生产己二胺的重组质粒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程领域，具体涉及生产己二胺的重组质粒及其应用。


背景技术：

2.随着对医药化学品、材料单体、合成聚合物的需求的逐年增加，由此引起的原料枯竭、环境污染、高成本等问题日益严重。微生物介导的化学生产的出现将提供从依赖矿物燃料到可持续的社会的发展机会。
3.体内碳链延长则是一种有巨大潜力的途径，可以用来合成不同链长的同类酸类、醇类物质，这些都是生物燃料和材料的重要组成物质，且具有从可再生且廉价的原材料生产生物基产品的巨大价值。
4.尼龙是最常见的聚酰胺材料之一，其材料单体己二胺(hexamethylene diamine)的合成是“卡脖子”技术，传统从己二睛的生产技术将产生大量的温室气体，且由于对化石油的依赖使得生产不可再生。因此，从可再生碳源微生物生产化学物质和材料对于建立可持续的化学工业变得至关重要。在过去的几十年里，生物、化学的组合方法已用于生产越来越多的化学药品，l
‑
赖氨酸是一种重要的商品氨基酸，在全球范围内具有数百万吨的生产能力，可以通过基因工程改造的谷氨酸棒杆菌或重组大肠杆菌通过微生物发酵来生产。
5.目前基于己二胺的生物合成法仅有alexander f.yakunin教授以己二酸为底物，通过脱羧转氨实现己二胺的生产。但该路径依旧产量低下，受到底物己二酸的生产能力的限制。另外，专利cn112079725a公开了一种生产己二胺的方法：将氨气、氢气与己内酰胺混合气化后，得到混合气；向所得混合气中加入催化剂，进行催化氨化反应和催化加氢反应；然后，对反应所得物料进行冷凝分离得到反应液，将所得反应液进行蒸馏，得到己二胺。虽然该方法在一定程度上简化了生产步骤，但是其工艺还是较为繁琐，添加物料较多，工艺对温度要求较高。
6.综上，缺乏一种高产的己二胺的生物合成法，降低成本的同时更加绿色环保，实现生物基化学材料的生产。


技术实现要素：

7.本发明为了解决上述问题，本发明提供了两组产己二胺的重组质粒和两种产己二胺的基因工程菌，同时提供两组重组质粒组合物以及对应基因工程菌的构建方法，提供两组重组质粒以及基因工程菌在细胞发酵、细胞催化、酶催化生产己二胺的用途。
8.本发明目的之一在于提供一种能辅助生产己二胺工程菌的重组质粒，所述重组质粒为prlabcd重组质粒，所述重组质粒包括raip基因、leua基因、leub基因，leuc基因和leud基因。
9.具体的，所述raip基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
10.具体的，所述prlabcd重组质粒的核苷酸序列如seq id no：2所示。
11.本发明目的之二在于提供上述prlabcd重组质粒的制备方法，具体技术方案如下：
12.上述prlabcd重组质粒的制备方法，具体步骤：
13.(1)设计引物：
14.raip
‑
f:cggaattcgatggagcacctggcagact；
15.raip
‑
r:caactgcagttacagttcgtccttggtatgctcg；
16.leuabcd
‑
f:cgagactccatatgagccagcaagtcattattttcg；
17.leuabcd
‑
r:ccgctcgagttaattcataaacgcaggttg；
18.(2)合成目的基因raip，leuabcd以大肠杆菌的总dna为模板，进行pcr扩增；
19.(3)纯化pcr产物，连接到pet21a载体，得到所述prlabcd重组质粒。
20.本发明目的之三在于提供一种生产己二胺工程菌的重组质粒组合物，具体技术方案如下：
21.一种生产己二胺工程菌的重组质粒组合物，所述重组质粒组合物由上述技术方案中的任一prlabcd重组质粒和pkv重组质粒组成，所述pkv重组质粒包括kivd基因和vfl基因。
22.其中，pkv重组质粒构建过程中，设计的引物为：
23.kivd
‑
bamhi
‑
f:cgcggatccgatgtataccgtgggtgactatc，
24.kivd
‑
sali
‑
r：acgcgtcgacttagctcttattttgttcggc，
25.vfl
