一株产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物多糖的制备方法，尤其涉及产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌及其应用。


背景技术：

2.微生物胞外多糖指的是由细菌、真菌、放线菌、酵母等微生物细胞产生、分泌到胞外的一类多糖，其通常由分枝的或重复的糖和糖类衍生物单元组成，常见的成分有d
‑
甘露糖、d
‑
葡萄糖、l
‑
岩藻糖以及l
‑
鼠李糖等。研究结果表明，胞外多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血糖、降血脂等生理活性，在医药领域有很强的应用前景；同时，微生物胞外多糖由于对人体无毒无害、安全系数高，也被作为增稠剂、保水剂、赋形剂、稳定剂、乳化剂等食品添加剂，广泛应用于食品加工领域；目前已有多种微生物胞外多糖已经发展成为一类新型的发酵产品，与植物多糖相比较具有以下优势:生产周期短,不受季节、地域、病虫害等条件的限制；具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。
3.此外，微生物胞外多糖因具有较好的增稠性、稳定性、乳化性而作为悬浮助剂应用于农业生产中。产多糖新菌种的进一步探索成为新型胞外多糖的一个重要来源，虽然在自然界中多种微生物均能够产生胞外多糖，但这些产糖的微生物依然面临菌株不安全(如克雷伯氏菌为致病菌)、培养成本高(乳酸菌需厌氧培养)、多糖产量低等问题。因此，筛选快速生长、产糖量高的胞外多糖产生菌具有重要意义。


