一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用
技术领域
1.本发明涉及微生物农药技术领域域，具体是一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用。
背景技术：
2.烟碱(nicotine)，又名尼古丁，是从烟草中提取的主要生物碱，属于高毒的化合物，水溶性好，在环境中不易降解，不仅污染环境、打破生态平衡，还严重威胁人类身体健康，具有致畸、致癌等多种不良反应。环境中烟碱的污染主要来源于作为农药的使用、烟草生产和加工活动中产生的大量高浓度废弃物。在过去的十年间，烟碱类杀虫剂是作物保护中增长最快、使用最广泛的杀虫剂之一。据报道，全球每年生产670万吨烟草，中国是最大的生产烟草的国家(39.6％)，预计烟草业每年将产生300,274t的烟草废弃物。烟碱在医药行业、烟草行业、农业行业、化工行业的利用价值极大，创造了巨大的经济利益，也带来多方面的危害。烟碱有剧毒，量大时能抑制中枢神经系统，使呼吸停止和心脏麻痹。中国是烟草大国，烟碱是衡量烟草品质的重要因素，由于种植方法上的问题，造成上部烟叶的烟碱含量普遍偏高，工业可用性降低，造成了每年上千万元的资金损耗。如何将烟草的烟碱控制在一个可用的范围内，已成为全国烟草行业有待解决的热门课题之一。烟碱型杀虫剂使用和烟草生产不仅影响人类健康，还污染环境。总之，烟碱已经对我们的赖以生存的生态环境和人体健康造成了极大的威胁，对烟碱类农药的使用和烟草废弃物的处理必须引起我们的重视。
3.目前，虽然可以通过传统的改进农业栽培技术，物理化学手段等途径降解烟碱，但是这些方法都具有一定的局限性和不足之处，其操作性、适应性差效果不是很理想，近些年来，随着人们环境意识的增强，化学试剂的应用逐步受到限制，除了继续探索低毒，低残留，高选择性的化学试剂外，人们更关注开发生防制剂以作为化学试剂的补充或替代品。因此，研究利用微生物和酶降解烟碱自然成为重点和焦点问题。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，降解烟碱mixta calida菌的制备方法为：将niuj1菌接种到试管烟碱液体培养基中(每管装5ml)，培养基配方为：k2hpo413.3g， kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
·
7h2o0.4g，cacl2
·
2h2o0.2g，feso4
·
7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至 100ml；将niuj1接种到培养基上，于37℃摇床培养培养时间12h，转速为220rpm，获得试管种；
7.将试管种转接于新鲜的烟碱液体培养基试管中，37℃摇床培养培养时间12h，转速为 220rpm，获得活性较强菌液。
－0.5(a236 a282)]
×
100
×
100/[w(1－水％)
×
34.3
×
1000]，其中1.059为矫正系数，w为干样重，34.3为烟碱的吸光系数(1000ml中含有1g烟碱溶液的吸光度)。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0021]
本发明通过多批次降解活性试验确定其活性后，对菌株进行形态学、生理生化及分子鉴定，确定为mixta calida菌革兰氏阴性菌，菌株主要形态特征为：在lb平板培养基上菌落呈圆形，饱满，表面湿润光滑，菌苔乳白色。在扫描电子显微镜下观察形态为杆状细菌、有鞭毛的革兰氏阴性菌，对烟碱具极高降解活性。
具体实施方式
[0022]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]
本发明实施例中，一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，降解烟碱mixta calida 菌的制备方法为：将niuj1菌接种到试管烟碱液体培养基中(每管装5ml)，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml， ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
·
7h2o0.4g，cacl2
·
2h2o0.2g，feso4
·
7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl 定容至100ml；将niuj1接种到培养基上，于37℃摇床培养培养时间12h，转速为220rpm，获得试管种；
[0024]
将试管种转接于新鲜的烟碱液体培养基试管中，37℃摇床培养培养时间12h，转速为 220rpm，获得活性较强菌液。
[0025]
降解烟碱mixta calida菌的制备方法还包括：将上述试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装100ml)，液体培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g， cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；于37℃摇床培养培养时间24h，转速为220rpm；
[0026]
将发酵培养物于10000rpm/min离心20分钟，取上清液，用0.22μm滤器过滤得到无菌发酵液。
[0027]
还包括以下制备步骤：
[0028]
步骤一：试管种培养，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min 后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g， cacl2
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2h2o0.2g，feso4
