一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法。


背景技术：

2.转染(transfection)是体外或体内细胞经过相应的生物技术处理，主动或被动导入外源dna或rna片段，继而在细胞内进行蛋白表达或获得新表型的过程(如rnai)。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染，前者外源dna/rna不整合到宿主染色体中，宿主细胞中可同时存在多拷贝核酸，因此表达水平高，且通常只能维持数天表达，后者亦称作稳定转染，外源dna既可以整合到宿主染色体中，也可能作为游离体存在。
3.现代的转染方法分为：化学法、物理法和病毒转染法。其中，化学法包括：磷酸钙法、deae-葡氨聚糖法和脂质体法等；物理法包括：显微注射、电穿孔和基因枪等方法；化学法除磷酸钙法，其它类型均需要借助商品化转染试剂，该类试剂由于价格高，用量大，导致单次转染成本较高，另外，商品化转染试剂只能对细胞级别样本进行转染，而对组织无效；而物理法则需要显微注射仪、电转染仪、基因枪等昂贵仪器；病毒转染法需要商品化病毒或自包装病毒，操作流程繁琐，并且现有腺病毒类转染载体等对果蝇细胞组织无效。
4.同时，现有技术中，常规转染过程一般只对生长期的细胞级别样品进行操作，所以需要高标准的无菌细胞培养环境，并且对增殖分裂能力差的突变体细胞株和体积较大的组织团块几乎无效，进一步增加了转染成本。


技术实现要素：

5.本发明提供的一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
6.为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：
7.一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，包括以下步骤：
8.s1果蝇幼虫组织器官的制备：取若干只果蝇幼虫为一组，将果蝇幼虫至于pbst中反复清洗数次，去除体表外污垢和污染物，然后在培养皿中滴入灭菌pbs清洗液，在清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染，截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺以及它们所依附的表皮；
9.实验中可使用普通饲养条件下的果蝇三龄幼虫，如在无菌或减菌条件下饲养能够减小意外污染概率。
10.s2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，加入转染混合液a，在摇床上慢速转染；然后吸净转染混合液a，并使用pbs快速清洗，再加入预培养液b，25℃培养4～6小时；将预培养液b更换为全培养液c，进行培养；一般每孔可培养并转染5只以内的幼虫组织器官；
11.s3转染检测：收获经步骤s2转染后的组织器官，用甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果；
12.其中，转染混合液a的制备方法按如下比例：向100ul转染混合液母液中加入1ul 5％的洋地黄苷浓储液和200ng待转染质粒，所述转染混合液母液的主体为shields and sang m3insect medium昆虫培养基，每1ml培养基中添加10ul 200mm的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mm丙酮酸钠，另外每1ml转染混合液母液中还添加1ug胃蛋白酶抑制剂、10ug抑肽酶和1ug亮抑酶肽；
13.昆虫培养基分装成1ml和丙酮酸钠浓储-20℃冻存，使用前溶化至室温；谷氨酰胺和三种蛋白酶抑制剂浓储液冻分装后存于-80℃，临时使用时少量转存至-20摄氏度，一个月内使用，过期丢弃；60％乳酸钠储存液4摄氏度保存；
14.洋地黄苷浓储液保存至-80℃条件下，-20℃3个月有效；
15.预培养液b的制备方法按如下比例：向100ul shields and sang m3 insect medium昆虫培养基中加入200ng待转染质粒；
