一种鉴定鳅科鱼类的引物、试剂盒以及方法与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种鉴定鳅科鱼类的引物、试剂盒以及方法。


背景技术：

2.鳅科为辐鳍鱼纲鲤形目的其中一科。淡水底栖小型鱼类，杂食性。大部分学者都倾向于分为三个亚科，即条鳅亚科、沙鳅亚科、花鳅亚科。我国鳅科鱼类的分布也十分广泛，我国南部水系众多，因此鳅科在南部较为集中，鳅科在我国大约有18属100种及亚种左右。鳅科成员长相和鲤形目同胞差异很大，身体多为拉长的侧扁或圆筒形，头部平扁。口小、居下位，上颌由前颌骨形成，有一行下咽齿，没有角质垫。眼睛很小，部分鱼种眼下有刺，另有须3
‑
6对，吻须2对，口角须有1或2对，颏须与鼻须则各1对或没有。
3.鳅科鱼类种类众多，在鳅科鱼类孵化期很难对鳅科鱼类进行准确鉴定。传统对鳅科鱼类进行早期资源鉴定的方法为形态学法，该方法误差较大，对渔业资源调查结果造成不准确。


技术实现要素：

4.针对形态学鉴定方法误差大的问题，本发明提出了一种鉴定鳅科鱼类的引物、试剂盒以及方法。该方法可以准确测出待测物种的目的片段序列，从而准确鉴定物种。
5.在第一方面，本发明提供了一种鉴定鳅科鱼类的引物，鉴定引物包括第一引物对和第二引物对，第一引物对的上下游分别具有seq id no.1和seq id no.2所示核苷酸序列，第二引物对的上下游分别具有seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸序列。
6.在第二方面，本发明提供了一种鉴定鳅科鱼类的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。
7.优选地，试剂盒还包括pcr缓冲液、taq dna聚合酶、dntps、mgcl2。
8.在第三方面，本发明提供了一种鉴定鳅科鱼类的方法，具体步骤如下：s1：获取鳅科鱼类样品的dna；s2：用第一引物对对s1中获取的dna进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物；s3：用第二引物对进行巢氏pcr扩增，获得第二pcr扩增产物；s4：将s3中获得的第二pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，得到纯化后的第二pcr扩增产物；以及s5：将纯化后的第二pcr扩增产物测序，根据测序结果的碱基序列，在ncbi数据库中比对已知物种鳅科鱼类的线粒体基因序列，确认鳅科鱼类样品的种类。
9.优选地，将s2中获得的第一pcr扩增产物稀释10倍。
10.优选地，pcr扩增的反应体系为：10
×
pcr缓冲液3μl，2.5mmol/l dntp 2μl，mgcl
2 3μl，上游引物1μl，下游引物1μl，taq聚合酶0.5μl，dna模板2μl，ddh2o 12.5μl。
11.优选地，s2中pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火复性60s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
12.优选地，s3中巢氏pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火复性60s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
13.优选地，s4中所述胶为1.5％琼脂糖凝胶。
14.综上所述，本发明具有以下有益效果：(1)利用本发明的引物可准确高效地鉴定鳅科鱼类的目的片段序列，排除非特异性扩增片段，准确鉴定待测样本的种类；(2)利用本发明的引物可在鳅科鱼类孵化期对其进行鉴定，大大的提高了鳅科鱼类鉴定的效率，缩短了鉴定时间。
具体实施方式
15.以下将参考具体实施例对本发明进行进一步的说明。本领域的普通技术人员将会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明本发明的可实现方式，以便于本领域的普通技术人员能够更好地理解本发明，而无意于将本发明内容限制于这些具体的实施例。
16.实施例1引物设计
17.根据鳅科鱼类线粒体共同序列设计引物。
18.第一引物对：
19.1f：5'
‑
acagacctaccgaacttggtgata
‑
3'(seq id no.1)
20.1r：5'
‑
atagaaactgacctggattnctcc
‑
3'(seq id no.2)。
21.第二引物对：
22.2f：5'
‑
ctgatccaacatcgaggtcgtaaa
‑
3'(seq id no.3)
23.2r：5'
‑
aagcagccanctgaacagaaagcg
‑
3'(seq id no.4)。
24.实施例2鉴定方法
25.利用实施例1设计的引物对鳅科鱼进行鉴定。
26.s1：提取鳅科鱼dna：1.取保存在酒精中的鳍条，剪取约1g鳍条于离心管中，用蒸馏水清洗2次，每次1小时，清洗后将鳍条放入55℃烘箱中，烘至酒精完全蒸发；2.吸取10μl蛋白酶k和500μl hom buffer加入到离心管中，手动摇匀后将离心管放到55℃烘箱中，直至组织完全裂解，液体变为透明；3.组织完全裂解后，吸取300μl 4.5mol/l nacl和200μl氯仿加入到离心管中，轻轻涡流一下使其混匀，使充分裂解15min；4.13000转，离心12min，取上清液700μl，加入到新的1.5ml离心管中；5.向上清液中加入纯异丙醇溶液490μl，轻轻涡流一下使其混匀后置于4℃冰箱，静置30min以上；6.向上清液中加入纯异丙醇溶液490μl，轻轻涡流一下使其混匀后置于4℃冰箱，静置30min以上；7.向离心管中加入4℃的75％酒精溶液，静置20min；8.13000转，离心12min，dna沉积在离心管底部，去掉上清液，将离心管盖子打开倒置于洁净的纸上晾干；9.往离心管底部中央滴加约50μl蒸馏水，13000转，离心2min，得到dna原液，4℃保存；
