基因突变位点的用途及突变位点检测方法与流程

1.本发明属于医学诊断领域，尤其涉及甲状腺乳头状癌靶向用药相关突变在甲状腺乳头状癌辅助治疗中的用途。


背景技术：

2.甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,是来源于甲状腺上皮细胞的恶性肿瘤，病理类型主要包括甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,ptc)、甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid cancer,ftc)、甲状腺髓样癌(me
‑
dullary thyroid cancer,mtc)及甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer,atc)，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞，乳头状癌不同亚型预后有差异，但总体预后较好，滤泡状腺癌肿瘤生长较快，属中度恶性，易经血运转移，甲状腺髓样癌较少见，是甲状腺c细胞来源肿瘤，未分化癌最少见，预后很差，平均存活时间3～6个月。甲状腺癌中以乳头状癌在临床上最为多见。
3.甲状腺结节是内分泌系统的多发病和常见病，临床通过触诊获得的甲状腺结节患病率为3
‑
7％，高分辨率b超检查获得的甲状腺结节的患病率为20
‑
76％，在所有甲状腺结节患者中，约5％
‑
15％的患者为恶性，即甲状腺癌。甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，近年来我国甲状腺癌的发病率呈现增高的趋势，是为数不多的发病率逐年增加的癌症。甲状腺结节良恶性的临床处理不同，对患者生存质量的影响和涉及的医疗花费也有显著差异。因此，甲状腺结节评估的要点是良恶性鉴别诊断，目前甲状腺细针穿刺活检测(fnab)是良恶性鉴别诊断敏感度和特异度最高的方法，此方法也是中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南以及美国甲状腺癌患者协会等指南中推荐使用的方法。在良恶性诊断中，病理诊断分子分型十分重要。在结直肠癌患者的临床诊疗过程中，患者除了手术治疗、放化疗、内分泌治疗之外，靶向治疗的科学性和可行性为广大肿瘤患者带来了新的治疗手段。
4.目前检测基因变异的方法主要有4种：扩增阻滞变异系统pcr(amplification refractory mutation system，arms
‑
pcr)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)、一代测序(sanger双脱氧链终止法)及高通量测序法。
5.arms
‑
pcr法是一种在pcr基础上发展起来用于检测dna中各种突变的方法，其依据的基本原理是：taq dna聚合酶缺少3'到5'外切酶活性，因此对于3'末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3'末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增条带，从而表明模板dna没有与引物3'末端相应的突变；如果pcr结果能得到特异长度的扩增条带，表明模板dna上具有与引物3'末端相应的突变。但arms
‑
pcr检测技术通常一个体系只能检出一个突变位点，容易出现假阳性。
6.荧光原位杂交(fish)基本原理：应用荧光染料标记探针dna，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶dna按照碱基互补的原则进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸，在荧光显微镜下观察并记录结果。但fish操作复杂，且每次只能检测小量的样本。
7.一代测序检测原理是：由于ddntp的2’和3’都不含羟基，其在dna的合成过程中不
