一种降解烟碱Mixtacalida菌的制备与应用的制作方法

技术特征：
1.一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，其特征在于，降解烟碱mixta calida菌的制备方法为：将niuj1菌接种到试管烟碱液体培养基中(每管装5ml)，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g，cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将niuj1接种到培养基上，于37℃摇床培养培养时间12h，转速为220rpm，获得试管种；将试管种转接于新鲜的烟碱液体培养基试管中，37℃摇床培养培养时间12h，转速为220rpm，获得活性较强菌液。2.根据权利要求1所述的一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，其特征在于，降解烟碱mixta calida菌的制备方法还包括：将上述试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装100ml)，液体培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g，cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；于37℃摇床培养培养时间24h，转速为220rpm；将发酵培养物于10000rpm/min离心20分钟，取上清液，用0.22μm滤器过滤得到无菌发酵液。3.根据权利要求1所述的一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，其特征在于，还包括以下制备步骤：步骤一：试管种培养，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g，cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将niuj1革兰氏阴性菌菌体接种到培养基上，37℃下培养12h，获得试管种；步骤二：液体扩大培养，培养基配方为：k2hpo413.3g，kh2po44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10ml，加蒸馏水至1000ml，ph值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：mnso4
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7h2o0.4g，cacl2
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2h2o0.2g，feso4
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7h2o0.2g使用0.1mol/lhcl定容至100ml；将试管种接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，37℃下摇床培养培养时间12h，转速为220rpm。4.根据权利要求1所述的一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，其特征在于，还包括niuj1菌降解烟碱的试验，包括以下流程：流程一：制备试验用菌液，按前述液体扩大培养方法接种培养niuj1菌株。流程二：制备对照用试剂，在测niuj1菌降解烟碱的实验中，对照均采用相应量的烟碱培养基为空白对照。流程三，试验方法包括以下两步，(1)、将试管种的无菌发酵液以1：1比例接种到50ml三角瓶液体培养基中，每瓶装10ml，不同培养时间取1ml接种了烟碱降解细菌的培养液于10000rpm下离心10min，以加入了烟碱没有接种降解菌的培养液作为对照，同样方法处理，取上清液于酶标仪259nm波长下测各发酵液中烟碱的吸光值；如od值过大，上清液用0.05mol/l盐酸进行稀释；将所测得吸光度值
代入烟碱标准曲线所得方程换算出残余烟碱浓度，由此可得出该菌的烟碱降解率；烟碱降解率％＝(初始烟碱含量
‑
发酵液中的烟碱含量)/初始烟碱含量x100％；(2)、niuj1菌液降解烟叶中烟碱实验，称取5g调制后烟叶碎片(含水率15％～17％)放入三角瓶中，实验组加入等量菌悬液(10％比例接菌)，对照组加入等量无菌水，调节物料水分含量至45％～50％，封口，37℃发酵7d后，取出烟叶，64℃烘干、粉碎，用盐酸提取脱色法测定粉末中烟碱含量；与对照组比较，计算烟叶烟碱降解率，3次重复，每次3瓶。5.根据权利要求4所述的一种降解烟碱mixta calida菌的制备与应用，其特征在于，还包括具体测定如下步骤：称取烟叶样品0.03g加入100ml的三角瓶中，加入活性炭0.25、0.5n的盐酸25ml；振荡5min，过滤到容量瓶中(100ml)，用去离子水洗三角瓶、合并滤液并定容摇匀；另取0.5n25ml盐酸加入100ml容量瓶中，定容摇匀，作为空白参比；以空白参比在分光光度计仪器上调读数为零，在3个波长处(236nm；259nm；282nm)分别测定吸光度值；烟碱含量计算公式如下：烟碱％＝1.059
×
[a259－0.5(a236 a282)]
×
100
×
100/[w(1－水％)
×
34.3
×
1000]，其中1.059为矫正系数，w为干样重，34.3为烟碱的吸光系数(1000ml中含有1g烟碱溶液的吸光度)。

技术总结
本发明公开了一种降解烟碱Mixta calida菌的制备与应用，涉及微生物农药技术领域域，降解烟碱Mixta calida菌的制备方法为：将NiuJ1菌接种到试管烟碱液体培养基中(每管装5mL)，培养基配方为：K2HPO413.3g，KH2PO44.0g，酵母提取物1.0g，微量元素溶液10mL，加蒸馏水至1000mL，pH值7.0，培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入一定量烟碱(用0.22μm滤膜过滤)，微量元素溶液：MnSO4


技术研发人员：张林 牛秋红 奚家勤 尹晓燕 雷绳尾
受保护的技术使用者：南阳师范学院
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2021/12/6