标志物在诊断腹主动脉瘤中的用途的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及标志物在诊断腹主动脉瘤中的用途。


背景技术：

2.腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, aaa)是一种常见的危及生命的动脉退行性疾病，其定义为腹主动脉段动脉壁三层结构持续性扩张至肾动脉处腹主动脉直径大小的1.5倍以上。aaa为老年人中的常见疾病，在西方国家65岁以上男性中aaa的发病率约为5
‑
10%。aaa的主要并发症是破裂，一旦破裂死亡率可达90%以上，全球每年约有20万人因此死亡。 然而aaa在破裂前通常是无症状的。
3.大样本研究发现，在65岁以上男性中使用腹部超声筛查aaa，可以降低大约50�a相关的死亡率。最新研究表明，通过临床筛查可以降低老年男性aaa相关的死亡率，且在65
‑
74岁年龄段中比75
‑
84岁年龄段更为显著，并且在65
‑
74岁年龄段且有吸烟史的男性中，通过临床筛选，aaa相关的死亡率可有望下降89%。所以，为减少aaa破裂情况的发生，需要对暴露危险因素的人群进行筛查。临床上诊断aaa常见的手段主要有：常规体格检查、x线、腹部超声、ct及mrj等。但是，无论是超声检查还是ct检查都是属于物理诊断方式，目前研究人员对aaa生物标志物的研究较为关注，希望通过研究可以发现能够筛选、诊断aaa患者的生物标志物。
4.直径大于5.5 cm的aaa需要开放手术修复或血管内介入治疗，直径小于5.5 cm的无症状aaa推荐保守治疗。目前为止临床上尚无药物可以治疗aaa。aaa生物标志物的鉴定也可能有助于揭示 aaa 可能的病理生理机制并发现潜在的治疗靶点。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，开发出具有高特异性、敏感性的诊断标志物，其可以实现腹主动脉瘤的快速诊断。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明第一方面提供了一种用于诊断腹主动脉瘤的组合物，包含用于mrna或蛋白质水平上测量选自lgmn、erbb3、dll1组成的组中一种以上的生物标志物基因的表达量的试剂。
7.术语“生物标志物”和“标志物”在本文中可互换使用，指基于dna,rna,蛋白质,碳水化合物,或糖脂的分子标志物,它们在受试者的或患者的样品中的表达或存在可通过标准方法(或本文中公开的方法)来检测。
8.在本发明中，术语
ꢀ“
受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物) ，包括，但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。在本发明的具体实施例中，受试者是人类受试者。
9.在本发明中，生物标志物例如lgmn（geneid：5641）、erbb3（geneid：2065）、dll1（geneid：28514），包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标
志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。其中，lgmn编码的蛋白为人豆荚蛋白（uniprot id：q99538），erbb3编码的蛋白为受体酪氨酸蛋白激酶 erbb
‑
3（uniprot id：p21860），dll1编码的蛋白为delta样蛋白1（uniprot id：o00548）。
10.术语“样品”是指体液样品，分离的细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液样品可以通过公知的技术获得，并且包括，血液、尿液、淋巴液、痰液、腹水、支气管灌洗液或任意其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以从任意组织或器官获得，例如，通过组织活检获得。分离的细胞可以通过分离技术，如离心或细胞分选，从体液或组织或器官获得，例如，细胞、组织或器官样品可以从表达或产生生物标记的这些细胞、组织或器官获得。样品可以是冷冻的、新鲜的、固定的(例如，福尔马林固定的)、离心的和/或包埋的(例如，石蜡包埋的)等。当然，在评估样品中标记的量之前，细胞样品可以进行多种公知的收集后制备和存储技术(例如，核酸和/或蛋白提取，固定，保存，冷冻，超滤，浓缩，蒸发，离心等)。同样地，组织活检样品也可以进行收集后制备和存储技术，例如，固定。样品可以在治疗之前、治疗过程中或治疗后采集。样品可以从怀疑患有或诊断患有腹主动脉瘤并且因此可能需要治疗的患者采集，或者从不被怀疑患有任何病症的正常个体采集。在本发明的具体实施例中，所述的样品为血液。
11.进一步，所述的用于mrna水平上测量生物标志物基因的表达量的试剂包括通过聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、rna印迹或dna芯片的方法中的任何一种来检测生物标志物基因的表达量的试剂。
12.进一步，所述的用于mrna水平上测量生物标志物基因的表达量的试剂包括特异性识别上述生物标志物的核酸序列全长或其片段的引物对、探针或引物对和探针。
13.在本发明中，术语“引物”是指短核酸序列，其具有短的游离3羟基(free 3hydroxyl group)的核酸序列，能够与互补的模板(template)形成碱基对(base pair)，其充当用于模板链复制的起点。引物可以在适当的缓冲液及温度下，在用于聚合反应(即，dna聚合酶或逆转录酶)的试剂及不同的4种核苷三磷酸的存在下诱发dna合成。
