一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法。


背景技术：

2.目前，癌症已经成为世界各国患者的重要死因，而目前化学治疗仍是最为常见的手段之一。在化学治疗和缓解后来自癌症的大多数死亡起因于一种或多种原始治疗肿瘤的复发。aacr规定间充质干细胞“是肿瘤内的细胞，具有自我更新和产生组成肿瘤的癌细胞的异质谱系的能力。因此间充质干细胞只能够依据它们重演不断生长的肿瘤的产生的能力试验性地定义”。
3.大多数抗癌小分子化合物都具有高亲油性和低水溶性，导致其生物利用率低，这常被认为是这些抗癌药物开发和临床应用的一个关键障碍。表面受体lgr5型和lgr6型在多种组织标记成体干细胞，并且在多种类型的癌症中标记间充质干细胞。目前研究发现间充质干细胞外泌体具有与干细胞相似的治疗效果，具有易于冻存、运输、定量和移植等优势，且由于其能在细胞间传递的众多生物活性分子，被认为具有良好的作为药物递送载体的潜力。然而，尚无间充质干细胞外泌体分离并用于干细胞治疗的有效手段及其应用的方法。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，能够间充质干细胞及外泌体的有效分离并用于干细胞治疗的应用。
5.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一方面，提供基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，其包括：(a)从癌细胞的器官样本制备细胞悬液后将其封装在包覆琼脂糖的培养基中；在培养基中实现细胞传代培养；
6.(b)使所述细胞培养基悬液与lgr6型和/或lgr5型结合化合物接触，然后使所述细胞与相应的抗癌化学治疗剂接触至一定时间；
7.(c)量取间充质干细胞上清液，经外泌体分离纯化后，从所述培养基悬液中取出存活细胞，鉴定所述细胞是否与结合化合物结合；
8.(d)将所述间充质干细胞与所述结合化合物分离。
9.根据本发明的一些实施例，所述干细胞是胃干细胞、肝干细胞或肺干细胞中的一种。
10.根据本发明的一些实施例，所述间充质干细胞是脂肪间充质干细胞(adscs)。
11.根据本发明的一些实施例，所述步骤a中的培养基由dmem/f12、缓冲液和少量霉素混合液配制。
12.根据本发明的一些实施例，所述步骤b中的所述结合化合物为能够结合lgr5型或lgr6型的至少两种不同的抗体或抗体衍生物或抗体片段。
13.根据本发明的一些实施例，所述步骤b中的所述抗癌化学治疗剂为丝裂霉素或紫杉醇。
14.根据本发明的一些实施例，所述步骤c中，分离纯化步骤具体包括：量取250毫升间充质干细胞的细胞上清液，经离心去除细胞碎片等沉淀；用真空循环水泵在1bar的负压表压下，将离心后的上清液用0.2微米孔径的pes滤膜完全过滤。
15.根据本发明的一些实施例，所述细胞是对于丝裂霉素有抗性的。
16.根据本发明的一些实施例，所述癌细胞是哺乳动物细胞。
17.本发明还提供一种应用分离后的间充质干细胞的方法，间充质干细胞采用上述任一项的方法制备，并且应用于胃癌、肝癌或肺癌中的一种。
18.本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，能够使间充质干细胞及外泌体的有效分离并用于干细胞治疗的应用。结果提示，该方法分离的间充质干细胞外泌体具有在肿瘤治疗上的应用前景，并可用于药物递送增强其抗肿瘤效应。
附图说明
19.附图1是本发明实施例基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法步骤。
具体实施方式
20.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
21.实施例1
22.步骤a、从癌细胞的器官样本制备细胞悬液后将其封装在包覆琼脂糖的培养基中；在培养基中实现细胞传代培养。
23.选取胃干细胞、肝干细胞或肺干细胞中的一种，将至少大于3代的adscs接种于含有10
‑
15毫升dmem/f12完全培养基的t75细胞培养瓶(tc，透气盖)中，在室温下、二氧化碳浓度为5％的条件下在二氧化碳培养箱中进行初始的培养步骤。培养基由dmem/f12、缓冲液和少量霉素混合液配制。琼脂糖包覆的、含renca细胞的琼脂糖珠依照smith等人，cane res.，71(3)：716
‑
724(2011)；和smith等人，cane.res.71(3)：725
‑
735(2011)进行制备，该制备方式为本领域现有技术。
24.在培养期间，保证每48h更换一次上述的细胞培养基，期间采用室温条件下的进行恒温水浴过的pbs缓冲液(ph＝7.4
‑
7.8)对细胞表面进行初步的清洗，清洗次数可以选择1～2次。上述所有步骤完成后，等待细胞生长至85％～92％的有效汇合度时，进行细胞的传代培养。
