海岛棉跨膜蛋白GbTMEM214-A07/D07基因及应用的制作方法

al.，2014；lee et al.，2017)。
5.在前期的研究阶段，本发明的发明人在公开号为cn107254474a的中国发明专利中公开了一个海岛棉跨膜蛋白基因，其来自于海岛棉海7124，位于棉花染色体组的d4号染色体，本发明在之前的研究基础上，对海岛棉中transmembrane protein214类基因进行了更深入的研究，发现了一个新的海岛棉跨膜蛋白基因transmembrane protein214a基因，命名为gbtmem214
‑
a07/d07基因，并且同样具有抗黄萎病的功能，丰富了棉花抗黄萎病基因资源。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一个新的海岛棉跨膜蛋白gbtmem214
‑
a07/d07基因，所述基因参与棉花对黄萎病抗性途径，具有在抗黄萎病的转基因植株培育中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
8.一个海岛棉跨膜蛋白基因gbtmem214
‑
a07/d07，其核苷酸序列或能够如序列表中seq id no.1所示。所述海岛棉跨膜蛋白基因gbtmem214
‑
a07/d07来自于海岛棉海7124，位于棉花染色体组的a07/d07号染色体。
9.上述海岛棉跨膜蛋白基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.其中，序列中的seq id no.1由2414个碱基组成，自5’端第283位碱基为转录起始位点，至第2025位碱基为转录终止位点，完整编码框为1743个碱基，编码580个氨基酸，分子量为64.36kd，等电点为9.45。该蛋白具有1个tmem214 domain，3个low complexity。
11.本发明的一个重要的目的就是提供一种海岛棉跨膜蛋白基因、其表达载体或者宿主细胞在获得具有抗黄萎病的转基因植株中的应用。其中，最主要的作用是在棉花抗黄萎病育种过程中的作用。
12.本发明涉及的跨膜蛋白基因gbtmem214
‑
a07/d07，受棉花黄萎病菌的诱导后表达量显著升高，将gbtmem214
‑
a07/d07基因沉默，海岛棉海7124对棉花黄萎病菌株bp2和v991的抗性显著降低。可以利用本发明基因构建各种植物表达载体，可以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或利用本发明基因改良棉花对黄萎病的抗性。
13.本发明还公开了一种培育转基因植物的方法，将gbtmem214
‑
a07/d07基因特异的导入目的植物胚珠细胞中，得到转基因植物。具体地，gbtmem214
‑
a07/d07基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
14.含有上述基因的表达载体、重组载体、重组菌株或转基因细胞系，都在本发明的保护范围。
15.包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性。
16.包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性。
17.包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以在异源宿主中表达并通过dna芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。
18.包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白以及可以合成在功能上与gbtmem214
‑
a07/d07相同或类似的核苷酸序列和蛋白。
19.包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
20.包含本发明所提供的非核糖体肽合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的非核糖体肽合成酶系统的一个或多个非核糖体肽合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚肽化合物。
21.包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建非核糖体肽合成酶库或非核糖体肽合成酶衍生库或组合库。