·
7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将niuj1革兰氏阴性菌菌体接种到培养基上，37℃下培养12h，获得试管种；
[0029]
步骤二：液体扩大培养，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min 后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g， cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将试管种接种到500ml 三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，37℃下摇床培养培养时间12h，转速为220rpm。
[0030]
还包括niuj1菌降解烟碱的试验，包括以下流程：
[0031]
流程一：制备试验用菌液，按前述液体扩大培养方法接种培养niuj1菌株。
[0032]
流程二：制备对照用试剂，在测niuj1菌降解烟碱的实验中，对照均采用相应量的烟碱培养基为空白对照。
[0033]
流程三，试验方法，
[0034]
1、将试管种的无菌发酵液以1：1比例接种到50ml三角瓶液体培养基中，每瓶装10ml，不同培养时间取1ml接种了烟碱降解细菌的培养液于10000rpm下离心10min，以加入了烟碱没有接种降解菌的培养液作为对照，同样方法处理，取上清液于酶标仪259nm波长下测各发酵液中烟碱的吸光值；如od值过大，上清液用0.05mol/l盐酸进行稀释；将所测得吸光度值代入烟碱标准曲线所得方程换算出残余烟碱浓度，由此可得出该菌的烟碱降解率；烟碱降解率％＝(初始烟碱含量
‑
发酵液中的烟碱含量)/初始烟碱含量x100％。
[0035]
2、niuj1菌液降解烟叶中烟碱实验，称取5g调制后烟叶碎片(含水率15％～17％)放入三角瓶中，实验组加入等量菌悬液(10％比例接菌)，对照组加入等量无菌水，调节物料水分含量至45％～50％，封口，37℃发酵7d后，取出烟叶，64℃烘干、粉碎，用盐酸提取脱色法测定粉末中烟碱含量；与对照组比较，计算烟叶烟碱降解率，3次重复，每次3瓶；
[0036]
还包括具体测定如下步骤：
[0037]
称取烟叶样品0.03g加入100ml的三角瓶中，加入活性炭0.25、0.5n的盐酸25ml；振荡5min，过滤到容量瓶中(100ml)，用去离子水洗三角瓶、合并滤液并定容摇匀；另取0.5n25ml盐酸加入100ml容量瓶中，定容摇匀，作为空白参比；以空白参比在分光光度计仪器上调读数为零，在3个波长处(236nm；259nm；282nm)分别测定吸光度值；烟碱含量计算公式如下：烟碱％＝1.059
×
[a259－0.5(a236 a282)]
×
100
×
100/[w(1－水％)
×ꢀ
34.3
×
1000]，其中1.059为矫正系数，w为干样重，34.3为烟碱的吸光系数(1000ml中含有1g烟碱溶液的吸光度)。
[0038]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0039]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术领域
1.本发明涉及微生物农药技术领域域，具体是一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用。
背景技术：
2.烟碱(nicotine)，又名尼古丁，是从烟草中提取的主要生物碱，属于高毒的化合物，水溶性好，在环境中不易降解，不仅污染环境、打破生态平衡，还严重威胁人类身体健康，具有致畸、致癌等多种不良反应。环境中烟碱的污染主要来源于作为农药的使用、烟草生产和加工活动中产生的大量高浓度废弃物。在过去的十年间，烟碱类杀虫剂是作物保护中增长最快、使用最广泛的杀虫剂之一。据报道，全球每年生产670万吨烟草，中国是最大的生产烟草的国家(39.6％)，预计烟草业每年将产生300,274t的烟草废弃物。烟碱在医药行业、烟草行业、农业行业、化工行业的利用价值极大，创造了巨大的经济利益，也带来多方面的危害。烟碱有剧毒，量大时能抑制中枢神经系统，使呼吸停止和心脏麻痹。中国是烟草大国，烟碱是衡量烟草品质的重要因素，由于种植方法上的问题，造成上部烟叶的烟碱含量普遍偏高，工业可用性降低，造成了每年上千万元的资金损耗。如何将烟草的烟碱控制在一个可用的范围内，已成为全国烟草行业有待解决的热门课题之一。烟碱型杀虫剂使用和烟草生产不仅影响人类健康，还污染环境。总之，烟碱已经对我们的赖以生存的生态环境和人体健康造成了极大的威胁，对烟碱类农药的使用和烟草废弃物的处理必须引起我们的重视。
3.目前，虽然可以通过传统的改进农业栽培技术，物理化学手段等途径降解烟碱，但是这些方法都具有一定的局限性和不足之处，其操作性、适应性差效果不是很理想，近些年来，随着人们环境意识的增强，化学试剂的应用逐步受到限制，除了继续探索低毒，低残留，高选择性的化学试剂外，人们更关注开发生防制剂以作为化学试剂的补充或替代品。因此，研究利用微生物和酶降解烟碱自然成为重点和焦点问题。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，降解烟碱mixta calida菌的制备方法为：将niuj1菌接种到试管烟碱液体培养基中(每管装5ml)，培养基配方为：k2hpo413.3g， kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至 100ml；将niuj1接种到培养基上，于37℃摇床培养培养时间12h，转速为220rpm，获得试管种；
7.将试管种转接于新鲜的烟碱液体培养基试管中，37℃摇床培养培养时间12h，转速为 220rpm，获得活性较强菌液。
－0.5(a236 a282)]
×
100
×
100/[w(1－水％)
