一种SNP分子标记、PCR引物及应用的制作方法

一种snp分子标记、pcr引物及应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种snp分子标记、pcr引物及应用。


背景技术：

2.由结核分枝杆菌复合群引起的结核病(tuberculosis，tb)是单一致死率最高的传染性疾病。2020年who报告提示，tb感染者20亿，占全球总人数1/3
‑
1/4，而发病人数约1000万例，死亡人数140万例。相应地，我国tb感染者约3.5亿，发病人数为86.6万，死亡3.9万，居世界第三位。
3.结核分枝杆菌复合群隶属分枝杆菌(mycobacterium)属，主要包括结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和肯尼迪分枝杆菌等几个种。在分枝杆菌属内，除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外，还包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌等100多个种，他们也称为非结核分枝杆菌(no
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tuberculosis mycobacteria，ntm)。
4.传统鉴别分枝杆菌的方法是根据菌落形态、氧偏好性、烟酸积累、硝酸盐还原酶的活性等表型特征判断，方法简单、试剂价格便宜，易于推广而被沿用至今。但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性，不能准确、及时地为临床诊断提供参考。随着分子生物学技术的迅速发展，基于pcr等技术，利用分枝杆菌属内同源dna序列的特异性可以完成结核分枝杆菌菌种与分枝杆菌属内其他菌种的鉴定或鉴别，从而为临床诊断和治疗提供了客观依据，同时由于快速、高效、特异性高等优点而倍受青睐。
5.全基因组测序技术伴随分子生物学技术的快速进步而日臻完善，已成为鉴定菌种的“主流技术”。其依据不同种分枝杆菌的dna同源性片段序列的特异性将该分枝杆菌鉴定至种或亚种水平，更进一步极大地提高了分辨力和准确性，同时鉴定时间明显缩短。但是由于其价格昂贵，大多用于科研，很难适用于临床诊断。
6.16srdna是细菌dna序列，可编码染色体上16srrna相对应的序列，是所有细菌染色体基因的固有序列，可用于菌种鉴定。其种类少，含量大，分子大小适中，既能体现不同菌属间的差异，又可通过测序技术较容易测出其序列，作为鉴定分枝杆菌的“金标准”能够将细菌鉴定至种水平。但由于某些分枝杆菌同源dna序列一致性高、亲缘性接近，16srdna序列组成完全一致，从而无法区分一些亲缘关系较近的菌株，比如鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、堪萨斯和胃分枝杆菌等。因此目前急需研发一种改进的准确性高、快速鉴别分枝杆菌的方法。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种snp分子标记、pcr引物及应用。本发明提供的snp分子标记在9种分枝杆菌中具有多态性，通过检测分枝杆菌在snp位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。
9.本发明提供的技术方案如下：
10.在第一方面，本发明提供了一种用于鉴定结核分枝杆菌复合群的snp分子标记，所述snp分子标记包括位于rpob基因上的snp1～snp 8和位于gyrb基因上的snp 9～snp 15；其中，
11.snp1位于seq id no.1所示序列5’端起14位，碱基是a、g；
12.snp2位于seq id no.1所示序列5’端起26位，碱基是c、g；
13.snp3位于seq id no.1所示序列5’端起65位，碱基是c、t；
14.snp4位于seq id no.1所示序列5’端起128位，碱基是c、g；
15.snp5位于seq id no.1所示序列5’端起170位，碱基是g、t或c；
16.snp6位于seq id no.1所示序列5’端起311位，碱基是c、g或t；
17.snp7位于seq id no.1所示序列5’端起421位，碱基是c、t；
18.snp8位于seq id no.1所示序列5’端起498位，碱基是g、a；
19.snp9位于seq id no.2所示序列5’端起32位，碱基是a、g或c；
20.snp10位于seq id no.2所示序列5’端起38位，碱基是g、a或c；
21.snp11位于seq id no.2所示序列5’端起59位，碱基是g、t、c或a；
22.snp12位于seq id no.2所示序列5’端起149位，碱基是a、g或c；
23.snp13位于seq id no.2所示序列5’端起236位，碱基是c、t或g；