能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断dna合成反应，在4个dna合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddntp(分为：ddatp、ddctp、ddgtp和ddttp)，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的dna序列。检测突变位点信息具有准确、可靠、检测范围广等优点，是一种检测突变的金标准方法，但检测时间长。
8.高通量测序法是新的测序方法，经过高通量测序仪检测能够检测出目的片段的碱基序列，检测信息准确、可靠，检测范围广、快速，通量高，可同时检测几十万甚至几百万条dna序列。它弥补了普通测序法的缺点，同时能准确快速检测出多种不同的突变类型。因此，高通量测序法的使用势在必行。
9.明确甲状腺乳头状癌的分子分型，有利于合理使用靶向用药，对个体化治疗有指导意义。然而甲状腺乳头状癌的发病与诸多基因突变位点相关，现有技术并没有系统的公开与甲状腺乳头状癌靶向用药相关基因热点突变位点，因而会导致诊断无法做到有的放矢，浪费检测资源和分析数据的资源，检测效率低下，且结论也不够准确。


技术实现要素：

10.针对上述问题，本发明提供基因突变位点的用途，主要解决了现在的甲状腺癌预测精度不高，依然缺少一些精度高的预测手段；同时甲状腺癌的预测手段还需要进行补充。
11.为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
12.基因位点在制备甲状腺癌防治药物和/或制备甲状腺癌检测试剂中的应用，其中，所述基因位点为下述任一
13.pten
‑
p.e299*，pik3ca
‑
p.h1047r，braf
‑
p.g464v，
14.pten
‑
p.h61n，pik3ca
‑
p.e545k，braf
‑
p.g469a，
15.pten
‑
p.q214*，pik3ca
‑
p.e542k，braf
‑
p.g469v，
16.pten
‑
p.q245*，pik3ca
‑
p.e542q，braf
‑
p.n581s，
17.pten
‑
p.q298e，pik3ca
‑
p.e545d，braf
‑
p.g469r，
18.pten
‑
p.w111*，pik3ca
‑
p.e545q，braf
‑
p.v600e，
19.pten
‑
p.y68*，pik3ca
‑
p.e453del，kras
‑
p.g12v，
20.pten
‑
p.p248l，pik3ca
‑
p.n1044k，kras
‑
p.g12c，
21.pten
‑
p.t319fs，pik3ca
‑
p.q546p，kras
‑
p.g12a，
22.tp53
‑
p.y205c，pik3ca
‑
p.r108h，kras
‑
p.g12d，
23.tp53
‑
p.r158l，nras
‑
p.q61r，kras
‑
p.g13d，
24.tp53
‑
p.v157f，nras
‑
p.q61l，kras
‑
p.q61h，
25.tp53
‑
p.r248q，nras
‑
p.q61k，kras
‑
p.a146v，
26.tp53
‑
p.h179r，hras
‑
p.q61r，ret
‑
p.m918t，
27.tp53
‑
p.r175h。
28.一些实施方式中，pten
‑
p.p248l基因位点、pten
‑
p.t319fs基因位点分别具有所述pten
‑
p.p248l位点突变、pten
‑
p.t319fs位点突变；
29.突变点位一种方式在后续进行说明，同样的，当其包含其他等同方案的也应当在本发明保护范围内。
30.检测前述基因位点的试剂在制备甲状腺癌检测试剂中的应用。
31.检测甲状腺癌的检测试剂，所述检测试剂包括检测前述中基因位点的组分。
32.检测甲状腺癌的检测试剂，所述检测试剂包括用于扩增所述基因位点的核苷酸序列引物对和/或捕获所述基因位点的捕获探针。
33.检测甲状腺癌的检测试剂在制备评估甲状腺癌治疗疗效的产品中的应用。
34.所述基因位点表达的抑制剂在制备治疗甲状腺癌药物中的用途。
35.甲状腺癌的防治药物，所述防治药物包括抑制所述基因位点表达的药物。
36.所述甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌。
37.突变pten基因，所述突变pten基因与序列相比，至少包括下述一种位点突变：
38.pten
