雌激素受体相关受体γ（ESRRG）变异型转录本在垂体腺瘤辅助诊断中的应用的制作方法

雌激素受体相关受体
γ
(esrrg)变异型转录本在垂体腺瘤辅助诊断中的应用
技术领域
1.本发明涉及垂体腺瘤辅助诊断领域，尤其涉及雌激素受体相关受体γ(esrrg)变异型转录本在垂体腺瘤，特别是泌乳素型垂体腺瘤辅助诊断中的应用。


背景技术：

2.垂体瘤是最常见的颅内肿瘤之一，约占颅内肿瘤的10-15％，人群发病率约为8-9/万。随着影像技术的发展，其检出率呈现逐年增高的趋势。垂体瘤根据不同的内分泌特性，可分为泌乳素型、生长激素型、促肾上腺皮质激素型、促甲状腺素型、无功能型以及混合型等若干亚型。肿瘤通过异常分泌各种激素，导致患者出现不孕不育、肢端肥大、cushing综合征、甲亢等显著的内分泌紊乱症状。
3.垂体腺瘤被认为是良性肿瘤，但是，部分肿瘤表现出耐药，并且体积巨大，同时向周边侵袭性生长，手术中极难获得肿瘤全切除，并且该部分患者预后较差，推测他们可能分属于垂体腺瘤两种不同的亚型，对其应该采取不同的临床治疗策略。目前尚无特异性的分子诊断标记物可以对他们进行诊断，甚至鉴别诊断。
4.孤儿核受体(orphan nuclear receptors，onrs)是属于转录因子超家族中的一员，是一类无需与配体结合即可产生生物学功能的核受体，可直接参与调控多种功能有关的基因。雌激素受体相关受体(estrogen receptor-related receptors，esrrs)是一类与雌激素受体(estrogen receptor，er)密切相关的核激素受体。esrrs在与其共激活因子(co-activator)结合时不需要与任何内、外源配体的参与，被认为是组成型活性的孤儿核激素受体(constitutively active orphan nuclear hormone receptors)，属于核受体第三亚族b组成员(nuclear receptor subfamily 3group b member，nr3b)。研究表明，esrrs包含3种不同的亚型，雌激素受体相关受体α(esrrα)、雌激素受体相关受体β(esrrβ)和雌激素受体相关受体γ(esrrγ，即esrrg)。esrrg与雌激素受体(er)共享共同的目的基因，共调节因子以及共同的启动子，而er是正常垂体及催乳素瘤中prl启动子调节的核心分子，通过与prl启动子远端的ere元件(estrogen response element，雌激素反应元件)结合调控prl的转录，而esrrg可以在不依赖于雌激素的前提下，发挥与er受体类似的作用。研究表明，esrrg基因与肿瘤细胞代谢、增殖、转移等有关，包括胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤。
5.pre-mrna分子的选择性可变剪接是通过选择性去除内含子并连接外显子的过程，是一个重要的转录后调节机制，通过选择性剪接，单一基因可以产生多个转录本和蛋白。pre-mrna分子选择性剪接过程在人类疾病中经常出现异常，这一过程在肿瘤中也经常发生异常。异常的pre-mrna分子选择性剪接可以促进肿瘤的发生和发展，越来越多的证据显示，通过产生致癌性的基因变异体，异常剪接能够影响细胞增殖、迁移能力和凋亡的敏感性。异常的转录本也可以作为肿瘤分子标志物在肿瘤的诊断、治疗和判断预后中发挥重要作用。
6.目前尚没有esrrg的异常转录本应用于垂体腺瘤，特别是泌乳素型垂体腺瘤诊断
的报道。基于现有技术中诊断上述疾病的手段的局限性，若能筛选出esrrg的异常转录本作为分子诊断标记物，从而找到一种有效、廉价的能够在辅助诊断或筛查垂体腺瘤，特别是泌乳素型垂体腺瘤的方法是亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于筛选出垂体腺瘤易感的雌激素受体相关受体γ(esrrg)变异型转录本作为分子诊断标记物，并研制相应的诊断试剂盒，进行垂体腺瘤检测，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，同时该方法也适用于垂体腺瘤，特别是泌乳素型垂体腺瘤的肿瘤分型、恶性程度评价以及为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。
8.具体来说，本发明提出了如下技术方案：
9.在一方面，本发明提供了一种检测变异型esrrg转录本或其片段的产品在制备用于辅助诊断垂体腺瘤、区分经典型和变异型esrrg垂体腺瘤、或预测垂体腺瘤是否恶性的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述变异型esrrg转录本片段具有与经典型esrrg转录本相异的21bp核苷酸片段；所述经典型esrrg垂体腺瘤是指主要表达经典型esrrg转录本的垂体腺瘤；所述变异型esrrg垂体腺瘤是指主要表达变异型esrrg转录本的垂体腺瘤。
10.在一方面，本发明提供了一种检测变异型esrrg转录本翻译蛋白或其片段的产品在制备用于辅助诊断混合性泌乳素垂体腺瘤的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述变异型esrrg转录本翻译蛋白片段具有与经典型esrrg转录本翻译蛋白相异的8个氨基酸片段。
11.在一方面，本发明提供了一种检测变异型esrrg转录本的引物。
12.在一方面，本发明提供了一种辅助诊断垂体腺瘤、区分经典型和变异型esrrg垂体腺瘤、或预测垂体腺瘤是否恶性的试剂盒。
13.下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：
附图说明
14.图1示出了正常垂体样本和泌乳素垂体腺瘤样本中转录本的情况。
15.图2示出了变异型esrrg转录本和经典型esrrg转录本差异部分片段，其中，图2a为变异型esrrg转录本片段，图2b为经典型esrrg转录本片段。