24.snp14位于seq id no.2所示序列5’端起302位，碱基是c、t；
25.snp15位于seq id no.2所示序列5’端起437位，碱基是g或a。
26.本发明的snp分子标记在结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌ntm(海分枝杆菌、偶然分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌)之间存在多态性。
27.在第二方面，本发明提供了用于扩增前述的snp分子标记的pcr引物，包括用于扩增seq id no.1所示序列的引物seq id no.3和seq id no.4；以及用于扩增seq id no.2所示序列的引物seq id no.5和seq id no.6。
28.本发明提供的用于鉴别分枝杆菌的引物组合物，该引物组合物能够扩增分布有所述snp标记基因，并且经过优化，缩短了基因长度，能以更快速、灵敏、特异的扩增待测样品中分枝杆菌的rpob基因和gyrb基因。
29.在第三方面，本发明提供了用于检测前述snp分子标记的试剂盒，所述试剂盒包含前述的pcr引物；优选的，所述试剂盒还包含dntps、taq dna聚合酶、mg
2
、pcr反应缓冲液中的至少一种。
30.在第四方面，本发明提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括如前述pcr引物。
31.在第五方面，本发明提供了所述snp分子标记或所述pcr引物或所述试剂盒用于检测和/或鉴定结核分枝杆菌复合群中的应用，本发明提供了所述snp分子标记或所述pcr引物或所述试剂盒用于分枝杆菌的检测和分型中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
32.在第六方面，本发明提供了一种非疾病诊断目的的鉴定结核分枝杆菌复合群的方法，通过检测如前述snp分子标记的多态性来判断待测样品的菌种类型。
33.在一个实施方案中，所述snp分子标记的多态性的检测方法包括以下一种或几种：基于凝胶电泳的snp检测法、dna测序法、dna芯片法、变性高效液相色谱法或质谱检测法。
34.在一个实施方案中，所述方法中，当多态性结果显示snp1～snp 15对应的碱基为actgggtaaagatta时，则为结核分枝杆菌复合群；
35.当snp1～snp 15对应的碱基为ggcctccgcccggcg，则为脓肿分枝杆菌；
36.当snp1～snp 15对应的碱基为actgggtaaaaatta，则为卡内蒂分枝杆菌；
37.当snp1～snp 15对应的碱基为ggcgcccacgcgccg，则为鸟分枝杆菌；
38.当snp1～snp 15对应的碱基为ggccttcgccgcgcg，则为龟分枝杆菌；
39.当snp1～snp 15对应的碱基为ggccttcacgccccg，则为偶然分枝杆菌；
40.当snp1～snp 15对应的碱基为ggcctccacgccccg，则为胞内分枝杆菌；
41.当snp1～snp 15对应的碱基为ggcctgcagcgcccg，则为堪萨斯分枝杆菌；
42.当snp1～snp 15对应的碱基为ggcgtccacgtcccg，则为海分枝杆菌。
43.在一个实施方案中，所述方法还包括获取待检测样本的dna；以所述dna为模板，利用如前述pcr引物进行扩增；扩增产物进行测序，确定所述snp分子标记的多态性。
44.在一个具体的实施方案中，所述方法包括：
45.1)提取待测样品的基因组dna；
46.2)以提取的基因组dna为模板，分别利用seq id no.3～4所示引物以及seq id no.5～6所示引物，通过pcr反应分别扩增出含有核心snp标记的dna片段；
47.3)检测pcr扩增产物，扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在snp位点的多态性。
48.在一个实施方案中，所述扩增的体系中，引物的浓度为350～500nm，优选500nm。
49.在一个实施方案中，在扩增过程中，2组引物采用同一个退火温度，退火温度为58℃～62℃，优选60℃。
50.有益效果：
51.(1)本发明提供的snp分子标记包含的snp位点分布于两个不同的基因，从两个不同基因上的snp多态性来区别不同种分枝杆菌，可以增加不同种分枝杆菌snp之间多态性差别，提高鉴别准确度。
52.(2)本发明提供的snp分子标记在9种分枝杆菌中具有多态性，通过检测分枝杆菌在15个snp位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。
53.(3)本发明提供的鉴定分枝杆菌的方法，无需培养及生化检验等繁琐的步骤，操作简便；快速出检测结果，无需长时间等待。
54.(4)本发明除了鉴别主要侵染人体并引起严重耐药的结核分枝杆菌之外，还可以鉴别临床常见的ntm各种菌，鉴别较全面。