‑
p.p248l位点突变，碱基变化为c.743c>t；
39.pten
‑
p.t319fs位点突变，碱基变化为c.955_956insaa。
40.高通量测序中捕获方法，包括下述步骤：
41.a部：
42.a1,获取磁珠重悬液，
43.a2,在磁珠重悬液中加入捕获磁珠，待澄清去除上清，
44.a3,再加入磁珠重悬液，离心去除上清，重复若干次，制得重悬捕获液；
45.b部：
46.将pcr产物与重悬捕获液混合，吹打重悬捕获磁珠，pcr孵育，保持捕获磁珠处于悬浮，得捕获样本；
47.在一些方式中，还包括c部：
48.c1,捕获样本中加入捕获清洗液，离心去除上清，
49.c2,加入捕获清洗液，孵育，离心去除上清，优选的，重复若干次，
50.c3,加入捕获清洗液，离心去除上清，优选的，重复若干次，
51.c4,加入无核酸酶水，得清洗产物(一种情况为带磁珠产物)；
52.更进一步，还包括d部：
53.将捕获反应液、捕获引物和产物(该产物为c部清洗产物或b部产物经过清洗)混合，带磁珠产物在一些方式中也可采用其他现有的方法制备而得，优选的采用前述详述的方法，
54.进行扩增反应，
55.加入纯化磁珠，离心去除上清，
56.加入乙醇，旋转静置，去上清，重复若干次，
57.磁力作用，去除废液，
58.磁珠干燥后加入无核酸水，离心后磁力处理，取上清液。
59.在一些方式中，a部中，磁珠重悬液中无核酸酶水的体积浓度为45％～55％，优选为50％，a3中再加入磁珠重悬液后振荡；
60.b部中，pcr孵育孵育条件为60
‑
65℃；
61.c部中，加入的捕获清洗液中无核酸酶水的体积浓度为85％～95％，优选为95％；和/或
62.c1、c4中，捕获清洗液进行预热；和/或
63.c3中，第一加入的捕获清洗液进行预热；
64.优选的，c1、c4中捕获清洗液预热温度、c3中第一加入的捕获清洗液进行预热温度均为60
‑
65℃；和/或
65.d部中，捕获反应液、捕获引物和带磁珠产物混合体积比为5：1：4，
66.扩增反应为pcr扩增，热盖温度为103
‑
107℃，优选为105℃。
67.本发明的有益效果是：
68.本发明提供了与甲状腺乳头状癌靶向用药相关的比例靠前的突变基因，因而可以有目的性的对这些位点进行检测，可以更好地用于辅助治疗，有效减小检测和数据分析的工作量，降低了检测时间和成本。同时还发现了新的突变位点，为甲状腺癌诊断治疗提供了新的思路。提出了新的捕获方法，使得测序效果更加优异精准。
附图说明
69.图1为甲状腺基因突变实验概述说明图。
具体实施方式
70.下面对本发明做进一步说明：
71.基因位点在制备甲状腺癌防治药物和/或制备甲状腺癌检测试剂中的应用，其中，所述基因位点为下述任一
72.pten
‑
p.e299*，pik3ca
‑
p.h1047r，braf
‑
p.g464v，
73.pten
‑
p.h61n，pik3ca
‑
p.e545k，braf
‑
p.g469a，
74.pten
‑
p.q214*，pik3ca
‑
p.e542k，braf
‑
p.g469v，
75.pten
‑
p.q245*，pik3ca
‑
p.e542q，braf
‑
p.n581s，
76.pten
‑
p.q298e，pik3ca
‑
p.e545d，braf
‑
p.g469r，
77.pten
‑
p.w111*，pik3ca
‑
p.e545q，braf
‑
p.v600e，
78.pten
‑
p.y68*，pik3ca
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p.e453del，kras
‑
p.g12v，
79.pten
‑
p.p248l，pik3ca
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p.n1044k，kras
‑
p.g12c，
80.pten
‑
p.t319fs，pik3ca
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p.q546p，kras
‑
p.g12a，
81.tp53
‑
p.y205c，pik3ca
‑
p.r108h，kras
‑
p.g12d，
82.tp53
‑
p.r158l，nras
‑
p.q61r，kras