‑
ndei
‑
f：cgagactccatatgaataaaccccaatcatgggaagc，
26.vfl
‑
xhoi
‑
r：ccgctcgagttacgcgacctcggcgaaca。
27.具体的，所述kivd基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
28.具体的，所述vfl基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。
29.具体的，所述pkv重组质粒的核苷酸序列如seq id no：5所示。
30.本发明目的之四在于保护上述重组质粒组合物制备得到的能产生己二胺的基因工程菌lrkv。
31.本发明目的之五在于提供一种利用上述方案中的的重组质粒组合物制备己二胺的方法，具体步骤包括：
32.1)将所述重组质粒组合物转入大肠杆菌bl21中得到基因工程菌lrkv；
33.2)将赖氨酸作为发酵底物与所述基因工程菌lrkv培养，得到己二胺。
34.具体的，步骤2)中加入2g/l丙氨酸及2g/l谷氨酰胺作为胺供体。
35.具体的，所述赖氨酸含量为5g/l。
36.具体的，得到的己二胺含量为3.62～6.65g/l。
37.本发明目的之六在于提供另外一种生产己二胺工程菌的重组质粒组合物，具体技术方案如下：
38.一种生产己二胺工程菌的重组质粒组合物，所述重组质粒组合物由上述技术方案中的任一prlabcd重组质粒和pad重组质粒组成，所述pad重组质粒包括kdca基因和dat基因。
39.其中，pad重组质粒构建过程中，设计的引物为：
40.kdca
‑
bamhi
‑
f:cgcggatccgatgtatacagtaggagactacctattag，
41.kdca
‑
sali
‑
r:gcgcgtcgacttatttgttttgttcggca，
42.dat
‑
ndei
‑
f:ccggcctccatatgaaagtattagttaatggaaggc，
43.dat
‑
xhoi
‑
r:ccgctcgagttaggaaatggacgcagcct。
44.具体的，所述kdca基因的核苷酸序列如seq id no：6所示。
45.具体的，所述dat基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。
46.具体的，所述pad重组质粒的核苷酸序列如seq id no：8所示。
47.本发明目的之七在于提供一种制备己二胺的方法，具体技术方案如下：
48.一种利用上述方案中的的重组质粒组合物制备己二胺的方法，其特征在于，具体步骤包括：
49.(1)将所述重组质粒组合物转入大肠杆菌bl21中得到基因工程菌lrad；
50.(2)将赖氨酸作为发酵底物与所述基因工程菌lrad培养，得到己二胺。
51.具体的，步骤(2)中加入2g/l丙氨酸及2g/l谷氨酰胺作为胺供体。
52.具体的，所述赖氨酸含量为5g/l
‑
100g/l。
53.具体的，得到的己二胺含量为2.18～3.32g/l。
54.本发明的有益之处在于：本发明通过代谢工程手段，优化催化方法使得细胞产量增加，酶的定向突变使得产物专一性增加，胺供体再生系统的构建使得细胞活性增加，最终得到己二胺的高产菌株，lrad菌株能在发酵中生产2.18～3.32g/l的己二胺，lrkv菌株能在发酵中生产3.62～6.65g/l的己二胺。
附图说明
55.图1为本发明的prlabcd重组质粒示意图；
56.图2为本发明的pkv重组质粒示意图；
57.图3为本发明pad重组质粒示意图；
58.图4为raip电泳图；
59.图5为leuabcd电泳图；
60.图6为kivd电泳图；
61.图7为vfl电泳图；
62.图8为kdca电泳图；
63.图9为dat电泳图；
64.图10为lrad菌株的pcr鉴定图；
65.图11为lrad
‑
lcms图谱；
66.图12为lrkv
‑
lcms图谱；
67.图13为本发明工程菌株的发酵性能初步鉴定图；
68.图14为本发明的己二胺的双阶段摇瓶发酵图；
69.图15为本发明的己二胺的反应器发酵合成图。
具体实施方式
