时，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌生产菌种，其中n为大于等于3的自然数。
9.进一步地，所述步骤一中，所述mrs液体培养基的制备方法包括：蛋白胨 10.0g、牛肉浸取物 10.0g、酵母提取液 5.0g、葡萄糖 20.0g、乙酸钠 5.0g、柠檬酸二胺 2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾 0.4g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰0.29、碳酸钙20.0g、琼脂15-20g、加入蒸馏水定容至100ml，ph调至6.3，121℃，0.1mpa，灭菌20min，制得所述菌种保存培养基。
10.进一步地， 所述步骤二中，所述凝结芽孢杆菌种子液的制备方法包括：以接种量为0.5%
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5%的标准将凝结芽孢杆菌单菌接种至所述mrs液体培养基中，并于37℃条件下对其恒温静置培养24h
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36h，得到所述凝结芽孢杆菌种子液。
11.进一步地，它还包括提供一种菌种保存培养基，将所述降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌菌生产菌种保存于所述菌种保存培养基中。
12.进一步地，制备所述菌种保存培养基的步骤包括：将蛋白胨 10.0g、牛肉浸取物 10.0g、酵母提取液 5.0g、葡萄糖 20.0g、乙酸钠 5.0g、柠檬酸二胺 2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾 0.4g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰0.29、碳酸钙20.0g、琼脂15-20g、加入蒸馏水定容至100ml，ph调至6.3，121℃，0.1mpa，灭菌20min，制得所述菌种保存培养基。
13.本发明的有益效果为：本发明所提供的驯化培育方法获得的降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌生产菌对玉米赤霉烯酮的降解能力可达到35%，所述降解玉米赤霉烯酮的凝
结芽孢杆菌生产菌种经扩增培养后制取的新凝结芽孢杆菌培养液，对玉米赤霉烯酮的降解能力可达到65.2%；经过10代培养后获取的凝结芽孢杆菌及其培养液对玉米赤霉烯酮的降解率可达到80%以上。同时，经驯化后的第一代凝结芽孢杆菌经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并且凝结芽孢杆菌培养液的降解能力远远高于菌株本身，有利于在饲料中添加使用。另外本发明所提供的凝结芽孢杆菌菌株驯化培育方法步骤简单、易于操作。
具体实施方式
14.下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
15.实施例1凝结芽孢杆菌amnj008的分离：取出库存保存菌种（16株凝结芽孢杆菌）平板划线接种于mrs固体培养基中37℃静置培养24h进行活化，然后挑选单菌接种mrs液体培养基中37℃静置培养24h进行扩培制得初筛种子液；按1%(v/v)的接种量接种到添加有5ug/mlzen的mrs初筛培养基中富集培养，用等体积的甲醇超声萃取培养物中剩余的zen，采用 hplc-pad来定量分析zen的残留量。
16.分别检测16株凝结芽孢杆菌初筛培养基上清液中玉米赤霉烯酮的浓度，当上清液中玉米赤霉烯酮的浓度不变时，认为达到该菌种对玉米赤霉烯酮的最大耐受能力，计算出其中降解率最大的凝结芽孢杆菌，编号为amnj008，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌驯化基础母菌。
17.实施例2本实施例提供一种降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，该凝结芽孢杆菌菌株，编号：amnj008。
18.本实施例还提供一种降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌的驯化培育方法，具体包括以下步骤：（1）首先称取蛋白胨10.0g、牛肉浸取物 10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29、碳酸钙20.0g、琼脂15-20g、加入蒸馏水定容至100ml，ph调至6.3，121℃，0.1mpa，灭菌20min，制得mrs液体培养基；然后将所述mrs液体培养基分为10份，以接种量为1%（v/v）的标准将凝结芽孢杆菌母液接种至其中一份所述mrs液体培养基中，并于37℃条件下静置培养24h，得到凝结芽孢杆菌种子液；分别向剩余9份所述mrs液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得玉米赤霉烯酮浓度分别为3.0ug/ml、3.5ug/ml、4.0ug/ml、4.5ug/ml、5.0ug/ml、5.5ug/ml、6.0 ug/ml、6.5ug/ml和7.0ug/ml的9种不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基，并分别将其装入9个三角瓶中；（2）将所述凝结芽孢杆菌种子液分别接种到上述步骤（1）所制备的9个装有不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基三角瓶中；将接种后的9个三角瓶置于37℃条件下静置培养24h，得到9份一次诱导混合菌株液；分别检测9份所述一次诱导混合菌株液中上清液的玉米赤霉烯酮浓度，并将上清液中玉米赤霉烯酮浓度降解率数值最大的一次诱导混合菌株液在
mrs培养平板上进行划线扩增培养，得到循环出发菌种；（3）以接种量为1%的标准将所述循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到二代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该二代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.5ug/ml的驯化 培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到三代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该三代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到四代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该四代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.5ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到五代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该五代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到六代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将 该六代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.5ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到七代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该七代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到八代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该八代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.5ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到九代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该九代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为7.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃条件下静置培养24h后，得到十代循环出发菌种。