‑
p.g13d，
83.tp53
‑
p.v157f，nras
‑
p.q61l，kras
‑
p.q61h，
84.tp53
‑
p.r248q，nras
‑
p.q61k，kras
‑
p.a146v，
85.tp53
‑
p.h179r，hras
‑
p.q61r，ret
‑
p.m918t，
86.tp53
‑
p.r175h。
87.上述突变位点为与甲状腺乳头状癌靶向用药相关的比例靠前的热点突变，它们可以用于甲状腺乳头状癌的辅助治疗。
88.辅助治疗可以包含多方面的内容，例如用药指导(包括疗效评估)和预后预测等。“用药指导”在本发明中可以指本领域技术人员可根据本发明所提供的突变位点判断和调整甲状腺乳头状癌的药物种类，并确定给药方式(给药量、给药间隔等)。
89.一些实施方式中，pten
‑
p.p248l基因位点、pten
‑
p.t319fs基因位点分别具有所述pten
‑
p.p248l位点突变、pten
‑
p.t319fs位点突变。在另一些情况中，pten
‑
p.p248l基因位
点、pten
‑
p.t319fs基因位点其他突变形式、且具有与本发明相同或相近辅助治疗机理时，也应当落入本发明保护范围内。
90.检测前述基因位点的试剂在制备甲状腺癌检测试剂中的应用。
91.检测甲状腺癌的检测试剂，所述检测试剂包括检测前述中基因位点的组分。
92.检测甲状腺癌的检测试剂，所述检测试剂包括用于扩增所述基因位点的核苷酸序列引物对和/或捕获所述基因位点的捕获探针。
93.检测甲状腺癌的检测试剂在制备评估甲状腺癌治疗疗效的产品中的应用。
94.所述基因位点表达的抑制剂在制备治疗甲状腺癌药物中的用途。
95.甲状腺癌的防治药物，所述防治药物包括抑制所述基因位点表达的药物。
96.所述甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌。
97.突变pten基因，所述突变pten基因与序列相比，至少包括下述一种位点突变：
98.pten
‑
p.p248l位点突变，碱基变化为c.743c>t；
99.pten
‑
p.t319fs位点突变，碱基变化为c.955_956insaa。
100.下表为一些基因位点突变的捕获探针序列：
[0101][0102][0103]
在一些实施方式中，上述突变位点用于甲状腺乳头状癌的诊断或辅助诊断。
[0104]
在一些实施方式中，所述检测试剂于核酸水平进行检测。
[0105]
高通量测序中捕获方法，包括下述步骤：
[0106]
a部：
[0107]
a1,获取磁珠重悬液，
[0108]
a2,在磁珠重悬液中加入捕获磁珠，待澄清去除上清，
[0109]
a3,再加入磁珠重悬液，离心去除上清，重复若干次，制得重悬捕获液；
[0110]
b部：
[0111]
将pcr产物与重悬捕获液混合，吹打重悬捕获磁珠，pcr孵育，保持捕获磁珠处于悬浮，得捕获样本；
[0112]
c部：
[0113]
c1,捕获样本中加入捕获清洗液，离心去除上清，
[0114]
c2,加入捕获清洗液，孵育，离心去除上清，优选的，重复若干次，
[0115]
c3,加入捕获清洗液，离心去除上清，优选的，重复若干次，
[0116]
c4,加入无核酸酶水，得带磁珠产物；以及和/或
[0117]
d部：
[0118]
将捕获反应液、捕获引物和带磁珠产物混合，
[0119]
进行扩增反应，
[0120]
加入纯化磁珠，离心去除上清，
[0121]
加入乙醇，旋转静置，去上清，重复若干次，
[0122]
磁力作用，去除废液，
[0123]
磁珠干燥后加入无核酸水，离心后磁力处理，取上清液。
[0124]
另一些在本发明步骤上的细微改变，比如加料顺序、物料浓度，只要没有引起效果的突变，也应当落入本发明范围内。
[0125]
a部中，磁珠重悬液中无核酸酶水的体积浓度为45％～55％，优选为50％，a3中再加入磁珠重悬液后振荡；
[0126]
b部中，pcr孵育孵育条件为60
‑
65℃；
[0127]
c部中，加入的捕获清洗液中无核酸酶水的体积浓度为85％～95％，优选为95％；和/或
[0128]
c1、c4中，捕获清洗液进行预热；和/或
[0129]
c3中，第一加入的捕获清洗液进行预热；
[0130]
优选的，c1、c4中捕获清洗液预热温度、c3中第一加入的捕获清洗液进行预热温度均为60
