一种板栗雄花特异表达启动子及其应用的制作方法

gv3101单克隆细胞系。
10.本发明的第四个目的是提供上述启动子在构建板栗雄花特异表达的转基因植物中的应用。
11.本发明通过板栗雌雄花差异转录组分析，筛选鉴定到一个雄花特异表达基因cmltp(暂定名)，采用实时荧光定量pcr对cmltp在板栗不同组织中的表达特征进行分析，发现cmp28启动子调控下游cmltp仅在板栗雄花中有很强的表达活性，而在茎、叶、雌花等组织中表达极弱(图1)。将上述的cmp28启动子与报告基因gus融合，通过根癌农杆菌gv3101介导瞬时转化本生烟草，稳定转化拟南芥，证实cmp28启动子具有较强的启动子活性。以上结果表明，本发明的板栗雄花特异表达启动子可用于构建雄花特异表达的转基因植物，在基因工程改造利用板栗雄花等方面具有重要作用。
附图说明
12.图1是cmp28启动子调控下游cmltp基因在板栗不同组织中的相对表达量。雄花1：4月13日，雄花序2cm左右；雄花2：4月29日；雄花3：5月13日；雄花4：5月25日，雄花盛花期。雌花1和雌花2分别对应雄花3和雄花4采样时期。
13.图2a是cmp28启动子连接到ta克隆载体后经hind iii和bam h i双酶切电泳结果，图2b是pcambia2300
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cmp28
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gus
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egfp经hind iii和bam h i双酶切电泳结果。
14.图3是采用注射法将含有pcambia2300
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cmp28
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gus
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egfp质粒和pcambia2300
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camv35s
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gus
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egfp质粒(对照)的农杆菌gv3101瞬时转化本生烟草叶片的gfp激发荧光(a)和gus染色(b)结果。每片本生烟草左半边叶片显示camv35s质粒结果，右半边叶片显示cmp28质粒结果。
15.图4是采用蘸花法将含有本发明构建的cmp28质粒和camv35s质粒(对照)的农杆菌gv3101稳定转化拟南芥的gus染色结果。每片本生烟草左半边叶片显示camv35s质粒gus染色结果，右半边叶片显示cmp28质粒gus染色结果。
具体实施方式
16.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
17.实施例1pcambia2300
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cmp28
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gus
‑
egfp构建
18.申请人利用板栗雌雄花差异转录组数据库，从中筛选到一个雄花特异表达的基因cmltp，功能未知。进一步采用实时荧光定量pcr分析其不同组织表达模式，采集板栗茎、叶片、不同发育时期雄花(雄花1：4月13日，雄花序2cm左右；雄花2：4月29日；雄花3：5月13日；雄花4：5月25日，雄花盛花期)以及雌花(雌花1和雌花2分别对应雄花3和雄花4采样时期)。分别以上述样品cdna为模板，采用cmltp特异引物qf：5'
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cacaaccttgaccactgcac
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3'和qr：5'
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gtgaggtcaatgtgcttggc
‑
3'进行定量pcr扩增。以板栗看家基因β
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actin为内参，引物为：af：5'
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attcacgagaccacctaca
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3'和ar：5'
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tgccacaaccttaatcttcat
‑
3'。反应在abi 7500实时定量pcr仪上进行(applied biosystems，usa)，10μl反应体系，其中syber green pcr mix 5μl，引物各0.5μl(10μmol
·
l
‑1)，cdna模板约200ng，每个反应3次重复。反应程序为50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。基因的相对表达量通过2
‑
δδc(t)
公式计算，即经内参β
‑
actin校正后，以茎中的表达水平为1计算相对表达量。pcr反应体系结果证
实cmp28启动子调控下游cmltp在板栗雄花发育早期(雄花1和雄花2)有较低表达，在雄花发育中后期(雄花3和雄花4)中极显著上调表达，特别是在雄花3中相对表达量水平最高，而在板栗茎、叶片和雌花中的表达量相对较低(图1)。
19.基于板栗基因组数据，以cmltp基因上游约1500bp序列为参考序列设计引物，以板栗基因组dna为模板，利用带有酶切位点的特异引物f：5'
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ccaagctttgaatggcagttaatccctaat
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3'和r：5'
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cgggatccatctgaatctgatatctctcac
‑
3'(下划线表示酶切位点，酶切位点分别为hind iii和bam hi)进行pcr扩增。pcr扩增采用50μl反应体系，其中包含200ng模板dna；2
×
es taq mastermix(预混es taq聚合酶、3mm mgcl2、400μμdntps)(康为世纪，北京)25μl；正向引物(10μm)和反向引物(10μm)各2μl；用双蒸水定容至50μl。pcr程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃ 5min。pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取约1.2kb左右大小的目的条带，使用qiagel extraction kit(qiagen,hilden,germany)回收目的条带dna，目的条带dna与pcloneez
‑
nrs
‑
ta克隆载体(中美泰和生物技术(北京)有限公司)进行连接，热激转化至大肠杆菌dh5α。
20.挑取单克隆细菌扩繁，提取质粒用hind iii和bam hi进行双酶切验证阳性(图2a)。阳性质粒送武汉天一华煜基因科技有限公司测序。测序序列(seq id no.1)与板栗基因组参考序列比对，选择测序正确质粒，置于