16.图3示出了经典型esrrg转录本翻译蛋白np_001230448.1与变异型esrrg转录本翻译蛋白np_001230447.1的氨基酸序列的比对结果。
17.图4示出了正常垂体样本、经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本以及变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本中esrrg mrna的表达水平。
18.图5示出了正常垂体样本、经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本以及变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本中变异型esrrg相对于经典型esrrg mrna的比值。
19.图6示出了质粒pdc316-mcmv-zsgreen的酶切图谱。
20.图7a和7b分别示出了pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg16-26#克隆(图7a)、pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg17-29#克隆(图7b)质粒酶切鉴定结果。
21.图8a和8b分别示出了质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg16转染hek293细胞24h后
的荧光图(图8a)，转染24h后白光图(图8b)。
22.图9a和9b分别示出了质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg17转染hek293细胞24h后的荧光图(图9a)，转染24h后白光图(图9b)。
23.图10示出了腺病毒ad-zsgreen-esrrg16感染hek293荧光图。
24.图11示出了腺病毒ad-zsgreen-esrrg17感染hek293荧光图。
25.图12示出了原代泌乳素垂体腺瘤细胞敲除esrrg后细胞中esrrg mrna的表达水平。
26.图13示出了原代泌乳素垂体腺瘤细胞敲除esrrg后esrrg表达水平的蛋白质印迹分析。
27.图14示出了原代泌乳素垂体腺瘤细胞敲除esrrg后细胞上清中的泌乳素分泌水平的变化。
28.图15示出了esrrg对原代泌乳素垂体腺细胞分泌泌乳素(prl)的影响。
29.图16示出了esrrg对gh3细胞增殖的影响。
30.图17示出了esrrg对mmq细胞增殖的影响
31.图18示出了esrrg对gh3细胞的细胞克隆形成的影响。
32.图19示出了esrrg对mmq细胞的细胞克隆形成的影响
33.图20示出了esrrg对gh3细胞凋亡的影响。
34.图21示出了esrrg对mmq细胞凋亡的影响。
具体实施方式
35.除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。虽然与本文中所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明实践或测试中，但是描述了优选方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
36.术语“经典型esrrg转录本”指genbank
tm
登记号为nm_001243519.1的esrrg转录本，称为经典型esrrg(canonical esrrg)转录本。经典型esrrg转录本包含经典型esrrg转录本片段。
37.术语“变异型esrrg转录本”指genbank
tm
登记号为nm_001243518.1的esrrg转录本，称为变异型esrrg(cryptic esrrg)转录本。变异型esrrg转录本包含变异型esrrg转录本片段。
38.术语“转录本”指由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mrna。
39.术语“经典型esrrg垂体腺瘤”指主要表达经典型esrrg转录本的垂体腺瘤。
40.术语“变异型esrrg垂体腺瘤”指主要表达变异型esrrg转录本的垂体腺瘤。
41.术语“基因”指参与产生多肽链的dna区段；其包括参与基因产物的转录/翻译和所述转录/翻译调节的编码区之前和之后的区域(前导区和尾部区)，以及单个编码区(外显子)之间的插入序列(内含子)。
42.术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸
聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即，抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。
43.术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。
44.在本文中，氨基酸可用iupac-iub生物化学命名委员会推荐的通用三字母代号或单字母代号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。
45.术语“模板”指能用于本发明所述扩增的任意核酸分子。非天然双链的rna或dna可制成双链dna从而用作双链dna。含有多种不同双链dna分子的任意双链dna或制品可用作模板dna以扩增包含在模板dna内的一个或多个感兴趣基因座。
46.术语“引物”指能用于扩增方法如聚合酶链反应(pcr)的寡核苷酸，所述扩增方法用于根据多核苷酸序列扩增核苷酸序列，所述多核苷酸对应于特定基因组序列。用于扩增多核苷酸序列的至少一种pcr引物对所述序列为序列特异性。