‑
65℃；
[0131]
d部中，捕获反应液、捕获引物和带磁珠产物混合体积比为5：1：4，其他采用与本比例相近的方案也应当等同在本发明范围内。
[0132]
扩增反应为pcr扩增，热盖温度为103
‑
107℃，优选为105℃。
[0133]
通过a、b两部的步骤设计，通过对方法的重新设计，使得测量的效果更优异；后续进一步进行清洗、纯化来进一步提高测量效果。
[0134]
核酸水平(dna或rna水平)的检测试剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该dna或rna杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等，当然在这些引物或探针被用于本发明请求保护的方案中时，理应受到本发明的制约。并且将mrna反转录成cdna后对cdna进行检测，这些技术手段的也应当等同的落入本发明的保护范围。
[0135]
检测试剂在一些情况中用于执行以下任一种方法：
[0136]
聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及hrm法。
[0137]
聚合酶链一些反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、taqman探针法、竞争性等位基因特异性pcr和等位基因特异性pcr。
[0138]
生物质谱法选自飞行质谱仪检测。
[0139]
核酸测序法选自snapshot法。
[0140]
在本发明的一些实施方式中，所述核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法是高通量测序，也称作二代测序(“ngs”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。ngs区别于“sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用于本发明的ngs的测序平台可以是商用可得的，包括但不限于illumina miniseq、nextseq 550等。
[0141]
检测试剂包含文库封闭液、接头封闭液、杂交反应液、杂交增强液、捕获探针、捕获反应液、捕获引物中的至少一种。
[0142]
检测试剂于蛋白水平进行检测。
[0143]
检测试剂用于执行以下任一种方法：
[0144]
生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
[0145]
用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化、elisa以及western blot等。
[0146]
下面结合一些具体的实施示例做进一步说明。
[0147]
本实施例采用高通量测序发现甲状腺乳头状癌相关的热点突变，高通量测序检测甲状腺乳头状癌杂交捕获的方法，包括以下步骤：
[0148]
一.实验设计和样本选择
[0149]
选取的样本说明：以下实施例所用的201例样本，使用相同批次的试剂，考察甲状腺乳头状癌杂交捕获试剂盒对不同突变类型的适用性，发现甲状腺乳头状癌靶向用药相关基因突变。分别编号为样本t1
‑
t201。
[0150]
二.实验方法
[0151]
(一)杂交
[0152]
1取出文库封闭液和接头封闭液，溶解后振荡瞬时离心，备用。
[0153]
2按混合文库总量≥500ng进行文库混合，置于新的0.2ml pcr管中，备用。
[0154]
3往上述0.2ml pcr管中依次加入文库封闭液5μl和接头封闭液2μl，振荡混匀后，瞬时离心。
[0155]
表1杂交封闭反应体系
[0156]
组分反应体积(μl)文库封闭液5接头封闭液2混合文库x反应体系总体积7 x
[0157]
4将上述0.2ml pcr管打开管盖，置于真空抽滤系统中(v
‑
aq模式、60℃)干燥成干粉，约30～60分钟。
[0158]
5取出杂交反应液和杂交增强液，溶解后振荡混匀，瞬时离心。在使用杂交反应液之前，检查是否出现结晶，如出现可于65℃水浴中孵育，期间涡旋混匀，直到结晶完全融解(可能数小时)。
[0159]
6往上述0.2mlpcr管中依次加入1.8μl无核酸酶水、2.7μl杂交增强液和8.5μl杂交反应液，振荡混匀或吹打混匀，瞬时离心，室温静置5分钟。