‑
20℃保存备用。
21.将测序正确的质粒和pcambia2300
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camv35s
‑
gus
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egfp目标载体(本实验室保存)分别用hind iii和bam hi进行双酶切(图2b)，产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳，分别取约1.2kb、12kb左右大小的目的条带，用qiagel extraction kit(qiagen,hilden,germany)回收目的条带dna。使用t4 dna ligase(thermo fisher scientific,us)将插入片段(约1.2kb)和载体(约12kb)按说明书进行连接。反应体系如下：1μl t4 dna ligase,2μl t4 dna ligase buffer(10x)，载体dna约100ng，插入片段dna约45ng，ddh2o加至终体积20μl；16℃反应12
‑
16h(过夜)后，65℃处理10min终止反应，得到连接反应产物。
22.取5μl连接反应产物，热激转化至大肠杆菌dh5α。挑取单克隆细菌扩繁，利用特异引物f：5'
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ccaagctttgaatggcagttaatccctaat
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3'和r：5'
‑
cgggatccatctgaatctgatatctctcac
‑
3'进行pcr阳性验证。阳性菌液提取质粒后经hind iii和bam hi双酶切进一步确认质粒是否构建成功，产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳结果见图2所示。由图2可知，pcambia2300
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cmp28
‑
gus
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egfp质粒载体构建成功，其电泳泳道含有目标条带约1.2kb片段。最后将阳性克隆菌液添加30％甘油后置于
‑
80℃保存，将pcambia2300
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cmp28
‑
gus
‑
egfp质粒置于
‑
20℃保存。
23.实施例2农杆菌介导的本生烟草叶片瞬时转化和拟南芥蘸花法遗传转化
24.取1μg左右的pcambia2300
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cmp28
‑
gus
‑
egfp载体质粒，加入到200μl农杆菌gv3101感受态细胞中，冰上静置30min后液氮处理5min，37℃热激5min后冰上静置2min，加入500μl lb液体培养基，28℃，180rpm摇床培养4
‑
5h。4℃，3000rpm离心5min收集菌液，用200μl lb液体培养基重悬，取100μl涂布在lb固体培养基(含100mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)上。培养皿用parafilim封口膜封好后在28℃培养2
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3d，挑取单克隆细菌扩繁，利用特异引物f：5'
‑
ccaagctttgaatggcagttaatccctaat
‑
3'和r：5'
‑
cgggatccatctgaatctgatatctctcac
‑
3'
进行pcr筛选阳性克隆。验证后的农杆菌gv3101加30％甘油保存于
‑
80℃备用。
25.应用pcambia2300
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cmp28
‑
gus
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egfp表达载体，以pcambia2300
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camv35s
‑
gus
‑
egfp为对照，采用注射法瞬时转化本生烟草(nicotiana benthamiana)叶片，具体步骤如下：
26.(1)农杆菌侵染液制备：上述阳性农杆菌gv3101在lb培养基(含100mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)上划线，挑取单克隆在5ml yeb液体培养基(含100mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)上180rpm，28℃振荡培养1
‑
2d，然后取1ml菌液到50ml yeb液体培养基(含100mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)中过夜扩大培养至od
600
值1.0左右。6000rpm离心8min收集菌体，用25ml诱导缓冲液(10mm mgcl2,10mm mes,ph 5.8)重悬，再次离心收集菌体，用侵染缓冲液(10mm mgcl2，10mm mes，200μm乙酰丁香酮，ph 5.8)重悬菌体至od
600
值1.0左右。室温静置3
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5h后可用于瞬时转化。
27.(2)本生烟草瞬时转化：使用播种后45天左右的烟草植株，渗透法转化叶片，实验前1d控水，摘心，去掉下层坏死老叶。用1ml去掉针头的注射器吸取侵染液，在叶背面将菌液渗透注射进叶片内。室温光照培养2
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3d后，取转化叶片备用。
28.(3)拟南芥蘸花法遗传转化：当拟南芥主花序结荚，次花序有少量花开，大多数为露白未开放花蕾时进行蘸花，将上部分花序组织浸入侵染液(1/2ms，5.0％蔗糖，0.05％silwet l
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77，ph＝5.7)约10min；保持湿度和避光，平放24h后移入培养箱中正常生长，收集t0代种子，抗性培养基(1/2ms，含卡那霉素100mg/l)筛选，获得转基因t1代植株。
29.将上述转化后的本生烟草叶片和拟南芥通过gus组织化学染色。gsu染色液(配方：100mm tis盐酸缓冲液ph7.0，50mm氯化钠，0.5mm铁化钾，0.5mm铁氰化钾，0.01％triton
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x，2mm x
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gluc)现配现用。将材料浸没在染色液中，抽中空5min左右，置于37℃温箱1h以上。染色后取出材料，用75％乙醇漂洗3
‑
5次，每次30min左右至材料完全脱色。脱色后的材料可浸泡在70％乙醇中长期保存。在显微镜下观察转化材料的染色结果并拍照，结果见图3和图4所示。由图3和图4可知，无论是在本生烟草叶片还是拟南芥中，cmp28启动子具有与较强启动子表达活性。
30.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。