一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法与流程

1.本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.硒是人体必需的微量元素，通过形成以硒代半胱氨酸为活性中心的硒蛋白行使生理功能。硒的生物利用率随硒的来源以及营养状态而改变，甲基化硒是低分子量硒代谢物主要的活性形式，而甲基硒代半胱氨酸(semcys)作为甲基化硒的直接供体，被证明是最有效的抗癌硒化合物之一，是比硒蛋白更有效的硒源类补充剂。
3.目前semcys的制备方法主要是化学合成法，但是这些化学合成方法都有各自的缺点，比如：步骤复杂，或工艺冗长，或反应条件苛刻，或原料价格高，或涉及剧毒原料等，致使这些合成方法大都难以投入大规模实际生产，因此，市场上的甲基硒代半胱氨酸仍然非常昂贵。
4.而现有技术中，并没有采用生物发酵法制备甲基硒代半胱氨酸，由于发酵法具有以下优势：发酵细胞更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、ph等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物，因此有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化semcys的生产。
5.虽然自然界的微生物可以在菌体内富集有机硒，但是由于缺乏相关的酶，无法合成semcys，而目前仅仅有报道在酿酒酵母中表达双沟黄芪来源硒代半胱氨酸甲基转移酶，可以在胞内积累semcys，但无法将产物分泌到培养基中，从而限制其产量，并且其胞内的产量仅仅为1.14μg/g干重。
6.因此，急需开发一种可直接实现胞外分泌甲基硒代半胱氨酸的食品级的基因工程菌，该基因工程菌更具有研究价值及工业化应用潜力。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，表达编码smt蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因。
8.在本发明的一种实施方式中，所述半胱氨酸转运蛋白为半胱氨酸转运蛋白bcr、半胱氨酸转运蛋白yded、半胱氨酸转运蛋白tolc、半胱氨酸转运蛋白yfik或半胱氨酸转运蛋白cydd。
9.在本发明的一种实施方式中，所述smt蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示。
10.在本发明的一种实施方式中，编码所述smt蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.在本发明的一种实施方式中，半胱氨酸转运蛋白bcr的氨基酸序列如seq id no.8所示；半胱氨酸转运蛋白yded的氨基酸序列如seq id no.9所示；半胱氨酸转运蛋白tolc的氨基酸序列如seq id no.10所示；半胱氨酸转运蛋白yfik的氨基酸序列如seq id no.11；
半胱氨酸转运蛋白cydd的氨基酸序列如seq id no.12所示。
12.在本发明的一种实施方式中，编码半胱氨酸转运蛋白bcr的核苷酸序列如seq id no.2所示，编码半胱氨酸转运蛋白yded的核苷酸序列如seq id no.3所示，编码半胱氨酸转运蛋白的tolc核苷酸序列如seq id no.4所示，编码半胱氨酸转运蛋白yfik的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码半胱氨酸转运蛋白cydd的核苷酸序列如seq id no.6所示。
13.在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pp43nmk质粒或pstop1622质粒为载体，表达编码smt蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因。
14.本发明还提供了一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
15.(1)将编码smt蛋白的基因和载体进行gibson组装，得到重组载体-smt，将重组载体-smt转入枯草芽孢杆菌中得到重组菌-smt；
16.(2)将编码半胱氨酸转运蛋白的基因和载体进行gibson组装，得到重组载体-半胱氨酸转运蛋白，将重组载体-半胱氨酸转运蛋白转入到步骤(1)获得的重组菌-smt中，得到上述重组枯草芽孢杆菌。
17.本发明还提供了一种制备甲基硒代半胱氨酸的方法，所述方法为：以上述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产甲基硒代半胱氨酸。
18.在本发明的一种实施方式中，先将上述的重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于温度为30～38℃、转速为150～300rpm的条件下进行培养，最终获得含有甲基硒代半胱氨酸的发酵液。
19.在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的种子液的od
600
不低于1.8。
20.本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌或上述构建方法得到的重组枯草芽孢杆菌或上述制备甲基硒代半胱氨酸的方法在制备甲基硒代半胱氨酸或含甲基硒代半胱氨酸产品中的应用。
21.[有益效果]
[0022]
(1)本发明首次实现了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的胞外分泌。采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本，并且该方法不易受环境温度、ph等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化semcys的生产。
[0023]
(2)本发明利用具有强启动子p
43
启动子和p
xyla
启动子的表达载体过表达编码smt蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因，增强甲基硒代半胱氨酸的分泌，从而提高胞外甲基硒代半胱氨酸的产量；本发明可使枯草芽孢杆菌发酵生产甲基硒代半胱氨酸的产量从几乎为0提高到80μg/l，远远高于现有报道的重组酿酒酵母的胞内积累semcys1.14μg/g干重。
