G蛋白偶联受体LPAR6在肝癌预后中的用途的制作方法

g蛋白偶联受体lpar6在肝癌预后中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及g蛋白偶联受体lpar6在肝癌预后中的用途，更具体地，涉及g蛋白偶联受体lpar6作为肝癌预后标志物及其应用。


背景技术：

2.肝癌在中国是高发的恶性肿瘤，其病死率在所有恶性肿瘤中位居第二，严重威胁国人的生命和健康，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素。尽管全球肝癌患者的五年生存率逐渐上升，但我国目肝癌患者的5年生存率依然不足10％，不容乐观。
3.肝癌常见的治疗方案手术治疗、靶向治疗、经导管动脉化疗栓塞和消融等治疗，对晚期肝癌的治疗效果非常有限。早期诊断难、预后差、发生发展快是肝癌防治的主要困难，大约70％以上的肝癌患者被确诊时已到晚期，手术切除及放化疗是目前治疗肝癌的主要有效手段，但是复发比例很高。所以及早发现及早治疗及精准的术后检测追踪对于提高患者生存率至关重要。
4.到目前为止，已有数十种的基因异常表达或者蛋白水平异常被确定与肝癌的发生发展有关，但是缺乏足够的生物标志物对肝癌患者，特别是对于传统的治疗方法如肝移植、外科肝切除术、早期射频治疗等受到了限制的肝癌晚期患者的预后进行检测。鉴于此，开发一种新型生物标志物对于肝癌的预后监测乃至靶向治疗至关重要。
5.溶血磷脂酸(lpa)是一种参与肿瘤增殖的脂质，2019年前共发现其有五种受体，分别为lpar1-5，lpar6是lpa家族的最新发现的受体，作为一种g蛋白偶联受体(gpcr)(taniguchi r,inoue a,sayama m,uwamizu a,yamashita k,hirata k,yoshida m,et al.structural insights into ligand recognition by the lysophosphatidic acid receptor lpa6.nature.2017；548(7667):356-60.shimomura y,wajid m,ishii y,shapiro l,petukhova l,gordon d,et al.disruption of p2ry5,an orphan g protein-coupled receptor,underlies autosomal recessive woolly hair.nat genet.2008；40(3):335-9.)，lpar6已被揭示与多种类型的癌症相关，包括结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌(takahashi k,fukushima k,onishi y,inui k,node y,fukushima n,et al.lysophosphatidic acid(lpa)signaling via lpa4 and lpa6negatively regulates cell motile activities of colon cancer cells.biochem biophys res comm.2017；483(1):652-7.sokolov e,eheim al,ahrens wa,et al.lysophosphatidic acid receptor expression and function in human hepatocellular carcinoma.j surg res.2013；180(1):104-13.)。然而，lpar6的功能仍然存在很大争议。lpar6在结直肠癌中充当肿瘤抑制因子并抑制肿瘤迁移，而在提到的其他肿瘤中，lpar6蛋白可能充当促进剂(ketscher a,jilg ca,willmann d,et al.lsd1 controls metastasis of androgen-independent prostate cancer cells through pxn and lpar6.oncogenesis.2014；3:
e120.ishii s,hirane m,fukushima k,et al.diverse effects of lpa4,lpa5 and lpa6 on the activation of tumor progression in pancreatic cancer cells.biochem biophys res comm.2015；461(1):59-64.)。所有这些发现表明lpar6编码的蛋白质可能在癌症中发挥重要作用，但lpar6与肝癌进展之间的关联及其潜在机制未有相关报道。
6.因此，为诊断和预后监测目的研究和开发在肝癌中异常表达的基因和/或蛋白具有重要意义。