14.在本发明中，术语“探针”是指对应于能够特异性结合mrna的数个碱基至数百个碱基的核酸片段，例如rna或dna等。由于被标记，因而可以确认是否存在特定的mrna。探针能够以寡核苷酸(oligonucleotide)探针、单链dna(single stranded dna)探针、双链dna(double stranded dna)探针、rna探针等形式制造。在本发明中，利用与上述生物标志物基因互补的探针进行杂交，并且可通过是否杂交来诊断上述基因的表达水平。可以基于本技术领域中公知的技术来更改用于合适探针的选择及杂交条件，在本发明中，对此没有特别限制。
15.本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体方法或其他公知的方法化学合成。这种核酸序列可以利用本领域中公知的多种手段来进行变形。这种变形的非限制性例包括甲基化、封装、天然核苷酸的一种以上的同源物的取代以及核苷酸之间的变形，例如，变形为不带电的连接体(例：膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的连接体(例：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)。
16.在本发明中，可通过优化步骤在一系列过程中确定使探针与cdna分子杂交的合适条件。该步骤由本领域普通技术人员通过一系列过程进行，以建立用于在研究室中使用的
协议。例如，温度、成分浓度、杂交及洗涤时间、缓冲液成分及其ph以及离子强度等条件取决于探针的长度、gc量及靶核苷酸序列等各种因素。用于杂交的详细条件可从“josephsambrook,et al.,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harborlaboratory press,cold spring harbor,n.y.(2001)；以及m.l.m.anderson,nucleicacidhybridization,springer
‑
verlag new york inc.n.y.(1999)”中确认。例如，在上述严格条件中的高严格条件是指在65℃下在0.5m nahpo4、7％十二烷基硫酸钠(sds，sodium dodecyl sulfate)、1mm edta中进行杂交，并且在68℃下在0.1
×
标准柠檬酸盐水(ssc，standard saline citrate)/0.1％十二烷基硫酸钠中进行洗涤。或者，高严格条件是指在48℃下在6
×
标准柠檬酸盐水/0.05％焦磷酸钠中进行洗涤。低严格条件是指例如在42℃下在0.2
×
标准柠檬酸盐水/0.1％十二烷基硫酸钠中进行洗涤。
17.进一步，所述的用于蛋白质水平上测量生物标志物基因的表达量的试剂包括通过多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、质谱分析、多重反应监测测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定或蛋白质芯片测量所述生物标志物基因的表达量的试剂。
18.进一步，所述的用于蛋白质水平上测量生物标志物基因的表达量的试剂包括特异性识别上述生物标志物的蛋白质全长或其片段的抗体、抗体片段、适体、高亲和性多聚体或拟肽。
19.如本文所用，术语
ꢀ“
抗体
”ꢀ
是指免疫球蛋白分子，其通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。如本文所用，该术语涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如fab、fab
ꢀ′ꢀ
、f(ab ')2和fv片段)、单链fv(scfv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。抗体可以是五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚单位结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子缀合，包括但不限于毒素和放射性同位素。
20.术语
ꢀ“
抗体片段
”ꢀ
是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的示例包括，但不限于，fab、fab
ꢀ′
、f(ab ')2和fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，
ꢀ“
抗体片段
”ꢀ
包含至少一个抗原结合位点或表位结合位点。术语抗体的
ꢀ“
可变区
”ꢀ
是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链或轻链的可变区通常由四个框架区(fr)组成，其由三个互补决定区(cdr)连接，也称为“高变区
”ꢀ
。每条链中的cdr通过框架区紧密邻近地结合在一起，并且有助于抗体的抗原结合位点的形成。
21.术语
ꢀ“
单克隆抗体
”ꢀ
是指参与单一抗原决定簇或表位的高特异性识别和结合的均质抗体群。这与通常包括针对多种不同抗原决定簇的不同抗体的混合物的多克隆抗体形成对比。术语
ꢀ“
单克隆抗体
”ꢀ
涵盖完整的和全长的单克隆抗体以及抗体片段(例如，fab、fab
ꢀ′
、f(ab ')2、fv)、单链(scfv)抗体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原结合位点的
任何其他修饰的免疫球蛋白分子。