47.术语“探针”是指与另一分子的特异性序列或子序列或其他部分结合的分子。除非另有说明，否则术语“探针”通常是指通过互补碱基配对与另一种多核苷酸(通常称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。探针可以结合与探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸，这取决于杂交条件的严格性。探针可以被直接或间接标记。
48.术语“扩增反应”指用于一次或多次拷贝核酸的过程。在实施方式中，所述扩增方法包括但不限于：聚合酶链反应，自持序列反应，连接酶链反应，cdna末端快速扩增，聚合酶链反应和连接酶链反应，q-β噬菌体扩增，链置换扩增，或重叠延伸拼接聚合酶链反应。在一些实施方式中，扩增单分子核酸，例如，通过数字pcr。
49.术语“扩增产物”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
50.术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。例如，本发明的生物标志物，例如与经典型esrrg转录本相异的21bp的变异型esrrg转录本的核苷酸片段与辅助诊断泌乳素(prl)型腺瘤有关。这些生物标志物包括(但不限于)生物分子，其包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。该术语还包括生物分子的部分或片段，例如，包含至少5个连续的氨基酸残基、至少6个连续的氨基酸残基、至少7个连续的氨基酸残基、至少8个连续的氨基酸残基或更多个连续的氨基酸残基的蛋白质或多肽的肽片段。
51.术语“患者”和“受试者”可互换使用，是指人类或其他哺乳动物的患者和受试者，并且包括使用本发明的方法进行检查或治疗的任何个体。但是，应当理解，“患者”并不意味着存在症状。落入本发明范围内的合适的哺乳动物包括但不限于灵长类动物、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如猫、狗)和圈养的野生动物(例如考拉、熊、野猫、野狗、狼、澳洲野狗、狐狸等)。
52.如此处所用的术语“试剂盒”是指用来递送物质的任何递送系统。在反应测定中，这类递送系统包括将反应试剂(例如适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如缓
冲液、进行测定的说明书等)贮存、从一个位置转运或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包含一个或多个外壳(例如盒子)，其中包含有关的反应试剂和/或支持材料。
53.在一方面，本发明提供了一种检测变异型esrrg转录本或其片段的产品在制备用于辅助诊断垂体腺瘤、区分经典型和变异型esrrg垂体腺瘤、或预测垂体腺瘤是否恶性的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述变异型esrrg转录本或其片段具有与经典型esrrg转录本相异的21bp核苷酸片段；所述经典型esrrg垂体腺瘤是指主要表达经典型esrrg转录本的垂体腺瘤；所述变异型esrrg垂体腺瘤是指主要表达变异型esrrg转录本的垂体腺瘤。
54.在一个优选的技术方案中，所述垂体腺瘤是泌乳素垂体腺瘤。
55.在一个优选的技术方案中，所述相异的21bp核苷酸片段的核苷酸序列如seq id no:11所示。
56.在一个优选的技术方案中，所述变异型esrrg转录本包含seq id no:3所示的核苷酸序列。
57.在一个优选的技术方案中，所述变异型esrrg转录本包含seq id no:5所示的核苷酸序列。
58.在一个优选的技术方案中，所述产品包括通过pcr技术检测所述变异型esrrg转录本或其片段的试剂。
59.在一个优选的技术方案中，所述产品包括pcr扩增反应试剂混合液、针对变异型esrrg转录本的引物对；优选地，所述pcr扩增反应试剂混合液包括taqdna聚合酶、dntp混合液、mgcl2溶液、荧光定量pcr反应缓冲液和去离子水。
60.在一个优选的技术方案中，所述产品还包括通过pcr技术检测所述经典型esrrg转录本或其片段的试剂；优选地，所述产品还包括pcr扩增反应试剂混合液、针对经典型esrrg转录本的引物对；优选地，所述pcr扩增反应试剂混合液包括taqdna聚合酶、dntp混合液、mgcl2溶液、荧光定量pcr反应缓冲液和去离子水。
61.在一个优选的技术方案中，所述pcr为数字pcr或荧光定量pcr(qpcr)。
62.在一个优选的技术方案中，所述经典型esrrg转录本包含seq id no:7所示的核苷酸序列。
63.在一个优选的技术方案中，所述变异型esrrg转录本包含seq id no:9所示的核苷酸序列。
64.在一个优选的技术方案中，所述针对变异型esrrg转录本的引物对中的正向引物的核苷酸序列如seq id no:15所示，所述针对变异型esrrg转录本的引物对中的反向引物的核苷酸序列如seq id no:16所示。
65.在一个优选的技术方案中，所述针对经典型esrrg转录本的引物对中的正向引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述针对经典型esrrg转录本的引物对中的反向引物的核苷酸序列如seq id no:14所示。
66.在一方面，本发明提供了一种检测变异型esrrg转录本翻译蛋白或其片段的产品在制备用于辅助诊断垂体腺瘤的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述变异型转录本翻译蛋白或其片段具有与经典型转录本翻译蛋白相异的8个氨基酸片段。
67.在一个优选的技术方案中，所述相异的8个氨基酸片段的氨基酸序列如seq id no:12所示。
68.在一个优选的技术方案中，所述产品包括检测变异型esrrg转录本翻译蛋白或其片段的抗体和/或蛋白质芯片。