70.下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
71.本发明的基本技术构思是：利用具有
–
nh2官能团的赖氨酸衍生的α
‑
酮酸作为leuabcd催化的碳链延伸的底物，通过异源表达不同转胺脱羧组合酶类，筛选出产己二胺菌株。通过代谢工程手段，优化催化方法使得细胞产量增加，酶的定向突变使得产物专一性增加，胺供体再生系统的构建使得细胞活性增加，最终得到己二胺的高产菌株。
72.实施例1 prlabcd重组质粒及其制备方法
73.本实施例提供一种能辅助生产己二胺工程菌的重组质粒，重组质粒为prlabcd重组质粒，如图1所示，重组质粒包括raip基因、leua基因、leub基因，leuc基因和leud基因，其中raip电泳图如图4所示，leuabcd电泳图如图5所示。
74.具体的，所述raip基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
75.具体的，所述prlabcd重组质粒的核苷酸序列如seq id no：2所示。
76.上述prlabcd重组质粒的制备方法，具体技术方案如下，首先，设计引物：
77.raip
‑
f:cggaattcgatggagcacctggcagact；
78.raip
‑
r:caactgcagttacagttcgtccttggtatgctcg；
79.leuabcd
‑
f:cgagactccatatgagccagcaagtcattattttcg；
80.leuabcd
‑
r:ccgctcgagttaattcataaacgcaggttg；
81.然后，基因合成技术合成raip基因，如seq id no：1所示，leuabcd以大肠杆菌的总dna为模板，进行pcr扩增；最后，纯化pcr产物，连接到pet21a载体，得到所述prlabcd重组质粒，如seq id no：2所示。
82.实施例2 pkv重组质粒及其制备方法
83.本实施例提供一种pkv重组质粒，如图2所示，其包括kivd基因(基因片段序列为1647bp)和vfl基因(基因片段序列为1362bp)，其构建方法和实施例1中的构建方法类似，特别的是其设计的引物为：
84.kivd
‑
bamhi
‑
f:cgcggatccgatgtataccgtgggtgactatc，
85.kivd
‑
sali
‑
r：acgcgtcgacttagctcttattttgttcggc，
86.vfl
‑
ndei
‑
f：cgagactccatatgaataaaccccaatcatgggaagc，
87.vfl
‑
xhoi
‑
r：ccgctcgagttacgcgacctcggcgaaca。
88.具体的，所述kivd基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
89.具体的，所述vfl基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。
90.经测序证实kivd与vfl基因的编码序列均正确(kivd与vfl基因的电泳图分别如图6、7)，连接pet21a载体上；得到pkv重组质粒，其核苷酸序列如seq id no：5所示。
91.实施例3 pad重组质粒及其制备方法
92.本实施例提供一种pad重组质粒如图3所示，其包括kdca基因和dat基因(对应的电泳图为图8、9)。pad重组质粒构建方法类似实施例1中的构建方法，特别的是其设计的引物为：
93.kdca
‑
bamhi
‑
f:cgcggatccgatgtatacagtaggagactacctattag，
94.kdca
‑
sali
‑
r:gcgcgtcgacttatttgttttgttcggca，
95.dat
‑
ndei
‑
f:ccggcctccatatgaaagtattagttaatggaaggc，
96.dat
‑
xhoi
‑
r:ccgctcgagttaggaaatggacgcagcct。
97.具体的，所述kdca基因的核苷酸序列如seq id no：6所示。
98.具体的，所述dat基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。
