一株快速裂解畜禽大肠杆菌的宽谱噬菌体及应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，与生物防控领域有关，本发明具体涉及一株快速裂解畜禽大肠杆菌的宽谱噬菌体及应用。


背景技术：

2.大肠杆菌(escherichia coli)是一种条件致病性细菌，正常情况下被认为是正常肠道菌群的组成部分。一旦机体抵抗力下降，某些致病性强的菌株能够引起人体或者动物胃肠道感染，还会引起尿路感染、关节炎、脑膜炎以及败血症等。随着近年来我国规模化集约化畜禽养殖的大力发展与推广，病原性大肠杆菌对畜禽养殖业所造成的经济影响已日益明显，甚至威胁到畜牧业的健康可持续发展。
3.禽大肠杆菌病是对我国养禽业危害极大的重要疾病之一，常与其他呼吸道疾病混合感染，导致禽类的全身性感染和特征性纤维性病变，急性病例能够引起败血症，亚急性病例引起心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎、肠炎和输卵管炎。鸡群感染大肠杆菌的发病率一般为11％
‑
69％，死亡率为3.2％
‑
72.9％，各品种及各日龄的禽类均可发病，给养禽业带来巨大经济损失。
4.仔猪黄白痢是由于感染致病性大肠杆菌而发生的一种急性传染病，多见于新生仔猪。仔猪黄痢多在7日龄内发生，有时甚至在出生后的12h左右就可发生；仔猪白痢多在10～21日龄发生。仔猪黄白痢发病率和死亡率均较高，是造成仔猪育成率低、影响养猪业效益的主要疾病之一，给猪场和养殖户带来巨大的经济损失。病猪口渴，吃乳减少，脱水、消瘦、昏迷、衰竭。仔猪突然拉稀，同窝相继发生，排乳白色、灰白色或淡黄白色，腥臭、糊状或浆状粪便。采取有效的方法控制仔猪黄白痢对仔猪生产具有重要意义。
5.由于不同地区流行的大肠杆菌优势血清型不同，各血清型之间又缺乏交叉免疫，给疫苗防治带来挑战。而细菌耐药性的变化及其对人类的潜在威胁等因素也制约了抗生素或抗菌药物的使用效果。因此，临床上亟需开发一种新的高效防治该病的生物制剂。
6.近年来，科研工作者发现使用噬菌体治疗大肠杆菌造成的感染具有良好的效果。噬菌体是感染细菌的病毒，它广泛分布于地球上的生物圈，具有严格的宿主特异性，对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。大肠杆菌烈性噬菌体可以在短时间内造成敏感细菌裂解，并且噬菌体裂解细菌具有指数增殖特性，可开发成具有杀菌作用的生物制剂。