69.在一个优选的技术方案中，所述变异型esrrg转录本翻译蛋白包含seq id no:6所示的氨基酸序列。
70.在一个优选的技术方案中，所述产品还包括检测经典型esrrg转录本翻译蛋白或其片段的试剂；优选地，所述经典型esrrg转录本翻译蛋白包含seq id no:10所示的氨基酸序列。
71.在一方面，本发明提供了一种检测变异型esrrg转录本的引物，其中，其包括针对变异型esrrg转录本的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:15所示，所述引物对中的反向引物的核苷酸序列如seq id no:16所示。
72.在一方面，本发明提供了一种辅助诊断垂体腺瘤、区分经典型和变异型esrrg垂体腺瘤、或预测垂体腺瘤是否恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测变异型esrrg转录本或其片段的产品和/或检测变异型esrrg转录本翻译蛋白或其片段的产品，其中，所述变异型esrrg转录本或其片段具有与经典型esrrg转录本相异的21bp核苷酸片段；所述变异型esrrg转录本翻译蛋白或其片段具有与经典型转录本翻译蛋白相异的8个氨基酸片段。
73.本发明有益效果包括：
74.(1)根据esrrg转录本存在异常转录本与否将泌乳素垂体腺瘤区分被经典型(canonical)esrrg泌乳素垂体腺瘤和变异型(cryptic)esrrg泌乳素垂体腺瘤两种亚型。可以通过检测esrrg转录本是否存在异常转录本判断泌乳素垂体腺瘤的不同亚型，从而及时采取不同的临床治疗策略。
75.(2)变异型(cryptic)esrrg转录本可以作为恶性预测的标志。
76.实施例
77.下面，参考具体实施例更详细地描述本发明，然而，实施例仅用于说明目的，对于本发明不具有限制作用。下述实施例中所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
78.实施例1泌乳素垂体腺瘤中雌激素受体相关受体γ(esrrg)异常转录本的检测
79.对3例正常垂体样本、6例泌乳素垂体腺瘤样本进行rt-pcr反应，检测有无esrrg的异常转录本存在。
80.使用rneasy mini kit(74106，qiagen)提取上述正常垂体样本和泌乳素垂体腺瘤样本的总rna，并使用high capacity cdna逆转录试剂盒(4368814，thermo fisher，usa)进行反转录。随后，使用i-5tm high-fidelity master mix(i5hm，200mclab)进行pcr。
81.热循环方案如下所示：
82.初始变性在98℃下进行2分钟，然后重复32次三步循环程序，包括10秒98℃(变性)、10秒59℃(退火)和10秒72℃(延伸)，然后在72摄氏度下最后延长5分钟。
83.esrrg的rt-pcr引物为：
84.正向引物(forward)：5'-ggaatatgcttcgcccatccaa-3' (seq id no:1)
85.反向引物(reverse)：5'-agagtacgtggaggtcggcaga-3' (seq id no:2)
86.pcr产物在1-3％琼脂糖凝胶上运行，并使用紫外线透照仪进行可视化，其结果见
图1。由图1可见，在6例泌乳素垂体腺瘤样本中两例恶性度比较高的泌乳素垂体腺瘤样本中esrrg有异常转录本片段的出现，通过将凝胶纯化进行sanger测序显示该异常转录本片段为变异型(cryptic)esrrg转录本片段，长为278bp。在3例正常垂体样本和其余4例泌乳素垂体腺瘤样本中，有经典型(canonical)esrrg转录本片段出现，长为257bp。具有变异型esrrg转录本片段的泌乳素垂体腺瘤为变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤；具有经典型esrrg转录本片段的泌乳素垂体腺瘤为经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤。与正常垂体和经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤的经典型esrrg转录本片段相比，在变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤中的变异型esrrg转录本片段插入了一个长度为21bp(278-257＝21)的核苷酸片段。
87.将上述正常垂体样本和泌乳素垂体腺瘤于北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行rna转录组测序。分析测序结果显示：
88.在变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤中278bp的变异型esrrg转录本片段(其核苷酸序列如seq id no:3所示)主要来自于genbank
tm
登记号为nm_001243518.1(其核苷酸序列如seq id no:4所示，共5409个核苷)的esrrg转录本变体16，变异型esrrg转录本的编码区位于nm_001243518.1的第287-1699位核苷酸(其核苷酸序列如seq id no:5所示，共1413个核苷酸)，该278bp的变异型esrrg转录本片段位于nm_001243518.1的第905-1182位核苷酸，变异型esrrg转录本翻译蛋白的genbank
tm
登记号为np_001230447.1(其氨基酸序列如seq id no:6所示，共470个氨基酸)。
89.正常垂体和经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤中257bp的经典型esrrg转录本片段(其核苷酸序列如seq id no:7所示)主要来自于genbank
tm