[0160]
表2杂交反应体系
[0161]
组分反应体积(μl)无核酸酶水1.8杂交反应液8.5杂交增强液2.7混合文库(干粉)/反应体系总体积13
[0162]
7将上述0.2ml pcr管置于pcr仪上，按下列条件进行反应：
[0163]
表3杂交反应条件
[0164][0165]
8反应结束后迅速将上述0.2mlpcr管置于冰板/冰盒上，并加入4μl捕获探针，振荡混匀，瞬时离心。
[0166]
表4捕获反应体系
[0167]
组分反应体积(μl)捕获探针4文库杂交变性产物13反应体系总体积17
[0168]
9将上述0.2ml pcr管置于pcr仪上，按下列条件进行反应：
[0169]
表5文库杂交反应条件
[0170][0171]
(二)捕获
[0172]
1准备
[0173]
1.1按下表将磁珠重悬液配制成1
×
磁珠重悬液。
[0174]
表6 1
×
磁珠重悬液配制
[0175]
试剂名称原体积(μl)无核酸酶水体积(μl)1
×
磁珠重悬液总体积(μl)磁珠重悬液250250500
[0176]
1.2取出捕获磁珠平衡至室温。
[0177]
2手动轻微摇匀后吸取100μl捕获磁珠至1.5ml低吸附离心管中，置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0178]
3往上述低吸附离心管中加入200μl 1
×
磁珠重悬液，轻微振荡重悬捕获磁珠3秒，瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0179]
4重复步骤3一次。
[0180]
5往上述低吸附离心管中加入100μl 1
×
磁珠重悬液，轻微振荡重悬捕获磁珠3秒，并连同捕获磁珠全部转移至新的0.2ml pcr管中，瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清，备用。
[0181]
6捕获磁珠与产物结合：将上述pcr产物转移至上述装有捕获磁珠的0.2mlpcr管中，吹打重悬捕获磁珠后置于pcr仪上65℃孵育45分钟，中间间隔15分钟振荡混匀3秒，保持捕获磁珠处于悬浮状态。
[0182]
7清洗捕获磁珠，去除未结合的dna。
[0183]
表7磁珠清洗液配制
[0184][0185]
8根据上表配制出1
×
捕获清洗液ⅰ、1
×
捕获清洗液ⅱ、1
×
捕获清洗液ⅲ和1
×
捕获清洗液。并将100μl 1
×
捕获清洗液ⅰ和全部的1
×
捕获清洗液置于65℃中预热。
[0186]
9往步骤6得到的捕获后样本管中迅速加入100μl预热的1
×
捕获清洗液ⅰ，吹打混匀后迅速将液体全部转移至新的1.5ml低吸附离心管中，瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0187]
10往上述低吸附离心管中迅速加入200μl预热的1
×
捕获清洗液，振荡混匀，65℃孵育5分钟；瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0188]
11重复步骤10一次。
[0189]
12往上述1.5ml低吸附离心管中加入200μl 1
×
捕获清洗液ⅰ，振荡2分钟；瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0190]
13往上述1.5ml低吸附离心管中加入200μl 1
×
捕获清洗液ⅱ，振荡1分钟；瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0191]
14往上述1.5ml低吸附离心管中加入200μl 1
×
捕获清洗液ⅲ，振荡30秒；瞬时离心后置于磁力架上，待澄清后弃上清。
[0192]
15往上述1.5ml低吸附离心管中加入20μl无核酸酶水，振荡重悬捕获磁珠后将含捕获磁珠的液体全部转移至新的0.2mlpcr管中，备用。
[0193]
(三)pcr扩增与扩增产物的纯化
[0194]
1将捕获反应液、捕获引物置于室温溶解，振荡混匀后按下表依次在上述0.2mlpcr管加入捕获反应液、捕获引物。
[0195]
表8捕获文库pcr扩增反应体系
[0196]
试剂名称反应体积(μl)捕获反应液25捕获引物5带磁珠产物20反应体系总体积50