55.(5)本发明的方法无需大型昂贵的检测仪器，只需普通pcr仪及其试剂即可进行实验。
附图说明
56.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
57.图1为本发明实施例提供的rpob与gyrb基因进化树(其中，mycobacterium avium：鸟分枝杆菌；mycolicibacterium fortuitum：偶然分枝杆菌；mycobacteroides chelonae：龟分枝杆菌；mycobacteroides abscessus：脓肿分枝杆菌；mycobacterium marinum：海分枝杆菌；mycobacterium kansasii：堪萨斯分枝杆菌；mycobacterium intracellulare：胞内分枝杆菌；mycobacterium canettii：卡内蒂分枝杆菌)；
58.图2为基于rpob与gyrb基因的临床结果验证(截取了结果图的一部分示出)。
具体实施方式
59.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
60.实施例1：snp分子标记
61.本发明选取的snp分子标记位于rpob基因和gyrb基因上。所选取的基因在分枝杆菌属内部保守度高，且在不同ntm间多样性较强，具体方法为通过在线分析软件meme将目的基因分割为10个较长的片段，遵循mtbc内部差异尽可能小，mtbc与ntm间差异尽可能大的原则，选取基因内部片段作为备选扩增区域。将所选片段导入mega7.0软件进行基因对齐，并标记出可变位点，即为snp，遵循在同一位点snp多样性尽可能强的原则(具有两种或两种以上的碱基类型)，筛选备用。根据目的基因构建进化树可见区别较为显著，见图1。
62.从图1的分子可知，结核分枝杆菌复合群内部不存在差异，如图内展示的l1
‑
l7(lineage 1
‑
lineage7均属于mtb复合群，其中l1对应为indo
‑
oceanic lineage；l2 east
‑
asian lineage；l3 east
‑
african
‑
indian lineage；l4 euro
‑
american lineage；l5和l6为m.africanum west africa 1和m.africanum west africa 2；l7 ethiopian lineage)，而在其他ntm中具有较强的多样性，不同ntm之间也存在较强的差异，是一个有效的分子标识的组合。
63.所提供的snp分子标记中，snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8位于rpob基因，snp9、snp10、snp11、snp12、snp13、snp14、snp15位于gyrb基因。
64.snp1位于seq id no.1所示序列5’端起14位，碱基是a、g；
65.snp2位于seq id no.1所示序列5’端起26位，碱基是c、g；
66.snp3位于seq id no.1所示序列5’端起65位，碱基是c、t；
67.snp4位于seq id no.1所示序列5’端起128位，碱基是c、g；
68.snp5位于seq id no.1所示序列5’端起170位，碱基是g、t或c；
69.snp6位于seq id no.1所示序列5’端起311位，碱基是c、g或t；
70.snp7位于seq id no.1所示序列5’端起421位，碱基是c、t；
71.snp8位于seq id no.1所示序列5’端起498位，碱基是g、a；
72.snp9位于seq id no.2所示序列5’端起32位，碱基是a、g或c；
73.snp10位于seq id no.2所示序列5’端起38位，碱基是g、a或c；
74.snp11位于seq id no.2所示序列5’端起59位，碱基是g、t、c或a；
75.snp12位于seq id no.2所示序列5’端起149位，碱基是a、g或c；
76.snp13位于seq id no.2所示序列5’端起236位，碱基是c、t或g；
77.snp14位于seq id no.2所示序列5’端起302位，碱基是c、t；
78.snp15位于seq id no.2所示序列5’端起437位，碱基是g或a。
79.snp分子标记中各snp位点的分布和碱基类型见表1。
80.表1.snp分子标记中各snp位点的分布和碱基类型
[0081][0082][0083]
实施例2：pcr检测待测的分枝杆菌的种类
[0084]
检测方法：
[0085]
1)提取待测样品的基因组dna；
[0086]
2)以提取的基因组dna为模板，分别利用seq id no.3～4所示引物以及seq id no.5～6所示引物，通过pcr反应分别扩增出含有核心snp标记的dna片段；
[0087]
3)检测pcr扩增产物，扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在snp位点的多态性。