16.全培养液c的制备方法按如下比例：向主体为shields and sang m3 insect medium昆虫培养基中加入培养液，其中，每900ul培养基中添加10ul 200mm的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mm丙酮酸钠、10ul 100x(最好能有一个确定的浓度，专利中基本不允许有这种模糊的概念)的青霉素和链霉素双抗浓储液和100ul胎牛血清。
17.全培养液放置于4℃冰箱，使用前平衡至室温，用后再放回冷藏即可。
18.其中，本发明中，所述步骤s1中，每组果蝇幼虫数量不超过5只，用pbst反复清洗果蝇幼虫外表3次，在含有灭菌pbs的培养皿中解剖。
19.所述步骤s2中，解剖后果蝇组织器官使用pbs快速清洗两次，每次清洗过程如下：利用pbs清洗液进行10次逐滴清洗，且每两次清洗并转移组织器官后，对镊子进行火焰消毒并在空气中冷却待用。
20.具体操作可以为：在培养皿中滴入10滴pbs，其中，每滴为60-80ul左右，解剖完成后，再逐滴清洗果蝇幼虫各组织器官，使得果蝇幼虫各组织器官表面和间隙中的可能污染物尽量被洗净，操作用镊子酒精灯火焰消毒冷却后使用，且每两滴清洗后，镊子需消毒一次。
21.进一步的，所述灭菌pbst清洗液中的制备方法为在每100mlpbs添加100ul tritonx100。
22.本发明中，所述pbs的制备按如下比例：取磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l，121℃高温高压灭菌20分钟，冷却后备用。
23.优选的，所述步骤s2中，转染混合液a的加入量至少为50ul，在摇床上慢速转染的时间为30min-1h。
24.优选的，所述步骤s2中，全培养液c的使用每12小时换液一次，且换液至少3次，保障全培养液c的培养总时间达到48小时，并于每次换液时用室温pbs至少清洗一次。
25.进一步的，所述步骤s2中，混合转染液a与预培养液b中转染arm-gal4 100ng和uas-gpi-gfp 100ng质粒，总转染质粒质量为200ng。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.1、本发明利用化学细胞膜穿孔剂洋地黄苷(digitonin)辅助以其它蛋白酶抑制、辅助培养试剂进行果蝇幼虫组织器官细胞膜、核膜的直接打孔穿透，使待表达质粒直接渗
透到细胞核内进行表达，无需依赖细胞分裂来进行转染表达，因此适用于有增殖和分裂障碍的细胞系和果蝇品系，可以进行果蝇幼虫组织器官级别转染，无需消化成单细胞；
28.2、本发明的培养基中，增加能量代谢物质谷氨酰胺、丙酮酸和乳酸钠，使果蝇幼虫组织细胞活力增强，有利于质粒表达；
29.3、本发明增加的中间换液多次步骤使得该方法可应用于有菌环境，大幅度提高了应用的适用范围和减少环境成本；
30.4、本发明增加有预培养液b步骤，可以以增强质粒转染渗入效；
31.5、本发明转染效率较高，根据免疫荧光检测，成虫盘和脑的平均转染效率提高1/3，唾液腺平均转染效率提高2/3；
32.6、成本低廉，全套试剂价格5000元左右，但可转染超5000样本。
附图说明
33.图1为本发明中转染48小时后的果蝇幼虫脑器官；
34.图2为图1中a部的放大示意图；
35.图3为果蝇幼虫唾液腺的转染效果。
具体实施方式
36.以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
37.实施例
38.制备pbs缓冲液：取磷酸二氢钾(kh2po4)：0.27g，磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.42g，氯化钠(nacl)：8g，氯化钾(kcl)0.2g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l，121摄氏度高温高压灭菌20分钟，冷却后备用。
39.制备灭菌pbst清洗液：每100mlpbs缓冲液中添加100ul tritonx100。
40.制备转染混合液母液：主体为shields and sang m3 insect medium昆虫培养基(sigma)，每1ml培养基中添加10ul谷氨酰胺(200mm)、2ul乳酸钠(60％)、10ul丙酮酸钠(100mm)，另外每毫升母液添加1ug胃蛋白酶抑制剂(pepstatin a)、10ug抑肽酶(aprotinin)和1ug亮抑酶肽(leupeptin)。将培养基分装成1ml和丙酮酸钠浓储-20℃冻存，使用前溶化至室温。谷氨酰胺和三种蛋白酶抑制剂浓储液冻分装后存于-80℃，临时使用时少量转存至-20摄氏度，一个月内使用，过期丢弃。60％乳酸钠储存液4摄氏度保存。