[0197]
2将上述0.2ml pcr管振荡混匀，瞬时离心后置于pcr仪上反应，反应程序为：
[0198]
表9捕获文库pcr扩增反应条件
[0199][0200][0201]
3将上述0.2mlpcr管中的pcr扩增产物全部转移至新的1.5ml低吸附离心管中，并加入75μl已置于室温平衡的纯化磁珠，振荡混匀，室温静置10分钟。
[0202]
4瞬时离心后置于磁力架上3分钟，待澄清后弃上清。
[0203]
5往上述1.5ml低吸附离心管中加入200μl 80％乙醇，将低吸附离心管旋转2圈，每半圈静置10秒，弃上清。
[0204]
6重复步骤5一次。
[0205]
7将上述1.5ml低吸附离心管从磁力架取下，瞬时离心后再次置于磁力架上，用10μl移液器吸弃全部废液。
[0206]
8将上述1.5ml低吸附离心管管盖打开，室温静置5分钟，待磁珠干燥后加入22μl无核酸酶水，振荡混匀，室温静置2分钟，瞬时离心后置于磁力架上2分钟。
[0207]
注意事项：避免磁珠干裂，磁珠表面无亮光即可。
[0208]
9在上述1.5ml低吸附离心管中转移20μl上清至新的1.5ml低吸附离心管中，即为杂交捕获后的文库。可置于
‑
25～
‑
15℃中保存，此条件下可保存6个月。
[0209]
10使用核酸定量仪检测杂交捕获后的文库，浓度≥0.5ng/ul即可。
[0210]
三.实验结果
[0211]
表10高通量测序实验结果
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217][0218]
注：表中基因、突变位点、突变频率三栏均显示
‑
，代表为braf、nras、pik3ca、pten、ret、kras、tp53、hras基因野生型，即阴性，无变异频率。
[0219]
四.结果分析
[0220]
1.年龄分布分析
[0221]
在201例样本中，甲状腺乳头状癌患者的年龄分布主要集中在51～60岁的区段中。
[0222]
表11样本年龄分布表
[0223][0224][0225]
2.性别比例分析
[0226]
在201例样本中，女性样本165例，占比82.09％，男性样本36例，占比17.91％。
[0227]
3.阳性率分析
[0228]
表12甲状腺乳头状癌靶向用药基因例数分析
[0229][0230]
在201例样本中，阳性样本为89例，阳性率为44.28％。阴性样本，即braf、nras、pik3ca、pten、ret、kras、tp53、hras基因野生型样本为112例。
[0231]
4.突变位点例数分析
[0232]
甲状腺乳头状癌靶向用药基因样本为89例。
[0233]
表13甲状腺乳头状癌靶向用药基因例数分析
[0234][0235][0236]
5.检测范围的基因和突变位点
[0237]
表14检测范围的基因和突变位点
[0238]
[0239][0240]
6.热点突变位点比例分析
[0241]
表15甲状腺乳头状癌靶向用药相关基因热点突变位点比例分析
[0242]
[0243][0244]
五.实验结论
[0245]
通过201例临床样本的验证，碱基识别质量百分比(q30)均大于80％，有效测序深度平均值均大于500，总比对碱基数的比例均大于90％，质控标准均合格。
[0246]
采用临床样本进行验证，符合率100％。验证了高通量测序检测甲状腺乳头状癌的杂交捕获试剂盒有较好的准确性和特异性。
[0247]
对于甲状腺乳头状癌患者的年龄分布主要集中在51～60岁的区段中，性别比例分析，甲状腺乳头状癌患者女性略高于男性。在201例样本中，阳性样本为89例，阳性率为44.28％。甲状腺乳头状癌靶向用药基因样本为89例。试剂盒检测范围为43个位点。
[0248]
发现43个甲状腺乳头状癌靶向用药相关基因突变。甲状腺乳头状癌靶向用药相关基因热点突变位点比例前5位分别为：braf基因v600e位点、nras基因q61r位点、ret基因m918t位点、nras基因q61k位点、hras基因q61r位点。
[0249]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0250]
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。