[0024]
(3)由于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)属于食品安全级菌株，因此，利用以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为宿主获得的重组枯草芽孢杆菌生产得到的甲基硒代半胱氨酸可达到食品级。
具体实施方式
[0025]
下述实施例中涉及的pp43nmk质粒和pstop1622质粒均购自普如汀生物技术(北
京)有限公司。
[0026]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0027]
lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l。
[0028]
发酵培养基：葡萄糖10g/l，大豆蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾2.3g/l，无水氯化钙0.1g/l，十二水合磷酸氢二钠1.26g/l，自然ph，115℃灭菌15min，初始硒浓度4μg/ml。
[0029]
种子培养基：葡萄糖10g/l，大豆蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾2.3g/l，无水氯化钙0.1g/l，十二水合磷酸氢二钠1.26g/l，自然ph，115℃灭菌15min。
[0030]
下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0031]
甲基硒代半胱氨酸含量检测：uplc-ms法检测条件如下：
[0032]
仪器：waters xevotqs-micro型超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪；色谱条件：色谱柱为acquity uplc hss t3 c18 column，2.1
×
100mm 1.8μm、柱温40℃、样品室温度10℃、进样体积5μl、流速0.2ml/min、运行时间7min、流动相a为0.1％甲酸水溶液、流动相b为乙腈，流动相浓度梯度见表1。
[0033]
表1流动相梯度表
[0034][0035][0036]
实施例1：重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt的构建
[0037]
(1)表达载体pp43nmk-smt的构建
[0038]
化学合成编码smt蛋白的基因(核苷酸序列如seq id no.1所示)；在编码smt蛋白的基因两端加上pp43nmk同源序列(核苷酸序列如seq id no.13所示和核苷酸序列如seq id no.14所示)得到smt片段；将pp43nmk经kpn i和sma i酶切回收，得到pp43nmk片段；将smt片段与pp43nmk片段利用gibson asembly master mix进行组装得到smt表达载体pp43nmk-smt。
[0039]
将表达载体pp43nmk-smt转化到感受态细胞，得到转化产物；将转化产物涂布在lb培养中得到转化子，挑取转化子接种至lb培养基中培养后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pp43nmk-smt。
[0040]
(2)重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt的构建
[0041]
根据spizizen转化法，进行枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化；将表达载体pp43nmk-smt转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞，得到重组菌枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt，将转化产物采用卡那霉素抗性平板培养，在37℃倒置培养12h直至出现菌落，挑取单菌落培养
保存，并提取基因组进行pcr鉴定，得到重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt。
[0042]
实施例2：半胱氨酸转运蛋白表达载体的构建
[0043]
(1)大肠杆菌基因组dna的提取：将大肠杆菌菌种接种到lb培养基中，37℃下200r/min培养12h，离心收集菌体，采用tiangen公司细菌基因组dna试剂盒提取大肠杆菌的基因组dna。
[0044]
(2)设计引物序列，从上述步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组dna中扩增出半胱氨酸转运蛋白基因，扩增条件如下：94℃预变性3min，随后进行30次循环94℃20s、55℃20s和72℃3min，最后72℃反应10min；具体引物如下：
[0045]
编码半胱氨酸转运蛋白bcr的基因：利用引物bcr-f(核苷酸序列如seq id no.15所示)和bcr-r(核苷酸序列如seq id no.16所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组dna中扩增bcr基因；
[0046]
编码半胱氨酸转运蛋白yded的基因：利用引物yded-f(核苷酸序列如seq id no.17所示)和yded-r(核苷酸序列如seq id no.18所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组dna中扩增yded基因；
[0047]
编码半胱氨酸转运蛋白tolc的基因：利用引物tolc-f(核苷酸序列如seq id no.19所示)和tolc-r(核苷酸序列如seq id no.20所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组dna中扩增tolc基因；
[0048]
编码半胱氨酸转运蛋白yfik的基因：利用引物yfik-f(核苷酸序列如seq id no.21所示)和yfik-r(核苷酸序列如seq id no.22所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组dna中扩增yfik基因；