登记号为nm_001243519.1(其核苷酸序列如seq id no:8所示，共5559个核苷)的esrrg转录本变体17，经典型esrrg转录本的编码区位于nm_001243519.1的第542-1849位核苷酸(其核苷酸序列如seq id no:9所示，共1308个核苷酸)，该257bp的经典型esrrg转录本片段位于nm_001243519.1的第1076-1332位核苷酸，经典型esrrg转录本翻译蛋白的genbank
tm
登记号为np_001230448.1(其氨基酸序列如seq id no:10所示，共435个氨基酸)。
90.进一步分析显示，长为257bp的经典型esrrg转录本片段包含外显子4和外显子5的转录本片段(图2b)，长为278bp的变异型esrrg转录本片段除了包含上述外显子4和外显子5的转录本片段外，还包含在上述外显子4和外显子5的转录本片段之间插入的一个长度为21bp的核苷酸片段(图2a)。
91.在变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤中的变异型esrrg转录本插入的21bp的核苷酸片段为tgctctggtctgatcctgcag(seq id no:11)。将经典型esrrg转录本翻译蛋白np_001230448.1与变异型esrrg转录本翻译蛋白np_001230447.1进行比对(参见图3)，发现插入的21bp核苷酸涉及变异型esrrg转录本翻译蛋白中的llwsdpad(seq id no:12)氨基酸片段。
92.实施例2经典型和变异型esrrg mrna表达水平的检测
93.分别针对变异型esrrg转录本和经典型esrrg转录本设计pcr引物(表1)，并在上述正常垂体样本和泌乳素垂体腺瘤样本中进行qpcr验证，使用rneasy mini kit(74106，qiagen)提取上述样本总rna，并使用high capacity cdna逆转录试剂盒(4368814，thermo fisher，usa)进行反转录。使用power sybr
tm
green pcr master mix(4367659，thermo fisher)进行qpcr，反应总体积为10μl。gapdh用作内部对照(每组n＝3)。gapdh用作参考基
因。mrna水平的检测在abi 7500系统(applied biosystems)上进行。
94.表1
[0095][0096]
esrrg mrna表达水平的检测结果表明，在变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本中的变异型esrrg表达量高于正常垂体样本以及经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本(图4)。另外，通过计算样本内变异型和经典型esrrg的比值，进一步证实了变异型esrrg在变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本中的变异型esrrg表达量高于正常垂体样本以及经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤样本(图5)。可见，变异型esrrg泌乳素垂体腺瘤主要表达变异型esrrg转录本。正常垂体和经典型esrrg泌乳素垂体腺瘤主要表达经典型esrrg转录本。
[0097]
实施例3质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg16和pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg17的构建
[0098]
1.dna引物设计：
[0099]
esrrg16-nhei-f：
[0100]
5'-ctggctagcgccaccatgtggcgagaatgtgatt-3' (seq id no:17)
[0101]
esrrg17-nhei-f：
[0102]
5'-ctggctagcgccaccatgtcaaacaaagatcgac-3' (seq id no:18)
[0103]
esrrg-noti-r：
[0104]
5'-agtggcggccgctcagaccttggcctccaacatttccaa-3'(seq id no:19)
[0105]
2.分别以质粒pcdh-esrrg16-ef1-cogfp-t2a-puro和质粒pcdh-esrrg17-ef1-cogfp-t2a-puro(购自北京利科丽生物科技有限公司)为模板，分别pcr扩增目的基因esrrg16和esrrg17，在引物两端分别引入nhei和noti的酶切位点。pcr反应条件见表1。
[0106]
表2
[0107][0108]
按表2所示条件设置反应程序进行pcr反应。
[0109]
表3
[0110][0111]
分别用1％琼脂糖凝胶回收目的基因esrrg16和esrrg17 dna条带。
[0112]
3.将质粒pdc316-mcmv-zsgreen(购自北京利科丽生物)用nhei和noti双酶切，酶切反应在37℃水浴反应3h，酶切体系见表3。
[0113]
表4
[0114][0115]
质粒pdc316-mcmv-zsgreen的酶切图谱如图6所示。
[0116]
用1％琼脂糖凝胶电泳回收质粒pdc316-mcmv-zsgreen nhei noti酶切大片段。
[0117]
4.分别将回收的目的基因esrrg16和esrrg17片段用nhei和noti双酶切，酶切反应在37℃水浴反应3h，酶切体系见表4。
[0118]
表5
zsgreen-esrrg16和腺病毒ad-zsgreen-esrrg17；同时用质粒pdc316-mcmv-zsgreen做空白病毒对照，标记为ad-zsgreen。
[0130]
其中：
[0131]