技术实现要素：

4.本技术的发明人称取天津汉沽土壤样品加入到含有甘露糖的富集培养基中，培养、富集培养后，分别对各个菌落进行培养鉴定，对其进行16s rdna测序，依据基因序列分析，然后采用凝胶渗透色谱(gpc)法和hplc测定，最终筛选出一株产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum) cgl
‑
p30。
5.本发明的目的之一，是提供一株产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌菌株。本发明的谷氨酸棒杆菌菌株能生产胞外多糖，该胞外多糖主要包含l
‑
鼠李糖、d
‑
半乳糖、 d
‑
葡萄糖和d
‑
甘露糖，是一个非常有潜力的菌株。
6.本发明提供一株谷氨酸棒杆菌菌株，该菌株的名称为谷氨酸棒杆菌 (corynebacterium glutamicum)cgl
‑
p30，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc) (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22680，保藏日期为2021年6月9日。
7.本发明的目的之二，是提供上述谷氨酸棒杆菌菌株在生产胞外多糖中的应用。
8.本发明的谷氨酸棒杆菌菌株可以生产胞外多糖，且该胞外多糖主要包含l
‑ꢀ
鼠李糖、d
‑
半乳糖、d
‑
葡萄糖和d
‑
甘露糖。因此，该多糖是一种有潜力的用于抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血糖、降血脂等的活性成分。
9.本发明的目的之三，是提供利用上述谷氨酸棒杆菌菌株生产胞外多糖的方法。
10.本发明提供一种利用上述谷氨酸棒杆菌菌株生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：
11.采用上述产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌菌株为出发菌株，通过菌株活化、种子培养、摇床发酵和分离纯化生产胞外多糖。
12.根据本发明的优选技术方案，所述菌株活化步骤为：将本发明所述的产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌菌株划线接种于培养基上，培养12
‑
72h，得到活化的斜面菌种。
13.根据本发明的优选技术方案，所述种子培养和摇床发酵的步骤为将得到的活化的菌种，摇床培养12
‑
24h，得种子液；然后摇床培养24
‑
48h，得到发酵液；
14.根据本发明的优选技术方案，所述分离纯化步骤为：将上述步骤得到的发酵液浓缩，纯化，再透析，并任选对透析液进行真空冷冻干燥，即得到胞外多糖。
15.根据本发明的优选技术方案，包括如下一个或多个步骤：
16.步骤1：将本发明所述的产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌菌株划线接种于培养基上，培养12
‑
72h(优选24
‑
48h)，得到活化的斜面菌种；
17.步骤2：将步骤1得到的活化的菌种，摇床培养6
‑
24h(优选12
‑
16h)，得种子液；然后摇床培养12
‑
72h(优选24
‑
48h)，得到发酵液；
18.步骤3：将步骤2得到的发酵液浓缩，纯化，再透析，对透析液进行真空冷冻干燥，即得到胞外多糖。
19.根据本发明的优选技术方案，其中使用的培养基为cgxii或者bhi培养基。
20.根据本发明的优选技术方案，使用的纯化方法为醇沉和/或纤维素透析膜的方法。
21.本发明的目的之四，是提供利用上述生产胞外多糖的方法生产的胞外多糖。
22.根据本发明的技术方案，所述胞外多糖，其通过谷氨酸棒杆菌菌株获得。
23.根据本发明的技术方案，所述胞外多糖主要包含l
‑
鼠李糖、d
‑
半乳糖、d
‑
葡萄糖和d
‑
甘露糖。
24.本发明的目的之六，提供一种胞外多糖在制备用于抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血糖、降血脂等药物中的应用。
25.根据本发明所述技术方案，所述胞外多糖通过本发明上述生产方法制备。
26.本发明的目的之七，是提供利用上述谷氨酸棒杆菌菌株在制备药物、食品、食品添加剂或悬浮助剂中的应用。
27.本发明的有益效果是：
28.1.本发明的谷氨酸棒杆菌菌株能生产胞外多糖，该胞外多糖主要包含l
‑
鼠李糖、d
‑
半乳糖、d
‑
葡萄糖和d
‑
甘露糖，是一个非常有潜力的菌株。
29.2.本发明采用上述产胞外多糖的谷氨酸棒杆菌菌株为出发菌株，生产胞外多糖，产糖量高且稳定性好，工艺简单，市场前景广阔，适合规模化生产。
30.3.本发明的胞外多糖，由上述生产胞外多糖的方法所生产，主要包含l
‑
鼠李糖、d
‑
半乳糖、d
‑
葡萄糖和d
‑
甘露糖，具有多领域应用前景。
附图说明
31.图1：谷氨酸棒杆菌cgl
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p30在添加不同碳源的培养基中生长、代谢情况。
32.图2：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
p30发酵多糖产物的分子量分布。
33.图3：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
p30发酵多糖产物组成分析。
具体实施方式
34.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
35.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内，发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。
36.实施案例1：谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgl
‑
p30的筛选和鉴定
37.称取2g土壤样品加入到盛有30ml含有甘露糖的富集培养基中，于30℃， 200rpm下培养48h，取3ml加入到新鲜的富集培养基中继续富集培养。连续富集5次后，进行涂板画线，分别对各个菌落进行培养鉴定，对其进行16s rdna 测序，依据基因序列分析，将该菌株鉴定为棒状杆菌属，并将其命名为谷氨酸棒杆菌cgl
‑
p30。
38.谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgl
‑
p30 cgmcc no.22680菌株已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.22680。
39.富集培养基配方：称取37g脑心浸粉(bhi)，加入1l蒸馏水，搅拌均匀， 121℃灭菌20min。
40.实施案例2：谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgl
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p30发酵产胞外多糖与产物纯化
41.(1)cgl
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p30菌株活化
42.将保藏于甘油管中的菌株cgl
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p30在自制固体培养基平板上划线，培养48h 进行活化。自制固体培养基按如下组成配制：bhi 37g/l，琼脂15g/l，ph＝7.0， 121℃高压蒸汽下灭菌20min。
43.(2)cgl
‑
p30种子培养
44.挑取自制固体培养基上的cgl
‑
p30单菌落，接种于装有10
‑
30ml发酵培养基的100ml三角瓶中，培养温度为30℃，置于转速为150
‑
230rpm的摇床上培养12
‑
16h至对数期后期即可(图1)。发酵培养基按如下组成配制：bhi 37g/l， ph＝7.0，121℃高压蒸汽下灭菌20min。
45.(3)cgl
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p30摇瓶发酵
46.在装有50
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100ml发酵培养基250ml三角瓶中接入0.5％
‑
3％种子液,培养温度为30℃，置于摇床转速为150
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230rpm的摇床上培养24
‑
48h，得到发酵液。
47.发酵培养基(cgxii)配方：(nh4)2so
4 20g/l，urea 5g/l，k2hpo4 1g/l， kh2po4 1g/l，mops 42g/l，加水900ml，加入cacl2、mgso4
·
7h2o母液各1ml，naoh调节ph＝7.0，121℃灭菌20min，使用前加入biotin、trace elements 母液各1ml，并添加葡萄糖/甘露糖5
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15g/l。其中，母液cacl2 10g/l，mgso4
·
7h2o 250g/l，biotin 0.2g/l，trace elements含feso4
·
7h2o 10g/l， znso4
·
7h2o 1g/l，mnso4
·
h2o 10g/l，cuso4 0.2g/l，nicl2
·
6h2o 0.02g/l，加入hcl调节ph＝1，0.22μm滤膜过滤除菌。
48.(4)多糖分离纯化：发酵结束后，7000rpm离心10min除去菌体，将发酵上清进行真空冷冻干燥浓缩，加入20ml 80％乙醇进行醇沉，于4℃过夜，离心弃上清，再次将沉淀进行醇沉，离心收集沉淀，加入10ml超纯水溶解沉淀，加入到100
‑
500纤维素透析膜中，于4℃静置，期间测量透析液电导率直到为 18ω左右时停止透析，真空冷冻干燥，获得粗多糖样品。添加葡萄糖和甘露糖的培养基中多糖产量分别为1.49g/l和1.85g/l。
49.实施案例3：谷氨酸棒杆菌cgl
‑
p30发酵产物分析
50.(1)多糖分子量测定：采用凝胶渗透色谱(gpc)法测定，配制2.0mg/ml 的普鲁兰多糖标准品(分子量为708，642，337，194，107，47.1，21.1，9.6和 6.1kda)水溶液，使用hplc采集各标准品谱图，以保留时间rt为x，以标准品分子量对数lgmw为y；样品出峰后，根据色谱图上的峰形及数量鉴定多糖纯度，根据标准曲线保留时间计算样品的平均分子量。从图2可见三个色谱峰，出峰时间分别为10.0min,14.9min和16.3min，所对应多糖的分子量分别为 6.17
×
103kda,3.98kda和0.54kda。
51.(2)单糖组成分析：称取2mg，加入1ml 0.2mol/l三氟乙酸，120℃消解120min，冷却，n2吹干，加入50μl 0.3mol/l naoh和50μl 0.5mol/l 1
‑ꢀ
苯基
‑
3甲基
‑5‑
吡唑啉酮(pmp)，70℃消解60min，加入50μl 0.3mol/l hcl和1ml 0.1mol/l pbs终止反应，加入1ml氯仿萃取，收集上层液体，即可用于hplc分析。如图3所示，添加不同碳源(葡萄糖和甘露糖)的多糖产物的组成一致，都主要包含l
‑
鼠李糖、d
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半乳糖、d
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葡萄糖和d
‑
甘露糖。
52.以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。