41.制备转染混合液a：100ul转染混合液母液o 1ul 5％的digitonin浓储(洋地黄苷) 总量200ng待转染质粒，digitonin浓储保存至-80℃条件下，-20℃3个月有效。本案例中转染驱动质粒arm-gal4和uas-gpi-gfp各100ng。
42.制备预培养液b：100ul shields and sang m3 insect medium昆虫培养基 总量200ng待转染质粒。
43.制备全培养液c：主体为shields and sang m3 insect medium昆虫培养基，每900ul培养基中添加10ul谷氨酰胺(200mm)、2ul乳酸钠(60％)、10ul丙酮酸钠(100mm)、10ul青霉素链霉素双抗浓储液(100x)和100ul胎牛血清。
44.一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，包括以下步骤：
45.1、实验中可使用普通饲养条件下的果蝇三龄幼虫，如在无菌或减菌条件下饲养能够减小意外污染概率。
46.2、取10条左右三龄果蝇幼虫至含0.1％tritonx-100的灭菌pbst清洗液中，清洗外表3次，保证无明显污垢。
47.3、灭菌pbs清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染。截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺等组织器官，以及它们所依附的表皮。在培养皿中滴入10滴pbs，每滴60-80ul左右，逐滴进行清洗，尽量洗净组织器官表面和间隙中的可能污染物。操作用镊子酒精灯火焰消毒冷却后使用，每转移两滴，消毒一次。
48.4、将清洗干净的果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，每孔可培养并转染5只以内的幼虫组织器官。加入转染混合液a 50ul，摇床上慢速转染30min-1h。
49.5、吸净转染混合液a使用pbs 100ul快速清洗2次，每次数秒即可。
50.6、吸净pbs，加入预培养液b，25℃培养4～6小时。
51.7、更换为200微升全培养液c，之后每12小时换液一次，换液时可用室温pbs清洗一次，以便减少后继污染可能。全培养液放置于4℃冰箱，使用前平衡至室温，用后再放回冷藏即可。共额外换液3次，使培养时间达到48小时以上。
52.8、收获组织器官，甲醛固定，常规免疫荧光染色，观察转染效果。
53.试验例
54.依照本发明上述实施例的转染方法，对果蝇幼虫组织气管进行相应的转染效果监测。
55.如图1所示，转染48小时后的果蝇幼虫脑器官，两视球部分(圆形膨大部分)细胞出现普遍的膜定位gfp表达。转染了两个质粒，一个是表达驱动质粒:armadillo-gal4,其具有泛在表达特性，几乎所有细胞接受后均可表达二元表达驱动因子gal4；另一个质粒是uas-gpi-gfp，驱动因子gal4结合到调控元件5
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uas上能够大量诱导gpi-gfp表达，gpi-gfp是具有磷脂酰肌醇锚定结构域的细胞膜定位gfp，相比核定位或胞质定位gfp更能显示出细胞轮廓和便于区分转染成功的细胞。
56.图2为图1中白色虚线方框内的所示图像的放大部分，能够观测到大量呈现圆圈状细胞膜定位转染成功的细胞。
57.图3b与b’为果蝇幼虫唾液腺的转染效果，转染效果稳定，能够保持2/3以上的细胞转染表达成功，图像中没有绿色荧光细胞膜轮廓的细胞为未转染成功细胞。
58.本发明的转染方法可以直接转染果蝇幼虫组织器官，48h可观测到果蝇成虫盘、脑及唾液腺等组织器官实现外源基因的转染和成功表达。因技术方案实行12小时换液规则，并且果蝇组织器官培养为25℃，因此微生物污的增殖速度远远达不到污染程度，因此本项技术适用于有菌操作环境，无需在细胞间操作。
59.上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。