22.本基因还可用在基因工程、蛋白表达、酶催化反应等方面，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因以扩大gbtmem214
‑
a07/d07基因的来源范围，具有较高的应用前景。
23.本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
24.本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
25.作为一种实施方式，所述的“植物”包括但不限于：棉花，拟南芥，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。尤其适用于需要提高抗黄萎病的植物，在实际的应用过程中，对于需要提高黄萎病抗性的植物，均可以通过转基因的方式培育转入该基因的株系。
26.本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
27.本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
28.本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
29.本发明具有如下优点：
30.(1)本发明在之前已经公开的一个海岛棉跨膜蛋白基因，其来自于海岛棉海7124，位于棉花染色体组的d4号染色体，本发明在之前的研究基础上，对海岛棉中transmembrane protein214类基因进行了更深入的研究，发现了一个新的海岛棉跨膜蛋白gbtmem214
‑
a07/d07基因，并且同样具有抗黄萎病的功能，该基因在植物中的功能鲜有报道，丰富了棉花抗黄萎病基因资源。
31.(2)gbtmem214
‑
a07/d07基因在不同抗、感棉花品种中，该基因接菌后表达模式存在显著差异，将gbtmem214
‑
a07/d07基因沉默后，沉默植株对黄萎病的抗性显著降低；转gbtmem214
‑
a07/d07基因拟南芥显著提高对黄萎病的抗性。因此，gbtmem214
‑
a07/d07基因参与了棉花对黄萎病的抗性过程，对其克隆可以丰富抗病基因资源，为棉花抗黄萎病育种提供有效的新工具。
32.(3)本发明获得的gbtmem214
‑
a07/d07基因可以进一步解析棉花抗黄萎病的分子机制。gbtmem214
‑
a07/d07基因是否参与抗病相关的信号途径，其上游和下游基因分别是什么，与其互作的蛋白是什么，所以通过对该基因做进一步研究，可以在理论上扩展棉花抗黄萎病机制的认识。
附图说明
33.图1是本发明涉及的跨膜蛋白基因gbtmem214
‑
a07/d07在不同抗、感棉种接种黄萎病菌后的表达模式，**：p＜0.01，*：p＜0.05。
34.图2是利用vigs沉默海岛棉中跨膜蛋白基因gbtmem214
‑
a07/d07，海岛棉对黄萎病的抗性显著降低；
35.图中，a：注射阳性对照ptrv2
‑
gbcla1棉花植株14天后的表型观察；b：注射ptrv2：00和ptrv2
‑
gbtmem214
‑
a07/d07(t1，t2和t3)棉花幼苗对黄萎病菌的抗性分析；c：rt
‑
pcr验证注射ptrv2：00(ck)和ptrv2
‑
gbtmem214
‑
a07/d07(t1，t2和t3)的棉花幼苗中gbtmem214
‑
a07/d07基因的表达情况；d：接种黄萎病菌35天后棉花幼苗的病级指数统计；标准差计算为3次重复，每次20棵幼苗所得，**：p＜0.01。
36.图3是构建跨膜蛋白基因gbtmem214
‑
a07/d07的过表达载体，转化拟南芥后代的分子检测及抗病鉴定；
37.图中，a：转基因拟南芥基因特异引物pcr检测(p为以质粒为模板扩增结果，n为以非转基因拟南芥dna为模板扩增情况，t2，t4和t5分别为转基因纯合株系)；b：转基因拟南芥目标基因表达分析；c：转基因拟南芥抗病性鉴定；d：转基因拟南芥接种黄萎病菌bp2 15，30，45和60天后病指(t2，t4和t5分别为转基因纯合株系，ck1为转基因拟南芥，ck2为转空载体拟南芥)。标准差计算为3次重复，每次30棵幼苗所得，**：p＜0.01。
具体实施方式
38.下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
39.如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
40.1.试验材料
41.本实验所用海岛棉品种h7124和陆地棉标准系tm
‑