腺病毒ad-zsgreen-esrrg16是变异型esrrg腺病毒，其包含seq id no:20所示的编码变异型esrrg的核苷酸序列，该核苷酸序列是在seq id no:5所示的变异型esrrg转录本的编码区两端添加了酶切位点所获得的片段。
[0132]
腺病毒ad-zsgreen-esrrg17是经典型esrrg腺病毒，其包含seq id no:21所示的编码经典型esrrg的核苷酸序列，该核苷酸序列是在seq id no:9所示的经典型esrrg转录本的编码区两端添加了酶切位点所获得的片段。
[0133]
其实验步骤如下：
[0134]
1.细胞的复苏与传代：
[0135]
于液氮罐中取出冻存的hek293细胞，37℃水浴快速融化，然后将其接种于25cm2培养瓶中，加入dmem培养基(含10％胎牛血清)，置于培养箱37℃，5％co2培养箱内培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达90％以上聚集度时传代，将培养基吸出，加入500μl 0.25％胰蛋白酶室温下短暂消化，于显微镜下观察当细胞皱缩变圆时立即加入dmem培养基，反复吹打成细胞悬液，血球计数板计数，以含10％胎牛血清的dmem调整细胞密度后重新接种于6孔板中，密度为8
×
105个细胞/孔，置于37℃、5％co2培养箱内培养。
[0136]
2.lipofectamine 2000(11668019，thermo fisher，usa)转染hek293细胞：
[0137]
(a)在转染前一天按每孔3～5
×
105个细胞接种细胞。
[0138]
(b)转染试剂的准备：
[0139]
(1)分别取5μg质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg16和质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg17用250μl稀释，充分混匀，制成dna稀释液。
[0140]
(2)取10μl lipofectamine 2000用250μl无血清稀释培养基(采用opti-mem、无血清dmem或rpmi1640)稀释，充分混匀，制成lipofectamine2000稀释液。
[0141]
(3)将dna稀释液和lipofectamine 2000稀释液混和在一起，充分混匀，室温静置20分钟，制成转染复合物。
[0142]
(c)转染：
[0143]
将转染复合物加入到含有hek293细胞和dmem完全培养基的6孔板中，轻柔混匀，培养4～6小时后更换培养液，于37℃，5％co2培养箱中继续培养。
[0144]
(d)待细胞长满培养皿，将细胞传代于25cm2细胞培养皿中，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，观察出毒迹象。
[0145]
细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落。待细胞大部分病变并从培养瓶壁脱落后，进行收毒，为第一代毒种p1。
[0146]
3.腺病毒ad-zsgreen-esrrg16和腺病毒ad-zsgreen-esrrg17的扩增；
[0147]
(1)分别培养扩增hek293细胞，当细胞汇合度达到80％～90％时，分别加入第一代病毒腺病毒ad-zsgreen-esrrg16和腺病毒ad-zsgreen-esrrg17；
[0148]
(2)腺病毒ad-zsgreen-esrrg16和腺病毒ad-zsgreen-esrrg17感染48h后，分别收集hek293细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，12,000rpm离心10min收集病毒上清；
[0149]
(3)病毒扩增至p3代；用virabind腺病毒纯化试剂盒纯化p3代病毒。
[0150]
随着转染细胞的传代，荧光细胞越来越少，但是转染后6-10天，荧光细胞出现了增多的现象，荧光细胞呈现团状，第12天出现大片荧光细胞。其中：
[0151]
质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg16转染hek293细胞24h后的荧光图如图8a所示，转染24h后白光图如图8b所示。
[0152]
质粒pdc316-mcmv-zsgreen-esrrg17转染hek293细胞24h后的荧光图如图9a所示，转染24h后白光图如图9b所示。
[0153]
腺病毒ad-zsgreen-esrrg16感染hek293荧光图如图10所示。
[0154]
腺病毒ad-zsgreen-esrrg17感染hek293荧光图如图11所示。
[0155]
4.病毒生物学滴度测定
[0156]
滴度测定结果见表6。
[0157]
表7
[0158]
病毒名称病毒滴度病毒体积
[0159]
ad-zsgreen-esrrg16 1
×
10
10
pfu/ml 2ml
[0160]
ad-zsgreen-esrrg17 1
×
10
10
pfu/ml 2ml
[0161]
ad-zsgreen 1
×
10
10
pfu/ml 2ml
[0162]
实施例5敲除雌激素受体相关受体γ(esrrg)对泌乳素垂体腺瘤细胞的影响
[0163]
为研究雌激素受体相关受体γ(esrrg)对泌乳素垂体腺瘤细胞的影响，通过sirna敲除原代泌乳素垂体腺瘤细胞中的esrrg，并对esrrg mrna表达水平、esrrg表达水平的蛋白质印迹以及原代泌乳素垂体腺瘤细胞敲除esrrg后prl分泌水平进行分析。
[0164]
将原代泌乳素细胞分为以下三组：
[0165]
(1)esrrg sirna1组：用esrrg-1-sense和esrrg-1-antisense转染的原代泌乳素细胞，通过sirna干扰，敲除原代泌乳素细胞中的esrrg；
[0166]
(2)esrrg sirna2组：用esrrg-2-sense和esrrg-2-antisense转染的原代泌乳素细胞，通过sirna干扰，敲除原代泌乳素细胞中的esrrg；