27.s2：用第一引物对对s1中提取的dna进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物，其中第一引物对的上下游分别具有seq id no.1和seq id no.2所示核苷酸序列，pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火复性60s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；
28.s3：将s2中获得的第一pcr扩增产物稀释10倍，用第二引物对进行巢氏pcr扩增，获得第二pcr扩增产物，其中第一引物对的上下游分别具有seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸序列，巢氏pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火复性60s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；
29.s4：将s3中获得的第二pcr扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，得到纯化后的第二pcr扩增产物；
30.s5：将s4中获得的纯化后的第二pcr扩增产物连接载体后转化到大肠杆菌中进行克隆，挑取单克隆个体测序；以及
31.s6：根据测序结果的碱基序列，在ncbi数据库中比对已知物种鳅科鱼类的线粒体基因序列，确认样品的种类。
32.实施例3
33.s1：提取样本dna：1.2020年长江鱼类自然繁殖检测期间，捕捞3种疑似鳅科的鱼类；2.取保存在酒精中的鳍条，剪取约1g鳍条于离心管中，用蒸馏水清洗2次，每次1小时，清洗后将鳍条放入55℃烘箱中，烘至酒精完全蒸发；3.吸取10μl蛋白酶k和500μl hom buffer加入到离心管中，手动摇匀后将离心管放到55℃烘箱中，直至组织完全裂解，液体变为透明；4.组织完全裂解后，吸取300μl 4.5mol/l nacl和200μl氯仿加入到离心管中，轻轻涡流一下使其混匀，使充分裂解15min；5.13000转，离心12min，取上清液700μl，加入到新的1.5ml离心管中；6.向上清液中加入纯异丙醇溶液490μl，轻轻涡流一下使其混匀后置于4℃冰箱，静置30min以上；7.向上清液中加入纯异丙醇溶液490μl，轻轻涡流一下使其混匀后置于4℃冰箱，静置30min以上；8.向离心管中加入4℃的75％酒精溶液，静置20min；9.13000转，离心12min，dna沉积在离心管底部，去掉上清液，将离心管盖子打开倒置于洁净的纸上晾干；10.往离心管底部中央滴加约50μl蒸馏水，13000转，离心2min，得到dna原液，4℃保存；
34.s2：用第一引物对对s1中提取的dna进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物，其中第一引物对的上下游分别具有seq id no.1和seq id no.2所示核苷酸序列，pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火复性60s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；
35.s3：将s2中获得的第一pcr扩增产物稀释10倍，用第二引物对进行巢氏pcr扩增，获得第二pcr扩增产物，其中第一引物对的上下游分别具有seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸序列，巢氏pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火复性60s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；
36.s4：将s3中获得的第二pcr扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，得到纯化后的第二pcr扩增产物；
37.s5：将s4中获得的纯化后的第二pcr扩增产物连接载体后转化到大肠杆菌中进行克隆，挑取单克隆个体测序；以及
38.s6：根据测序结果的碱基序列，在ncbi数据库中比对已知物种鳅科鱼类的线粒体基因序列，确认样品的种类。
39.序列比对的最终结果分别为花斑副沙鳅、紫薄鳅和汉水扁尾薄鳅。对这些鱼苗进行人工养殖，待养殖20天后，鱼苗发育完全，进行传统形态学鉴定。经过传统形态学鉴定，这三种疑似鳅科的鱼类分别为花斑副沙鳅、紫薄鳅和汉水扁尾薄鳅，与本技术提供的方法鉴定结果一致。本技术提供的方法2天即可获得鉴定结果，鉴定的准确率高，且缩短了鉴定时间，大大的提高了鳅科鱼类鉴定的效率。
40.以上所述，仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在
阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。