1由江苏省农业科学院引进，多年严格自交繁殖保纯。拟南芥品种为哥伦比亚型，易感黄萎病。本发明所使用的材料均能从市场上购买或者按照现有技术公开的方法获得，本实验所用方法如无特殊说明，都为常规
方法。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
42.本发明实验过程中所用黄萎病菌为bp2，可以通过市场购买，也可以通过以下方法培养，其培养方法为：25℃下，将大丽轮枝菌bp2涂布于固体土豆培养基(马铃薯200g、琼脂17g、蔗糖20g、蒸馏水1000m1)表面，两周后转移到液体土豆培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、蒸馏水1000m1)中，室温下振荡培养5天，过滤培养的病菌溶液，利用血球计数板测病菌孢子浓度，将浓度稀释至5
×
107个孢子/ml。
43.本发明下述实验中黄萎病发病级数调查按照以下标准进行，0级：植株健康，无病叶，生长正常；1级：植株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；2级：植株四分之一以上，二分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；3级：植株二分之一以上，四分之三以下叶片发病，变黄萎蔫；4级：植株四分之三以上叶片发病，或植株枯死。根据调查的结果计算各株系的病情指数(di)。
44.di＝[∑(ni
×
i)/(n
×
4)]
×
100；i＝0～4，ni＝plant number of reaction i
[0045]
2.试验方法
[0046]
2.1 gbtmem214基因家族分析
[0047]
利用最近释放的棉花基因组信息，对海岛棉h7124全基因组中的gbtmem214基因家族进行了预测。利用molquest软件(版本为2.3.3)中的fgenesh程序对于来自于海岛棉h7124基因组scaffold进行全基因组的orf预测，将预测后的结果利用pfam和hmmer进行gbtmem214基因的注释。其中，pfam的种子文件来自于sanger中心网站(http://pfam.sanger.ac.uk/)，gbtmem214基因的种子文件编码为：pf10151。hmmer软件来自于网站：http://hmmer.janelia.org/，版本为3.0。预测共得到6个gbtmem214基因，分别位于a01/d01，a04/d04和a07/d07染色体上。将位于a07/d07染色体上的gbtmem214基因命名为gbtmem214
‑
a07/d07。
[0048]
2.2 gbtmem214
‑
407/d07基因表达分析
[0049]
为了检测预测基因与黄萎病菌胁迫的相关性，本研究以tm
‑
1和海7124棉花三叶期幼苗为材料，接种黄萎病菌bp2，处理时间为0h、24h、48h、96h和144h，同时，以水处理相同时期作为对照。取1μg总rna，按照takara反转录试剂盒说明书操作。合成第一链cdna。将反转录产物稀释10倍后取1μl进行qrt
‑
pcr。以1对专一性扩增真核生物组成型表达基因ef1α(genbank登录号af120093)的引物进行平行pcr反应作为内对照，其引物序列为f：agaccaccaagtactactgcac，r：ccaccaatcttgtacacatcc。实时荧光定量pcr利用abi prism7500型荧光定量pcr仪(abi，usa)操作，方法为sybr green i染料方法。反应体系为20μl，cdna，1μl；primer f(10μm)，1μl；primer r(10μm)，1μl；sybr green i mix，10μl，补水至20μl。程序为：95℃，10min；95℃，10s，退火：58℃，20s；72℃，30s；40个cycles；72℃，10min，最后运行溶解程序。
△△△
ct＝[(ct
目的基因
‑
ct
内参基因
)
指定时间的处理
‑
(ct
目的基因
‑
ct
内参基因
)
oh
]v.d
‑
[(ct
目的基因
‑
ct
内参基因
)
指定时间的处理
‑
(ct
目的基因
‑
ct
内参基因
)
0h
]
ck
。位于a07/d07染色体上的gbtmem214
‑
a07/d07基因使用的引物为f：cacatttccagcaccctcag，r：ttccaggagaaccagcaagg。结果显示，gbtmem214
‑
a07/d07基因能够对黄萎病产生响应，在感病品种tm
‑
1中，接菌后24h，gbtmem214
‑