19.每代培养结束后，分别检测每代上清液中玉米赤霉烯酮的浓度，当上清液中玉米赤霉烯酮的浓度不变时，认为达到该菌种对玉米赤霉烯酮的最大耐受能力，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌生产菌种。
20.该降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌菌株的驯化培育方法还包括制备一种菌种保存培养基，将所述降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌生产菌种保存于所述菌种保存培养基中。其中制备该菌种保存培养基的步骤包括:首先称取蛋白胨10.0g、牛肉浸取物 10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29、碳酸钙20.0g、琼脂15-20g、加入蒸馏水定容至100ml，ph调至6.3，121℃，0.1mpa，灭菌20min，制得所述菌种保存培养基。
21.性能测试毒素降解试验：由本实施例所提供的降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌株的驯化培育方法中，所述步骤(2)出现了有五份降低玉米赤霉烯酮浓度的培养基，分别命名为t1、t2、t3、t4、t5，三份降低玉米赤霉烯酮浓度的培养基中玉米赤霉烯酮降解率分别为5.12%，7.68%、22.08%、29.80%和35.0%。
22.然后将t5作为选育对象采用所述步骤(3)对其进行逐级传代培养，驯化选育出一株能够稳定降解玉米赤霉烯酮的第一代凝结芽孢杆菌生产菌种，此第一代凝结芽孢杆菌生产菌种在30℃条件下对玉米赤霉烯酮的降解率稳定保持在35.0%以上，并对所述第一代凝结芽孢杆菌生产菌种在不同共培养时间对玉米赤霉烯酮的降解效果进行了测定，可将玉米赤霉烯酮浓度由6.0ug/ml降低至3.128 ug/ml，降解率为47.87%；最后采用所述mrs液体培养基对所述第一代凝结芽孢杆菌生产菌种进行10代培养，经过10代培养后获取的第十代凝结芽孢杆菌生产菌种及其培养液对玉米赤霉烯酮的降
解率达到80.0%以上。
23.实施案例3本实施例提供一种降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌的驯化培育方法，具体步骤与实施例1中的步骤大致相同，不同之处在于：所述步骤(1)中，向剩余9份所述mrs液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得玉米赤霉烯酮浓度分别为3.0ug/ml、3.5ug/ml、4.0ug/ml、4.5ug/ml、5.0ug/ml、5.5ug/ml、6.0 ug/ml、6.5ug/ml和7.0ug/ml的9种不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基，并分别装入9个三角瓶中；所述步骤(3)为：以接种量为3%的标准将所述循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到二代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该二代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.5ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到三代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该三代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到四代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该四代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.5ug/ml的驯化 培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到五代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该五代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到六代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该六代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.5ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到七代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该七代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到八代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该八代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.5ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到九代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该九代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为7.0ug/ml的驯化培养基中并置于37℃静置培养24h后，得到十代循环出发菌种。
24.每代培养结束后，分别检测每代上清液中玉米赤霉烯酮的浓度，当上清液中玉米赤霉烯酮的浓度不变时，认为达到该菌种对玉米赤霉烯酮的最大耐受能力，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌菌生产菌种。
25.性能测试毒素降解试验：由本实施例所提供的降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌株的驯化培育方法中，所述步骤(2)出现了有五份降低玉米赤霉烯酮浓度的培养基，分别命名为t1、t2、t3、t4、t5，三份降低玉米赤霉烯酮浓度的培养基中玉米赤霉烯酮降解率分别为5.37%，6.98%、21.56%、30.13%和35.4%。
26.然后将t5作为选育对象采用所述步骤(3)对其进行逐级传代培养，驯化选育出一株能够稳定降解玉米赤霉烯酮的第一代凝结芽孢杆菌生产菌种，此第一代凝结芽孢杆菌生产菌种在30℃条件下对玉米赤霉烯酮的降解率稳定保持在35.0%以上，并对所述第一代凝结芽孢杆菌生产菌种在不同共培养时间对玉米赤霉烯酮的降解效果进行了测定，可将玉米赤霉烯酮浓度由6.0ug/ml降低至2.512 ug/ml，降解率为58.13%；最后采用所述mrs液体培养基对所述第一代凝结芽孢杆菌生产菌种进行10代培
明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。