一种生物催化的高纯度NMN生产工艺的制作方法

一种生物催化的高纯度nmn生产工艺
技术领域
1.本发明涉及酶工程技术领域，具体是指一种生物催化的高纯度nmn生产工艺。


背景技术：

2.nmn全称β
‑
烟酰胺单核苷酸，是人体内长寿蛋白的辅因子nad 的前体之一。进入体内可迅速变成nad ,对人体健康发挥着根本性的影响，主导人体内数百项生命活动，掌控着疾病和衰老的节奏。
3.nad 分子量过大，无法直接口服吸收补充，其体内主要依赖于细胞合成，但合成量很低，并且老年人体内自行组成nad 的水平远远达不到所需水平，大量前沿科学研究表明：nmn可直接促进nad 在体内的自我生成，是补充nad 的最理想管道。补充nmn可有效的提升体内的nad 的含量，并显著减缓生物体的生理衰退，增强能量代谢，延长寿命。近期研究发现，通过调节生物体内nmn的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用。
4.但是目前大部分的nmn来源于化学合成，生产率较低，产品纯度低，含有约50％的手性分子nmn，有毒、难分离、故收率非常低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重。
5.近年来，生物催化技术已用于nmn的生产，这是一种绿色生物转换，对环境污染几乎为零，不产生手性分子nmn，产率高，成本低，是nmn生产技术的一次重大革命。但是它们所设计的合成方法相对比较复杂，且转化率和收率普遍不高。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是解决上述问题，提供一种提供转化率和收率的生物催化的高纯度nmn生产工艺。
7.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种生物催化的高纯度nmn生产工艺，包括以烟酰胺核苷为底物，用含有烟酰胺核苷激酶全293f细胞，进行一步法高效制备β
‑
烟酰胺单核苷酸，表达式为：
[0008][0009]
所述酶氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质。
[0010]
编码seq id no.1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0011]
一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于制备nmn的烟酰胺核苷激酶的基因。
[0012]
一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含用于制备nmn的烟酰胺核苷激酶的基因的重组表达载体。
[0013]
所述宿主细胞为293f细胞。
[0014]
一种制备高纯度nmn的方法，包括以下步骤：
[0015]
s1、构建重组表达载体，
[0016]
s2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，
[0017]
s3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，
[0018]
s4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，
[0019]
s5、离心收取上清，进行hplc反应。
[0020]
所述步骤s3为将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶全293f细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5
‑
6million/ml。
[0021]
所述步骤s4为在培养基中加入50mm烟酰胺核苷，在37℃下，摇动反应4h。
[0022]
采用以上结构后，本发明具有如下优点：全细胞催化剂具有成本低，生产工艺简单等优点。并且利用了合成生物学的手段，将nrk1基因克隆到一个细胞中，并在该基因工程全细胞的催化下，可实施多批次制备nmn，提高了nmn的产量，降低了生产成本；克服了当前化学合成法合成的弊端和现有生物酶法催化的复杂性，提供一种烟酰胺核苷激酶全294f细胞及其生物催化合成nmn工艺，有效降低了反应的复杂性，并能够安全、高效的进行实际生产使用，且可多次重复进行生产原料的使用，进而有效减少实际成本的投入。
附图说明
[0023]
图1是本发明表达质粒图谱。
[0024]
图2是本发明全293f细胞催化合成nmn的结果分析图。
[0025]
图3是本发明10g/l的nmn标准品的分析图。
具体实施方式
[0026]
下面对本发明做进一步的详细说明。
[0027]
结合所有附图，一种生物催化的高纯度nmn生产工艺，包括以烟酰胺核苷为底物，用含有烟酰胺核苷激酶全293f细胞，进行一步法高效制备β
‑
烟酰胺单核苷酸，表达式为：
[0028][0029]
所述酶氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质。
[0030]
编码seq id no.1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0031]
一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于制备nmn的烟酰胺核苷激酶的基因。
[0032]
一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含用于制备nmn的烟酰胺核苷激酶的基因的重组表达载体。