a07/d07基因表达量显著下调，接菌后144h表达量开始上调，上调倍数为1.9倍(图1a)；在海7124中，接菌后48h即开始上调1.4，96h达到最大值，上调2.1倍，一直持续到144h(图1b)。本研究结果表明，
gbtmem214
‑
a07/d07基因的表达模式在抗(海7124)、感(tm
‑
1)品系中存在显著差异。
[0050]
2.3 gbtmem214基因抗病性分析
[0051]
在本发明中，我们使用下述两种方法分析gbtmem214
‑
a07/d07基因对棉花黄萎病的抗性。
[0052]
一是利用病毒介导的基因沉默方法，验证gbtmem214
‑
a07/d07基因沉默后棉花对黄萎病的抗性。病毒介导的基因沉默所用到的载体分别是ptrv1和ptrv2，并且用棉花白化基因(ghcla1)作为对照(王心宇等，2014)。以gbtmem214
‑
a07/d07基因的3’端设计引物，扩增415bp的片段并亚克隆至ptrv2载体上。挑取阳性的ptrv1、ptrv2(阴性对照)和ptrv2：cla1(阳性对照)以及含有gbtmem214
‑
a07/d07基因的ptrv2质粒农杆菌gv3101单菌落，培养至菌液od600为0.5左右。4,000rpm室温离心10分钟收集菌体细胞，以适当体积的重悬液(10mm mgcl2，10mm mes以及200μm已酰丁香酮)重悬至终浓度为2.0，室温下将重悬液置静置3h，将trv1和trv2的恢复液，按体积比为1∶1比例混匀。待棉花幼苗两片子叶完全展开后进行农杆菌的接种实验。采用叶片针筒注射法将菌液注射至子叶。分别利用ptrv1/ptrv2和ptrv1/ptrv2：cla1作为沉默处理的阴性对照和阳性对照。待注射trv：cla1的棉花幼苗出现白化表型时，检测沉默gbtmem214
‑
a07/d07基因的棉花体内gbtmem214
‑
a07/d07基因的表达情况，以棉花ef
‑
1α作为内参基因(图2a，2c)。同时，接种黄萎病菌，并调查沉默后棉花的抗病情况。结果显示，接种黄萎病菌28天后，沉默gbtmem214
‑
407/d07基因后植株病情指数达到74.8(ptrv2：gbtmem214
‑
a07/d07)，显著高于空载体对照(ptrv2：00，41.2)和没有注射的h7124(ck，39.7)(图2b，2d)。
[0053]
二是利用转基因拟南芥验证gbtmem214
‑
a407/d07基因对棉花黄萎病的抗性。构建gbtmem214
‑
a407/d07基因的过表达载体，使用的植物表达载体为35s
‑
pcambia2301
‑
nors，设计携带xmai和saci酶切位点的引物，扩增回收目的片段，与pmd
‑
19(sample)载体连接，转化top10感受态，测序，获得序列正确的阳性克隆，酶切携带目的基因的克隆载体和植物表达载体，分别回收2.3kb和13kb的目的片段，使用t4连接酶连接，转化top10感受态，获得阳性克隆，即为含有camv35s启动子和目的基因gbtmem214
‑
a07/d07片段的重组载体，命名为pcambia2301
‑
35s
‑
gbtmem214
‑
a407/d07。利用冻融法将重组载体转化农杆菌gv3101，利用花浸染法转化拟南芥，种子混收。消毒后，在包含浓度为50mg/l卡那霉素的ms培养基上筛选，获得阳性植株移栽到营养基质中生长。取叶片提取dna和rna，rna反转录获得cdna，检测目标基因是否成功转入和表达。其中以dna为模板检测的引物为：f：actgtactcgtgggcacatc；r：gagctgataactacatacag，扩增片段长度为789bp；以cdna为模板，扩增以拟南芥rubisco基因为内标，设计引物为f：gcaagtgttgggttcaaagctggtg和r：ccaggttga ggagttactcggaatgctg，扩增产物长度为120bp；基因引物为f：tgagtcagatgctgctacac，r：gagctgataactacatacag，扩增长度为198bp。最终，通过pcr检测，获得3个纯合株系(t2、t4和t5)，进行抗黄萎病抗性鉴定(图3a，图3b)。结果显示，接种黄萎病菌bp2后的15，30，45，60天后，调查接菌后拟南芥病情指数，结果显示，转gbtmem214
‑
a07/d07基因拟南芥能显著提高对黄萎病的抗性(图3c，图3d)。以上结果表明gbtmem214
‑
a07/d07基因能够赋予受体植物对黄萎病的抗性。
[0054]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，
在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。