技术实现要素：

7.为了实现上述目的，本发明首先提供一种g蛋白偶联受体lpar6在肝癌预后中的用途。
8.本发明的技术方案为：
9.鉴定试剂在制备预测肝癌预后的产品中的用途，其中：所述的鉴定试剂特异性地确定g蛋白偶联受体lpar6基因或其表达产物在受试者样本中的存在和/或水平。
10.在一些实施方式中，所述的受试者是哺乳动物，例如但不限于：人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、羊、马、骆驼、猪、犬、猫、猴或猿。在一些具体的实施方式中，所述的哺乳动物是人。
11.在一些实施方式中，所述g蛋白偶联受体lpar6是人的g蛋白偶联受体lpar6。人g蛋白偶联受体lpar6的核苷酸序列可以在公共数据库中获得，gene id为10161。
12.在一些实施方式中，g蛋白偶联受体lpar6基因的表达产物是指，g蛋白偶联受体lpar6基因在其生命周期中任意阶段的任意形式，例如但不限于：g蛋白偶联受体lpar6的mrna或其互补序列、g蛋白偶联受体lpar6的cdna(如seq id no:1所示)或其互补序列、g蛋白偶联受体lpar6的成熟蛋白(如seq id no:2所示)、g蛋白偶联受体lpar6的前体蛋白、或上述任一形式的片段、突变体、衍生物或修饰产物。
13.在一些实施方式中，所述的水平是蛋白质水平；在这些实施方案中，鉴定试剂可基于本领域已知的定量或定性免疫测定方案鉴定蛋白质水平，免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(facs)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。
14.作为实例，鉴定试剂包括特异性结合g蛋白偶联受体lpar6基因编码蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括f(ab
′
)2、fab
′
、fab、单链fv(scfv)、二硫化物键合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v区(双抗体)、或含有cdr的肽。本发明的鉴定试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
15.在另一些实施方式中，所述的水平是核酸水平；在这些实施方案中，鉴定试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用本发明的产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
m plot总生存期曲线。
28.图3b是根据本发明实施例的肝癌患者的lpar6基因表达情况将肝癌患者绘制的k-m plot无进展生存期曲线。
29.图3c根据本发明实施例的肝癌患者的lpar6基因表达情况将肝癌患者绘制的k-m plot无复发生存期曲线。
30.图4是根据本发明实施例的肝癌患者的lpar6蛋白水平情况将肝癌患者绘制的k-m plot生存曲线。
具体实施方式
31.以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.一、材料和方法
33.1.lpar6基因表达水平测定
34.本发明实施例通过timer平台(li t,fan j,wang b,traugh n,chen q,liu js,et al.timer:a web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells.cancer res.2017；77:e108-10.)对lpar6在各种癌症中的基因表达量进行分析，并且比较在癌和正常组织中的表达量差异。阈值设置如下：p值为1e-6，倍数变化为2，基因排名前5％。
35.2.肝癌患者预后分析
36.通过prognoscan和gepia2(hideaki mizuno,kunio kitada,kenta nakai and akinori sarai.prognoscan:a new database for meta-analysis of the prognostic value of genes.bmc medical genomics.2009；2:18.tang,z,kang b,li c,chen t,zhang z.gepia2:an enhanced web server for large-scale expression profiling and interactive analysis.nucleic acids res.2019；47(w1):w556-60.)确定了肝癌中lpar6基因表达与生存之间的关系。将阈值调整为《0.05的cox p值。
37.3.蛋白水平与预后相关性分析
38.lpar6在石蜡切片中的染色，在human protein altas数据库中分析lpar6蛋白水平与肝癌患者的预后关系。
39.4.统计分析
40.通过oncomine产生的结果显示为p值和倍数变化。prognoscan、kaplan-meier图和gepia的结果显示为hr和p/cox p值。分析基因表达的相关系数，p值《0.05被认为具有统计学意义。kaplan-meier图和相应的对数秩检验用于评估组间os的差异。
41.二、实验结果
42.1.lpar6在肝癌患者的癌组织和正常组织之间表达量存在差异
43.为了评估lpar6在肝癌患者中的表达情况，本发明实施例使用tcga中肝癌的rna测序数据分析了lpar6表达。研究纳入的肝癌患者的肿瘤和邻近正常组织之间的lpar6基因差
异表达如图1所示。lpar6在癌组织的基因表达量低于相邻的正常组织(图1)。
44.2.lpar6是一种细胞膜表达的蛋白，在肝癌患者的癌组织和正常组织之间蛋白水平存在差异
45.患者信息参见表1，本发明实施例中，可以看到染色集中于细胞膜上，lpar6在癌组织普遍水平较低甚至检测不到，低于正常组织(图2)。
46.表1肝癌患者信息
47.编号性别年龄组织/部位染色强度数量/占比染色部位2766女73肝癌未检测到弱《25％细胞膜2177女58肝癌阴性阴性无 3196男65肝癌未检测到弱《25％细胞膜2556男72肝癌未检测到弱《25％细胞膜3346女73肝癌阴性阴性无
· 3477男67肝癌未检测到阴性阴性 3402女54正常肝组织低中等《25％细胞膜3222女63正常肝组织低中等《25％细胞膜2429男55正常肝组织低中等《25％细胞膜
48.3.lpar6基因表达量与肝癌患者预后正相关
49.本发明实施例分析了lpar6基因表达是与肝癌预后的关系，基于affymetrix微阵列和rna测序数据，采用kaplan-meier plotter数据库来确定lpar6与肝癌预后的关系。本发明实施例中lpar6基因表达量与肝癌患者的总生存期、无进展生存期以及无复发生存期都正相关，即lpar6基因表达量上升，患者预后好(图3a至图3c)。
50.4.lpar6的蛋白水平与肝癌患者预后正相关
51.通过分析肝癌患者的lpar6蛋白水平与预后之间的关系，发现了与基因表达水平一致效应，即lpar6蛋白水平升高，肝癌患者预后好(图4)。
52.综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
53.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
54.以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。