[0033]
所述宿主细胞为293f细胞。
[0034]
一种制备高纯度nmn的方法，包括以下步骤：
[0035]
s1、构建重组表达载体，
[0036]
s2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，
[0037]
s3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，
[0038]
s4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，
[0039]
s5、离心收取上清，进行hplc反应。
[0040]
所述步骤s3为将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶全293f细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5
‑
6million/ml。
[0041]
所述步骤s4为在培养基中加入50mm烟酰胺核苷，在37℃下，摇动反应4h。
[0042]
本发明在具体实施时，实施例一酶基因表达体系的构建
[0043]
利用限制酶切位点ecorv和bspei将nrk1基因构建到pbsps质粒载体上面，形成重组质粒pbsps
‑
nrk1
‑
his。将构建好的重组质粒用hindiii酶线性化，将线性化的重组质粒使用pei转染到293f细胞中，转染3天后，把转染的293f细胞均分到96孔板中，使用2ug/ml的puro进行筛选。在96孔板中筛选2周后，将存活的单克隆细胞株上清，使用anti
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his的二抗进行elisa检测，筛选到高表达nkr1的单克隆293f细胞株。进行大量扩繁，最终上摇瓶进行悬浮培养。
[0044]
实施例二全293f细胞催化合成nmn
[0045]
将将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶(nrk1)全293f细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5
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6million/ml。在培养基中加入50mm烟酰胺核苷(nr)，37℃，摇动反应4h。离心收取上清，进行hplc反应。通过与标准品对照，可以得到13.21g/l的nmn生产量，转化效率在87.4％。重新收集细胞并用无血清培养基进行培养后，重复进行催化合成nmn，通过与标准品对照，可以得到12.54g/l的nmn生产量，转化效率在82.7％。说明该细胞可以重复使用。
[0046]
通过以上实验结果能够进一步说明本发明能够安全、高效的进行实际生产使用，且有效减少实际成本的投入。
[0047]
本发明所述的全293f稳转细胞包含的烟酰胺核苷激酶(nrk1)的氨基酸序列(seq id no：1)如下：
[0048]
mktfiigisgvtnsgkttlaknlqkhlpncsvisqddffkpeseietdkngflqydvlealnmekmmsaiscwmesarhsvvstdqesaeeipiliiegfllfnykpldtiwnrsyfltipyeeckrrrstrvyqppdspgyfdghvwpmylkyrqemqditwevvyldgtkseedlflqvyedliqelakqkclqvta。
[0049]
本发明所述的全293f稳转细胞包含的烟酰胺核苷激酶(nrk1)的核苷酸序列(seq id no：2)如下：atgaaaacatttatcattggaatcagtggtgtgacaaacagtggcaaaacaacactggctaagaatttgcagaaacacctcccaaattgcagtgtcatatctcaggatgatttcttcaagccagagtctgagatagagacagataaaaatggatttttgcagtacgatgtgcttgaagcacttaacatggaaaaaatgatgtcagccatttcctgctggatggaaagcgcaagacactctgtggtatcaacagaccaggaaagtgctgaggaaattcccattttaatcatcgaaggttttcttctttttaattataagccccttgacactatatggaatagaagctatttcctgactattccatatgaagaatgtaaaaggaggaggagtacaagggtctatcagcctccagactctccgggatactttgatggccatgtgtggcccatgtatctaaagtacagacaagaaatgcaggacatcacatgggaagttgtgtacctggatggaacaaaatctgaagaggacctctttttgcaagtatatgaagatctaatacaagaactagcaaagcaaaagtgtttgcaagtgacagcataa。
[0050]
本发明的工作原理：全细胞催化剂具有成本低，生产工艺简单等优点。并且利用了合成生物学的手段，将nrk1基因克隆到一个细胞中，并在该基因工程全细胞的催化下，可实施多批次制备nmn，提高了nmn的产量，降低了生产成本。
[0051]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。