[0088]
表2.pcr引物对
[0089][0090]
seq id no.1：
[0091]
cgtacgcggctccactgttcgtcaccgccgagttcatcaacaacaacaccggtgagatcaagagtcagacggtgttcatgggtgacttcccgatgatgaccgagaagggcacgttcatcatcaacgggaccgagcgtgtggtggtcagccagctggtgcggtcgcccggggtgtacttcgacgagaccattgacaagtccaccgacaagacgctgcacagcgtcaaggtgatcccgagccgcggcgcgtggctcgagtttgacgtcgacaagcgcgacaccgtcggcgtgcgcatc
gaccgcaaacgccggcaaccggtcaccgtgctgctcaaggcgctgggctggaccagcgagcagattgtcgagcggttcgggttctccgagatcatgcgatcgacgctggagaaggacaacaccgtcggcaccgacgaggcgctgttggacatctaccgcaagctgcgtccgggcgagcccccgaccaaagagtcagcgcagacgctgttggaaaacttg。
[0092]
seq id no.2：
[0093]
acgcggtcgacgaggcgatggccggttatgcaaccacagtgaacgtagtgctgcttgaggatggcggtgtcgaggtcgccgacgacggccgcggcattccggtcgccacccacgcctccggcataccgaccgtcgacgtggtgatgacacaactacatgccggcggcaagttcgactcggacgcgtatgcgatatctggtggtctgcacggcgtcggcgtgtcggtggttaacgcgctatccacccggctcgaagtcgagatcaagcgcgacgggtacgagtggtctcaggtttatgagaagtcggaacccctgggcctcaagcaaggggcgccgaccaagaagacggggtcaacggtgcggttctgggccgaccccgctgttttcgaaaccacggaatacgacttcgaaaccgtcgcccgccggctgcaagagatg。
[0094]
pcr反应体系：
[0095]
使用表2中的引物对，采用常规的pcr反应体系，反应体系如下:
[0096]
总体积为20μl，包括2
×
premix taq(code no.:r004a，takara公司，premix是由dna polymerase、buffer、dntp mixture组成的2倍浓度的混合液)10μl，10μm的上下游引物各1μl(终浓度为0.5μm)；
[0097]
dna模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。
[0098]
pcr反应程序：
[0099]
94℃，5min；30个循环：94℃，45sec；60℃，45sec；72℃，50sec，最终延伸72℃，7min。
[0100]
2对引物采用同一个退火温度，减少了操作步骤，节省了菌种鉴别时间。
[0101]
判读在snp位点的多态性，确定菌种类型：
[0102]
若待测样品在以上15位点表现为：actgggtaaagatta，则为结核分枝杆菌复合群；
[0103]
若待测样品在以上15位点表现为：ggcctccgcccggcg，则为脓肿分枝杆菌；
[0104]
若待测样品在以上15位点表现为：actgggtaaaaatta，则为卡内蒂分枝杆菌；
[0105]
若待测样品在以上15位点表现为：ggcgcccacgcgccg，则为鸟分枝杆菌；
[0106]
若待测样品在以上15位点表现为：ggccttcgccgcgcg，则为龟分枝杆菌；
[0107]
若待测样品在以上15位点表现为：ggccttcacgccccg，则为偶然分枝杆菌；
[0108]
若待测样品在以上15位点表现为：ggcctccacgccccg，则为胞内分枝杆菌；
[0109]
若待测样品在以上15位点表现为：ggcctgcagcgcccg，则为堪萨斯分枝杆菌；
[0110]
若待测样品在以上15位点表现为：ggcgtccacgtcccg，则为海分枝杆菌。
[0111]
根据pcr实验验证，针对临床结核菌株具有较强的一致性，是鉴别结核菌与ntm的有效的分子标识，随后我们使用200例临床mtb样本进行验证，由于部分临床菌株间没有snp差异，我们只呈现了具有差异的部分及部分临床菌株结果，见图2。结果基于临床确诊菌株进行分类，与临床结果一致性为100％。该snp分类靶标具有较强的一致性，与ntm之间存在较大的差异，是临床诊断的有效的依据。
[0112]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。