×
34.3
×
1000]，其中1.059为矫正系数，w为干样重，34.3为烟碱的吸光系数(1000ml中含有1g烟碱溶液的吸光度)。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0021]
本发明通过多批次降解活性试验确定其活性后，对菌株进行形态学、生理生化及分子鉴定，确定为mixta calida菌革兰氏阴性菌，菌株主要形态特征为：在lb平板培养基上菌落呈圆形，饱满，表面湿润光滑，菌苔乳白色。在扫描电子显微镜下观察形态为杆状细菌、有鞭毛的革兰氏阴性菌，对烟碱具极高降解活性。
具体实施方式
[0022]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]
本发明实施例中，一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，降解烟碱mixta calida 菌的制备方法为：将niuj1菌接种到试管烟碱液体培养基中(每管装5ml)，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml， ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl 定容至100ml；将niuj1接种到培养基上，于37℃摇床培养培养时间12h，转速为220rpm，获得试管种；
[0024]
将试管种转接于新鲜的烟碱液体培养基试管中，37℃摇床培养培养时间12h，转速为 220rpm，获得活性较强菌液。
[0025]
降解烟碱mixta calida菌的制备方法还包括：将上述试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装100ml)，液体培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g， cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；于37℃摇床培养培养时间24h，转速为220rpm；
[0026]
将发酵培养物于10000rpm/min离心20分钟，取上清液，用0.22μm滤器过滤得到无菌发酵液。
[0027]
还包括以下制备步骤：
[0028]
步骤一：试管种培养，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min 后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
·
7h2o0.4g， cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将niuj1革兰氏阴性菌菌体接种到培养基上，37℃下培养12h，获得试管种；
[0029]
步骤二：液体扩大培养，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min 后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g， cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将试管种接种到500ml 三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，37℃下摇床培养培养时间12h，转速为220rpm。
[0030]
还包括niuj1菌降解烟碱的试验，包括以下流程：
[0031]
流程一：制备试验用菌液，按前述液体扩大培养方法接种培养niuj1菌株。
[0032]
流程二：制备对照用试剂，在测niuj1菌降解烟碱的实验中，对照均采用相应量的烟碱培养基为空白对照。
[0033]
流程三，试验方法，
[0034]
1、将试管种的无菌发酵液以1：1比例接种到50ml三角瓶液体培养基中，每瓶装10ml，不同培养时间取1ml接种了烟碱降解细菌的培养液于10000rpm下离心10min，以加入了烟碱没有接种降解菌的培养液作为对照，同样方法处理，取上清液于酶标仪259nm波长下测各发酵液中烟碱的吸光值；如od值过大，上清液用0.05mol/l盐酸进行稀释；将所测得吸光度值代入烟碱标准曲线所得方程换算出残余烟碱浓度，由此可得出该菌的烟碱降解率；烟碱降解率％＝(初始烟碱含量
‑
发酵液中的烟碱含量)/初始烟碱含量x100％。
[0035]
2、niuj1菌液降解烟叶中烟碱实验，称取5g调制后烟叶碎片(含水率15％～17％)放入三角瓶中，实验组加入等量菌悬液(10％比例接菌)，对照组加入等量无菌水，调节物料水分含量至45％～50％，封口，37℃发酵7d后，取出烟叶，64℃烘干、粉碎，用盐酸提取脱色法测定粉末中烟碱含量；与对照组比较，计算烟叶烟碱降解率，3次重复，每次3瓶；
[0036]
还包括具体测定如下步骤：
[0037]
称取烟叶样品0.03g加入100ml的三角瓶中，加入活性炭0.25、0.5n的盐酸25ml；振荡5min，过滤到容量瓶中(100ml)，用去离子水洗三角瓶、合并滤液并定容摇匀；另取0.5n25ml盐酸加入100ml容量瓶中，定容摇匀，作为空白参比；以空白参比在分光光度计仪器上调读数为零，在3个波长处(236nm；259nm；282nm)分别测定吸光度值；烟碱含量计算公式如下：烟碱％＝1.059
×
[a259－0.5(a236 a282)]
×
100
×
100/[w(1－水％)
×ꢀ
34.3
×
1000]，其中1.059为矫正系数，w为干样重，34.3为烟碱的吸光系数(1000ml中含有1g烟碱溶液的吸光度)。
[0038]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0039]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