22.本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的组合物在制备诊断腹主动脉瘤的工具中的应用。
23.进一步，所述的工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
24.其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测所述生物标志物基因转录水平的针对生物标志物基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的所述生物标志物编码蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括所述生物标志物基因在内的多个基因(例如，与腹主动脉瘤相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括所述生物标志物编码蛋白在内的多个蛋白质(例如与腹主动脉瘤相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与腹主动脉瘤的生物标志物同时检测，可大大提高腹主动脉瘤诊断的准确率。在本发明的具体实施例中，所述的芯片为蛋白质芯片。
25.本发明提供了用于诊断受试者中的腹主动脉瘤的试剂盒，该试剂盒用于确定生物标志物的水平(其中序列任选地包含尿嘧啶以代替所公开的胸腺嘧啶中的一种、多于一种或全部)及其组合。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断腹主动脉瘤的生物标志物或生物标志物组的存在的材料和试剂。例如，在一个实施方案中，该试剂盒可以包括与生物标志物特异性杂交的试剂。这类试剂可以是适于检测生物标志物的形式的核酸分子，例如，探针或引物。该试剂盒可以包括用于进行测定以检测一种或多种生物标志物的试剂，例如，可以用于在qpcr反应中检测一种或多种生物标志物的试剂。该试剂盒同样可以包括用于检测一种或多种生物标志物的抗体。
26.在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何确定样品中一种或多种生物标志物的水平，或如何将样品中一种或多种生物标志物的水平与受试者的腹主动脉瘤状态相关联的信息或指导。
27.在另一个实施方案中，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有生物标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的生物标志物。
28.术语“高通量测序平台”是指illumina，lifetechnologies，roche等目前采用的所谓的平行化合成测序或连接测序平台，高通量测序方法还可包括纳米孔测序方法诸如由oxford nanopore technologies商业化的，电子检测方法诸如由life technologies商业化的ion torrent技术以及基于单分子荧光的方法，例如由pacific biosciences商业化的。
29.本发明第三方面提供了一种筛选治疗腹主动脉瘤的药物的方法，所述的方法包括：1）在测试组中，向待测对象施用待测试药物，检测测试组中来源于所述对象的样品中生物标志物的表达水平v1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中生物标志物的表达水平v2；2）比较上一步骤检测得到的水平v1和水平v2，从而确定所述测试化合物是否是治疗腹主动脉瘤的候选药物；所述的生物标志物选自lgmn、erbb3、dll1中的一个或多个。
30.本发明第四方面提供了生物标志物在构建腹主动脉瘤的诊断装置中的用途，所述的诊断装置包括诊断指标输入模块和腹主动脉瘤状态评估模块；其中，所述诊断指标输入模块至少用于执行以下操作：获取受试体生物标志物表达水平，所述生物标志物包括lgmn、erbb3、dll1中的一个或多个；所述腹主动脉瘤状态评估模块至少用于执行以下操作：将所述诊断指标输入模块获取的生物标志物表达水平输入诊断模型得出得分值；将所获得的得分值与预先设定的诊断模型的截断值比较，输出受试体腹主动脉瘤状态的评估结果；所述腹主动脉瘤状态包括诊断模型预先设定的腹主动脉瘤相关状态。
31.术语
ꢀ“
表达的水平
”ꢀ
或
ꢀ“
表达水平
”ꢀ
一般可互换使用，通常指生物样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。
ꢀ“
表达
”ꢀ
通常指基因编码的信息转化为在细胞中存在和运转的结构的过程。因此，本文所用的基因的
ꢀ“
表达
”ꢀ
指转录为多核苷酸、翻译为蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录的多核苷酸、翻译的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的片段也视为表达的，无论它们是源自通过选择性剪接产生的转录物或降解的转录物，还是源自蛋白质的翻译后加工（例如，通过蛋白水解）。
32.本发明第五方面提供了一种用于诊断受试者是否患有腹主动脉瘤的方法，包括步骤：1）获得受试者或对照的血液样本，2）确定所述受试者的血液样本中以下的蛋白的表达水平：人豆荚蛋白、受体酪氨酸蛋白激酶 erbb
‑
3和/或delta样蛋白1；3）将受试者中所述蛋白的表达水平和对照中所述蛋白的表达水平进行比较；4）确定所述受试者是否患有腹主动脉瘤、或评价患有腹主动脉瘤的风险。
33.如本文中在诸如
ꢀ“
a和/或b
”ꢀ
的短语中使用的术语
ꢀ“
和/或
”ꢀ