[0167]
(3)对照组：用negative control-sense和negative control-antisense转染的原代泌乳素细胞，作为阴性对照组。
[0168]
其实验步骤如下：
[0169]
1.原代泌乳素垂体腺瘤细胞获取
[0170]
取人泌乳素垂体腺瘤切除术切除的泌乳素垂体腺瘤组织，将其转移到富含10％fbs的新鲜l15培养基(11415064，gibco)中，用手术剪将该泌乳素垂体腺瘤组织切成小块，然后在37℃下用1mg/ml胶原酶(17101015，thermo fisher，usa)消化30分钟。通过添加fbs终止酶处理后，将混合物用细胞过滤器过滤以除去未消化的组织，并以600
×
g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于补充有2％b27的神经基础生长培养基(a3582801，thermo fisher，usa)中，并铺在35mm培养皿上于37℃，5％co2条件的培养箱进行培养，获得原代泌乳素垂体腺瘤细胞。
[0171]
2.细胞转染
[0172]
用lipofectamine 2000转染试剂(11668019，thermo fisher，usa)将表7所示的人esrrg的sirna转染分别至esrrg sirna1组、esrrg sirna2组和对照组细胞。人esrrg的sirna由shanghai genepharma合成。
[0173]
表8
[0174][0175]
3.esrrg mrna表达水平的检测
[0176]
使用rneasy mini kit(74106，qiagen)提取经esrrg sirna转染的esrrg sirna1组、esrrg sirna2组和对照组细胞的总rna，并使用high capacity cdna逆转录试剂盒(4368814，thermo fisher，usa)进行反转录。使用power sybr
tm
green pcr master mix(4367659，thermo fisher)进行qpcr，反应总体积为10μl。gapdh用作内部对照(每组n＝3)。gapdh用作参考基因。mrna水平的检测在abi 7500系统(applied biosystems)上进行。
[0177]
esrrg的qpcr引物为：
[0178]
正向引物(forward)：5'-ggaatatgcttcgcccatccaa-3' (seq id no:1)
[0179]
反向引物(reverse)：5'-agagtacgtggaggtcggcaga-3' (seq id no:2)
[0180]
qpcr结果显示了用对照(negative control-sense和negative control-antisense)或特异性esrrg sirna(esrrg sirna1(esrrg-1-sense和esrrg-1-antisense)和esrrg sirna2(esrrg-2-sense和esrrg-2-antisense))转染的原代泌乳素垂体腺瘤细胞中esrrg mrna的表达水平(图12)。由图12可见，特异性esrrg sirna敲除了esrrg，esrrg mrna表达水平明显降低。
[0181]
4.esrrg表达水平的蛋白质印迹分析
[0182]
对照(negative control-sense和negative control-antisense)或特异性esrrg sirna(esrrg sirna1(esrrg-1-sense和esrrg-1-antisense)和esrrg sirna2(esrrg-2-sense和esrrg-2-antisense))转染的原代泌乳素垂体腺瘤细胞中esrrg表达水平的蛋白质印迹分析。β-actin用作内部对照。使用jes/wes separation master kit(12
–
230kda)在wes(proteinsimple)上进行免疫印迹，并使用以下抗体：抗-esrrg(abcam，ab49129，1：400)和抗β-actin(abcam，ab8227，1：1000)。检测结果见图13。由图13可见，用sirna敲除esrrg后，人泌乳素垂体腺瘤细胞中表达的esrrg水平明显降低。
[0183]
5.原代泌乳素垂体腺瘤细胞敲除esrrg后分泌prl的检测
[0184]
原代泌乳素垂体腺瘤细胞消化离心后，培养基重悬后，进行细胞计数，以每孔5
×
104铺于24孔板内，分别用对照(negative control-sense和negative control-antisense)或特异性esrrg sirna(esrrg sirna1(esrrg-1-sense和esrrg-1-antisense)和esrrg sirna2(esrrg-2-sense和esrrg-2-antisense))转染泌乳素垂体腺瘤细胞，培养24小时后收集上清液，进行泌乳素分泌分析。采用酶联免疫吸附试验(elisa)(csb-e06883h，cusabio)测定催乳素水平。结果显示esrrg干扰后，细胞分泌prl水平减少(参见图14)。这说明esrrg与泌乳素瘤的prl分泌有关。
[0185]
实施例6经典型和变异型esrrg对细胞功能的影响
[0186]
为研究雌激素受体相关受体γ(esrrg)对细胞功能的影响，通过表达经典型和变
异型esrrg的腺病毒感染细胞，检测感染细胞prl分泌水平，观察感染细胞的增殖和凋亡情况。
[0187]
1.esrrg对泌乳素垂体腺细胞分泌泌乳素(prl)的影响
[0188]
选取实施例4制备的原代泌乳素垂体腺细胞为实验细胞，并将其分为以下三组：
[0189]
(1)经典型esrrg组细胞(ad-canonical esrrg，腺病毒-经典型esrrg)：表达经典型(canonical)esrrg的细胞，其是用腺病毒ad-zsgreen-esrrg17感染原代泌乳素垂体腺细胞所获得的细胞；