25.接下来，待adscs细胞生长至85％～92％汇合度时，舍弃上清，用pbs缓冲液再次清洗细胞表面1～2次，加入1
‑
3毫升胰蛋白酶，置于二氧化碳培养箱中，在室温下、二氧化碳浓度为5％的条件下，消化2.5
‑
3.5分钟。随后在倒置医学显微镜下观察，发现细胞变圆并开始脱离壁面时，加入5
‑
7毫升dmem/f12完全培养基，经吹打混匀后形成细胞悬液，并离心5分
钟。弃上清，加入2毫升完全培养基混匀，按1：2.5比例传代至t75瓶中培养。
26.随后使上述的样品暴露于以三个可变浓度之一的单一的已知抗癌药物。暴露涉及基于药物已知的半衰期，使其在药物的存在下温育一段时间。
27.步骤b、使所述细胞培养基悬液与lgr6型和/或lgr5型结合化合物接触，然后使所述细胞与相应的抗癌化学治疗剂接触至一定时间。
28.抗癌化学治疗剂可以选择细胞毒类的药物中的化疗药物，例如顺铂、卡铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、丝裂霉素等，优选丝裂霉素和紫杉醇，用其处理不破坏封装的肿瘤集落内的所有细胞。紫杉醇和丝裂霉素处理的珠在标准条件下培养，如已暴露于[ch3]2
‑
s
‑
0的对照组一样，所述[ch3]2
‑
s
‑
0是用于递送两种药物的载体。
[0029]
lgr5型或lgr6型结合化合物的能够结合lgr5型或lgr6型的抗体，或者抗体衍生物，或抗体片段，即对lgr5型或lgr6型具有亲和力的抗体或其衍生物或片段。由于lgr5型和lgr6型是跨膜表面蛋白，所以这类抗体或其衍生物或片段优选地具有对朝向外部的蛋白部分的亲和力，即结合任何胞外部分。在优选的实施方案中，所述抗体或抗体衍生物或抗体片段具有对lgr5型和/或lgr6型的高亲和力。合适的抗体片段的实例是scfv、fab或(fab)2片段。合适的衍生物的实例是嵌合抗体、纳米抗体(nanobody)、双功能抗体或人源化抗体(humanized antibody)。
[0030]
在[ch3]2
‑
s
‑
0处理的琼脂糖包覆中封装的细胞显示出正常形态，其呈椭圆形肿瘤集落，由细胞围绕内部碎片的1
‑
2个细胞厚的细胞边缘所组成。相比而言，已用3.5微克/毫升紫杉醇处理的珠显示共42天左右的细胞丧失，到第120天回复处理前的细胞数目。在处理后42天左右时，用丝裂霉素(5微克/毫升)处理的细胞显示仅1
‑
2个细胞/集落的一致模式。在第120天时，约10％的细胞珠群发展为1
‑
3个大集落。
[0031]
步骤c、量取间充质干细胞上清液，经外泌体分离纯化后，从所述培养基悬液中取出存活细胞，鉴定所述细胞是否与结合化合物结合。
[0032]
分离纯化步骤具体包括：量取250毫升间充质干细胞的细胞上清液，经离心去除细胞碎片等沉淀，以降低过滤复杂度；用真空循环水泵在1bar的负压表压下，将离心后的上清液用0.2微米孔径的pes滤膜完全过滤，去除较大规格的细胞碎片、外囊泡等附着杂质物。从所述培养基悬液中取出存活细胞。
[0033]
关于间充质干细胞的标记，可以与其他转录因子结合使用，以诱导成年细胞至多能干细胞样。执行鉴定所述细胞是否与结合化合物结合的步骤，进一步测定在处理后40天左右在丝裂霉素处理的细胞中保留的细胞是否显示出这种标记。
[0034]
将细胞用dapi染色，以鉴定活的细胞，同时采用标准免疫化学程序用于染色oct4，结果指出活的细胞表达oct4。与对于丝裂霉素的抗性一起获得的表达暗示剩余细胞是干细胞。
[0035]
步骤d、将所述间充质干细胞与所述结合化合物分离。
[0036]
将间充质干细胞与所述结合化合物分离，其中facs用于鉴定和分选与结合化合物结合的细胞，并且其中所述集合包含至少50％的间充质干细胞，该间充质干细胞能够重演不断生长的肿瘤的生成。优选地，所述集合包含至少60％
‑
95％的间充质干细胞，该间充质干细胞能够重演不断生长的肿瘤的生成。
[0037]
另外，采用电穿孔法制备的载有姜黄素的外泌体能够抑制癌细胞活性(p＜0.01)，
而电穿孔载药过程，进一步增强了脂肪间充质干细胞外泌体与姜黄素两者混合对肝癌细胞活性，提示了药物与外泌体之间的协同作用，且不抑制正常肝细胞的增殖活性。
[0038]
这种方法可以用于开发用于患有癌症的受试者的预后。任何化学治疗剂都可以用于本发明的方法中，如任何类型的癌症一样。本领域技术人员将知道用于癌症治疗的许多其他已知的治疗剂。此外，本发明中所涉及癌细胞优选是哺乳动物细胞。
[0039]
本发明的其他特征对于技术人员将是明确的并且无需在此处重复。
[0040]
已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性的术语，并且在此类术语和表述的使用中不预期排除所示且描述的特征或其部分的任何等价物，认识到多种修饰在本发明的范围内是可能的。