[0049]
编码半胱氨酸转运蛋白cydd的基因：利用引物cydd-f(核苷酸序列如seq id no.23所示)和cydd-r(核苷酸序列如seq id no.24所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组dna中扩增cydd基因；
[0050]
(3)将pstop1622质粒经spe i和bam hi酶切回收，分别与步骤(2)中得到bcr、yded、tolc、yfik和cydd半胱氨酸转运蛋白片段，利用new england biolabs公司的gibson asembly master mix进行组装，分别得到质粒pstop1622-bcr、pstop1622-yded、pstop1622-tolc、pstop1622-yfik、pstop1622-cydd。
[0051]
实施例3重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-半胱氨酸转运蛋白的构建
[0052]
分别将表达载体pstop1622-bcr、pstop1622-yded、pstop1622-tolc、pstop1622-yfik、pstop1622-cydd转化到重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt中，分别得到重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-bcr、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-yded、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-tolc、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-yfik、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-cydd；分别将上述转化产物采用卡那霉素和四环素抗性平板培养，在37℃倒置培养12h直至出现菌落，挑取单菌落培养保存，并提取并提取基因组进行pcr鉴定，分别得到重组成功的重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-bcr、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-yded、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-tolc、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-yfik、重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-cydd。
[0053]
实施例4：重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-半胱氨酸转运蛋白的验证
[0054]
以枯草芽孢杆菌168为宿主，按照实施例1-3的方法分别得到枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-bcr、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-yded、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-tolc、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-yfik、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-cydd；
[0055]
分别将枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-bcr、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-yded、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-tolc、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-yfik、枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-cydd接种于种子培养基上，37℃下过夜培养，得到种子液；
[0056]
分别将上述种子液以5％的接种量接种于发酵培养基，使培养基中菌液浓度达到od0.09，37℃、200r/min培养8h时添加木糖至终浓度0.8％，继续发酵16h，得到发酵液；
[0057]
分别将上述得到的发酵液离心去除菌体，用滤膜过滤后超滤，用uplc-ms法分别检测甲基硒代半胱氨酸含量，结果如表2所示。
[0058]
结果显示，野生枯草芽孢杆菌菌株168和枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt均无法检测到胞外分泌甲基硒代半胱氨酸的含量；而本发明的所有重组枯草芽孢杆菌菌株的甲基硒代半胱氨酸胞外产量均得到提高，说明半胱氨酸转运蛋白促进了甲基硒代半胱氨酸的分泌，本发明成功的构建了可实现胞外分泌甲基硒代半胱氨酸的含量的重组枯草芽孢杆菌。其中草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-bcr菌株产量最高，枯草芽孢杆菌168/pp43nmk-smt/pstop1622-yded的产量次之。
[0059]
表2重组菌甲基硒代半胱氨酸的胞外产量
[0060][0061]
对比例1
[0062]
具体实施方式同实施例4，区别在于，采用半胱氨酸转运蛋白yaho(核苷酸序列如seq id no.25所示，氨基酸序列如seq id no.26所示，克隆基因所用引物yaho-f序列如seq id no.27所示，引物yaho-r序列如seq id no.28所示)，构建重组枯草芽孢杆菌/pp43nmk-smt/pstop1622-yaho；结果显示：胞外未能检测到甲基硒代半胱氨酸。
[0063]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。