[0190]
(2)变异型esrrg组细胞(ad-cryptic esrrg，腺病毒-变异型esrrg)：表达变异型(cryptic)esrrg的细胞，其是用腺病毒ad-zsgreen-esrrg16感染原代泌乳素垂体腺细胞所获得的细胞；
[0191]
(3)对照组细胞(ad-null，腺病毒-空载体)：该组为对照组，是用腺病毒空载体感染原代泌乳素垂体腺细胞所获得的细胞。
[0192]
分别用腺病毒空载体(ad-null)、实施例3制备的腺病毒ad-zsgreen-esrrg16和ad-zsgreen-esrrg17感染原代培养的泌乳素垂体腺瘤细胞，其中，ad-zsgreen-esrrg16是变异型esrrg腺病毒，其包含变异型(cryptic)esrrg编码基因；ad-zsgreen-esrrg17是经典型esrrg腺病毒，其包含经典型(canonical)esrrg编码基因，在l15培养基中培养细胞。检测对照组、经典型esrrg组和变异型esrrg组细胞的l15培养基中prl的水平(图15)。由图15可见，与对照组相比，经典型和变异型esrrg均导致prl分泌显著增加，变异型esrrg组prl分泌水平尤其更高。
[0193]
2.esrrg对gh3和mmq细胞增殖及凋亡的影响
[0194]
选取gh3细胞系atcc ccl-82.1(购自美国菌种保藏中心atcc(american type culture collection))和mmq atcc crl-10609(购自美国菌种保藏中心atcc(american type culture collection))作为实验细胞系，进行后续实验。gh3细胞系为大鼠垂体瘤细胞系，该细胞系可以基因表达以及分泌prl、gh。mmq细胞系为大鼠垂体瘤细胞系，该细胞系可以基因表达以及分泌prl。
[0195]
分别将gh3细胞系和mmq细胞系细胞分为以下三组：
[0196]
(1)经典型esrrg组细胞(ad-canonical esrrg，腺病毒-经典型esrrg)：表达经典型(canonical)esrrg的细胞，其是用腺病毒ad-zsgreen-esrrg17感染gh3细胞系或mmq细胞系所获得的细胞；
[0197]
(2)变异型esrrg组细胞(ad-cryptic esrrg，腺病毒-变异型esrrg)：表达变异型(cryptic)esrrg的细胞，其是用腺病毒ad-zsgreen-esrrg16感染gh3细胞系或mmq细胞系所获得的细胞；
[0198]
(3)对照组细胞(ad-null，腺病毒-空载体)：该组为对照组，是用腺病毒空载体感染gh3细胞系或mmq细胞系所获得的细胞。
[0199]
a)esrrg对细胞增殖的影响
[0200]
将经典型esrrg组细胞、变异型esrrg组细胞和对照组细胞分别以每孔4
×
103的浓度接种到96孔板中，每孔100μl培养基，成份为：atcc公司的f12k培养基，终浓度为2.5％的胎牛血清(gibco公司)，终浓度为15％的马血清(gibco公司)。感染48小时后每个实验孔各加入10μl cck-8试剂(beyotime，c0039)，置于37℃，5％co2培养箱孵育4h。采用cck-8法检
测esrrg对细胞增殖的影响。用酶标仪测量吸光度(od值)，吸收波长为450nm。其检测结果如图16和图17所示。
[0201]
实验结果表明，与对照组相比，经典型和变异型esrrg均使gh3细胞和mmq细胞的增殖能力提高，并且变异型esrrg组细胞的增殖能力强于经典型esrrg组。
[0202]
b)克隆形成实验检测细胞增殖能力
[0203]
将经典型esrrg组细胞、变异型esrrg细胞和对照组细胞分别以1
×
103细胞的单细胞悬液铺板于2ml含10％胎牛血清(fbs)的dmem中。感染后，细胞培养3周期间，每3天更换一次培养基。然后用4％多聚甲醛固定形成的克隆集落，并在室温下用含0.04％结晶紫的pbs溶液染色15分钟。充分洗涤并风干后，用imagej测量集落数，其检测结果如图18和图19所示。
[0204]
实验结果表明，与对照组相比，经典型和变异型esrrg均使gh3细胞和mmq细胞的细胞集落数更多，说明细胞增殖能力增强，并且，变异型esrrg组细胞的细胞集落数更多，增殖能力强于经典型esrrg组。
[0205]
c)细胞流式技术检测细胞凋亡情况
[0206]
用beyotime公司的试剂盒(c1062m)提供的annexin v-fitc/propidium iodide双染色法分析细胞的凋亡。分别收集感染腺病毒后48h的变异型esrrg组细胞、经典型esrrg组细胞和对照组细胞并进行分析。离心收集每组约5
×
105个细胞，并重悬500μl结合缓冲液(1
×
annexin v binding buffer)。将5μl膜联蛋白-v-fitc(annexin v-fitc)和5μl碘化丙啶(propidium iodide)加入每个试管中，然后在黑暗中于室温孵育15分钟。通过流式细胞术在fitc和pe通道中分析染色的细胞，其检测结果如图20和图21所示。
[0207]
实验结果表明，与对照组相比，经典型esrrg和变异型esrrg均降低了gh3和mmq细胞总凋亡百分比，并且变异型esrrg对细胞的凋亡有更强的抑制作用。综上，这些数据表明，经典型esrrg和变异型esrrg，特别是变异型esrrg能促进gh3和mmq细胞的增殖和抑制凋亡。
[0208]
上述细胞实验证实了变异型esrrg在垂体瘤细胞中能促进prl分泌，促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡，提示变异型esrrg的病例相较于经典型有恶性表现的可能。因此，针对变异型esrrg转录本或差异片段研究得到新的治疗方法以及药物，将对变异型esrrg垂体腺瘤，特别是变异型esrrg泌乳素型垂体腺瘤的治疗具有重大意义。