99.具体的，所述pad重组质粒的核苷酸序列如seq id no：8所示。
100.实施例4己二胺的合成
101.本实施例详细介绍上述重组质粒的制备参数条件，并通过将实施例1中的prlabcd重组质粒分别与实施例2中的pkv重组质粒、实施例3中的pad重组质粒两两组合，制备得到的能产生己二胺的基因工程菌lrkv和lrad。其中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
102.1、配制培养基
103.lb培养基成分为含有5g/l酵母粉，10g/l胰蛋白胨和10g/l nacl。固体培养基为液体基中加入1.5％的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨苄青霉素(amp)的使用浓度0.1mg/m，卡拉青霉素(kan)的使用浓度0.1mg/ml。
104.2、利用试剂盒提取大肠杆菌dna基因组
105.取大肠杆菌dh5α的培养物1
‑
5ml，按照细菌dna提取试剂盒说明书对大肠杆菌dh5α的dna组进行提取。所用试剂盒为康为世纪公司所提供的细菌基因组dna提取试剂盒(6次装)。
106.3、重组质粒的构建
107.1)用pcr法获取目的基因，pcr反应体系如下：
[0108][0109][0110]
2)切胶回收纯化目的基因
[0111]
3)将目的基因连接到pet21a载体，体系如下：
[0112]
pet21a(购于takara)0.8μl目的基因2.2μlsolution 1(购于takara)3μl总体积6μl
[0113]
16℃反应180分钟，全量(6μl)加入到60μl的bl21感受态细胞。
[0114]
4)通过具有氨苄抗性平板和具有卡拉抗性平板筛选出具有重组质粒prlabcd及pad的bl21大肠杆菌lrad。通过筛选出具有重组质粒prlabcd及pkv的bl21大肠杆菌lrkv。
[0115]
5)对筛选出的工程菌株进行pcr验证，完成后上样电泳检测，电泳见图10。
[0116]
4、质粒的转化反应与工程菌株的构建
[0117]
感受态细胞购买自擎科生物公司。用热击法进行转化反应，热击的反应条件是42℃热击90秒。热击后加入800μl的lb培养基，37℃活化45分钟后涂于含100μl/ml氨苄及卡拉
的lb平板上37℃过夜培养。挑取单菌落即为lrad及lrkv工程菌株。
[0118]
5、重组菌的初步发酵
[0119]
分别挑选lrad及lrkv的单菌落，于含有2ml lb、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡拉霉素的试管中培养8h，获得种子液。
[0120]
将种子液以1％的接种量转接入50ml lb培养基中，37℃，200rpm培养，待生长至od 0.4
‑
0.6时，加入0.5mm的iptg，以5g/l的赖氨酸为底物，加入2g/l丙氨酸及2g/l谷氨酰胺作为胺供体，0.5mm焦磷酸硫胺素，1mm nad

，30℃，180rpm发酵培养72h，取上清进行lc
‑
ms检测，如图11
‑
12，两株工程菌株发酵性能比较图图13所示。
[0121]
6、己二胺的双阶段摇瓶发酵合成
[0122]
将10od的工程菌株lrad和lrkv加入经过优化的催化培养基100ml中，在150rpm，30℃催化12h后通入co2进入无氧发酵阶段，并取此时的样品为0h样，根据时间产量图，选取了24h内的产量进行分析，催化结果如下。至发酵终点，己二胺的产量分别达到2.18和3.62g/l，如图14所示。
[0123]
7、己二胺的反应器发酵合成
[0124]
将5od的工程菌株lrad和lrkv种子加入经过优化的5l催化培养基中，在10l反应器中250rpm，30℃培养8h后加入乳糖诱导外源基因表达，10h后通入co2进入无氧发酵阶段，并取此时的样品为0h样，根据时间产量图，选取了24h内的产量进行分析，催化结果如下。至发酵终点，己二胺的产量分别达到3.32和6.65g/l，如图15所示。
[0125]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。