旨在包括a和b两者；a或b；a(单独) ；以及b(单独)。同样地，在诸如
ꢀ“
a、b和/或c
ꢀ”ꢀ
的短语中使用的术语
ꢀ“
和/或
”ꢀ
旨在涵盖以下实施方案的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独) ；b(单独)；以及c(单独)。
34.在具体的实施方案中，和对照中的蛋白水平相比较，人豆荚蛋白的表达水平升高，指示所述受试者患腹主动脉瘤。
35.在具体的实施方案中，和对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低，指示所述受试者患腹主动脉瘤：受体酪氨酸蛋白激酶erbb
‑
3、delta样蛋白1。
附图说明
36.图1是ct检查结果图，其中，图1a是对腹主动脉瘤患者进行ct检查结果图，图1b是对健康受试者的腹部进行ct检查结果图；图2是单个标志物诊断腹主动脉瘤的roc曲线图，其中，图2a是人豆荚蛋白诊断腹主动脉瘤的roc曲线图，图2b是受体酪氨酸蛋白激酶erbb
‑
3诊断腹主动脉瘤的roc曲线图，图2c是delta样蛋白1诊断腹主动脉瘤的roc曲线图；图3是人豆荚蛋白、受体酪氨酸蛋白激酶erbb
‑
3、delta样蛋白1组合诊断腹主动脉瘤的roc曲线图。
具体实施方式
37.下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本公开。本领域技术人员公知，在不悖离本公开精神的情况下，可以对本公开做出许多修改，这样的修改也落入本公开的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
38.实施例1.患者腹部ct（电子计算机断层扫描）检查所有受试者均通过腹部ct检查，确定是否患有腹主动脉瘤。检查结果如下：1. ct影像学改变对腹主动脉瘤患者（图1a）和对照（图1b）的腹部进行ct检查，结果显示腹主动脉瘤患者腹主动脉明显扩张。
39.实施例2. 腹主动脉瘤患者的血液收集及分析1. 实验目的获取腹主动脉瘤患者的血浆样品；与对照血浆蛋白表达进行比较。对照为无腹主动脉瘤的健康受试者。
40.2. 材料与试剂（1）蛋白芯片：使用美国raybiotech 公司的gsh
‑
caa
‑
440芯片检测受试者血液中的440种蛋白因子。
41.3. 实验方法（1）样本收集流程：使用edta抗凝的采血管收集腹主动脉瘤患者和对照的血液样品，4度条件下2 000 g离心15min，吸取上清
‑
80℃冰箱保存。
42.（2）实验过程：抗体芯片室温封闭1小时后，每孔加入60μl三倍稀释的血浆，4℃孵育过夜。彻底洗涤后，加入生物素标记的抗体2小时，再次洗涤。然后，加入80μl cy3
‑
结合链霉亲和素，然后在室温下孵育1小时。再次洗涤之后，使用微阵列扫描仪（innoscan 300，innoscan 300，法国）在cy3 的适当波长下扫描信号，并使用 q
‑
analyzer 软件（raybiotech，peachtree corners，georgia，usa）分析荧光强度数据。
43.（3）数据分析：来自阵列扫描仪的原始数据以图像（.tif 文件）和点强度（excel.xls 文件；微软，西雅图，华盛顿州）的形式提供，并使用 raybiotech 软件通过背景去除和芯片间标准化进行处理。进一步分析归一化数据，将不同组中的dep定义为相对于对照组的倍数变化>1.5或<0.667的蛋白质（p值<0.05（t检验）和荧光值>150）。
44.4. 蛋白鉴定结果：收集22例确诊的腹主动脉瘤患者血浆样品，通过蛋白芯片检测440个因子的表达情况。
45.与10例未患腹主动脉瘤的对照样品比对，筛选出变化倍数在1.5倍以上且独立样本t检验p < 0.05的差异蛋白作为诊断标志物。结果显示，腹主动脉瘤患者共筛选出差异蛋白37个，10个蛋白升高，27个蛋白降低。本发明所涉及标志物表达情况如表1所示。
46.表1. 腹主动脉瘤患者和对照差异表达的血液蛋白标志物
实施例3. 血液蛋白质标记物在aaa诊断中的应用为进一步证实所筛选的蛋白标志物在aaa诊断中的灵敏度与特异性，针对表1中的蛋白，采用市售抗体，本发明绘制了上述标志物在区分腹主动脉瘤患者和健康对照的roc曲线。具体步骤如下：收集了20例腹主动脉瘤患者和10例健康对照受试者的血浆样本，两组性别和年龄匹配，采用盲法，使用elisa法测试样本中的蛋白表达水平。经roc曲线分析，表1中的人豆荚蛋白的auc值为0.861，灵敏度为68.18%、特异性为90%；受体酪氨酸蛋白激酶 erbb
‑
3的auc值为0.832，灵敏度为54.55%、特异性为100%；delta样蛋白1的auc值为0.795，灵敏度为77.27%、特异性为80%（如图2所示）。将这三个蛋白两两组合的auc值如下：人豆荚蛋白和受体酪氨酸蛋白激酶erbb
‑
3组合的auc值为0.908、人豆荚蛋白和delta样蛋白1组合的auc值为0.939、受体酪氨酸蛋白激酶 erbb
‑
3和delta样蛋白1组合的auc值为0.848。而将三个蛋白人豆荚蛋白、受体酪氨酸蛋白激酶 erbb
‑
3、delta样蛋白1组合使用时对腹主动脉瘤的诊断具有良好的诊断效果，roc曲线下面积auc值为0.948，灵敏度100%、特异性90%（如图3所示）。
47.上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。
48.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。
49.此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。