技术实现要素：

7.为弥补现有技术存在的不足，本发明提供了一株快速裂解畜禽大肠杆菌的宽谱噬菌体及其在畜禽养殖中的应用。
8.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
9.申请人自湖北武汉某大型农贸市场废弃物中，分离出一株大肠杆菌噬菌体 grh
‑
ecp052，该噬菌体已于2021年8月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉
武汉大学；保藏编号为cctcc no：m20211009，分类命名：大肠杆菌噬菌体(escherichia coli phage)grh
‑
ecp052。
10.进一步地，所述的大肠杆菌噬菌体具有较宽的裂解谱，对分离自全国不同省份的禽源致病性大肠杆菌裂解率为97.5％，猪源致病性大肠杆菌裂解率为94.5％。
11.所述的大肠杆菌噬菌体具有裂解速度快的特点，平板点滴实验3h内可出现明显的裂解圈。
12.所述的大肠杆菌噬菌体在防治家禽大肠杆菌病及猪大肠杆菌病均有良好的效果。
13.本发明的有益效果：
14.(1)本发明所述的大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052裂解谱宽，对全国不同省份分离的禽源及猪源大肠杆菌均有较高的裂解率；
15.(2)本发明所述的大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052能够快速裂解大肠杆菌，平板点滴裂解实验可3h内出现透明裂解圈；
16.(3)本发明所述的大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052具有较高的发酵效率，发酵6h效价达到3.5x10
12 pfu/ml；
17.(3)本发明所述的大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052对畜禽大肠杆菌病的防治具有良好的效果。
18.更详细的技术方案见《具体实施方式》的内容。
附图说明
19.图1:本发明噬菌体噬菌斑。
20.图2：噬菌体点滴裂解图
具体实施方式
21.实施例1：
22.大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052分离纯化
23.采集自湖北武汉某大型农贸市场废弃物样品8份，每份样品用20ml无菌pbs重悬混匀，5000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的2
×
tsb液体培养基及 1ml处于对数期的大肠杆菌菌液(108cfu/ml)均匀混合，于37℃下180rpm过夜培养，富集噬菌体。将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液100ul与其宿主大肠杆菌菌液300ul均匀混合，静置15min 使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入10ml冷却至50℃的tsb半固体琼脂培养基，混匀后立即铺于已凝固的tsa平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养8
‑
12h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1ml sm液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mltsb液体培养基中，加入100ul相应的宿主大肠杆菌菌液并混匀，37℃下180rpm过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3
‑
5次后，得形状和大小一致的噬菌斑(图1)。
24.最后获得一株噬菌体，命名为噬菌体grh
‑
ecp052，该噬菌体已于2021年8月10 日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为cctccno：
m20211009，分类命名：大肠杆菌噬菌体(escherichia coli phage)grh
‑
ecp052。
25.实施例2：
26.大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052裂解谱测定
27.取效价约为1.0x108pfu/ml大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052的原液，采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。
28.挑取分离自全国不同地区的禽源大肠杆菌571株和猪源大肠杆菌385株，分别接种于盛有3ml tsb的离心管中，37℃180rpm培养8h，制得各株细菌菌悬液。取300ul 菌悬液分别与tsb半固体培的养基混合铺于已制备好的tsa平板上，取10ul噬菌体 grh
‑
ecp052培养液滴于平板上。待自然风干后37℃培养8
‑
12h，观察结果。结果如表 1所示，大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052可裂解571株禽源大肠杆菌中的557株，裂解率为97.5％；可裂解385株猪源大肠杆菌中的364株，裂解率为94.5％。说明大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052具有较宽的裂解谱。
29.表1大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052裂解谱测定结果
[0030][0031][0032]
实施例3：
[0033]
大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052裂解速率测定
[0034]
取效价约为5.0x108pfu/ml大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052的原液，采用点滴法来测定噬菌体的裂解效率。
[0035]
挑取大肠杆菌单克隆，分别接种于盛有3ml tsb的离心管中，37℃180rpm培养 8h，制得各株细菌菌悬液。取300ul菌悬液分别与tsb半固体培的养基混合铺于已制备好的tsa平板上，取10ul噬菌体grh
‑
ecp052培养液滴于平板上。待自然风干后3 7℃培养，每0.5小时取出一次观察裂解结果。同时以噬菌体gdcp17(cctcc no： m2020664)作为对照。
[0036]
结果如表2所示，大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052在2h时开始出现裂解圈，3h后裂解圈即完全透明(图2)，而大肠杆菌噬菌体gdcp17(cctcc no：m2020664)则在3h时开始出现裂解圈(图2)，在5h时裂解圈才完全透明(表2)。说明大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052裂解大肠杆菌
效率高，能够快速裂解大肠杆菌，在畜禽大肠杆菌的防治中可以迅速发挥作用。
[0037]
表2大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052的裂解速率
[0038][0039]
“‑”
表示无裂解；“ ”表示有轻微裂解，裂解斑模糊；“ ”表示裂解，裂解斑较为清晰；“ ”[0040]
表示裂解，裂解斑非常清晰。
[0041]
实施例4
[0042]
大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052的发酵制备
[0043]
挑取宿主大肠杆菌单个菌落，接种到盛有3ml tsb培养液的试管中，37℃摇床中180rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml tsb培养液中，37℃180rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。发酵制备的体系为6l，发酵培养基为tsb培养基。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中接入噬菌体和宿主沙门菌。发酵过程中通入无菌空气，并加入3
‰
消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml发酵液于无菌容器中，5000 rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。
[0044]
由表3可知，噬菌体grh
‑
ecp052在发酵6h后效价有大幅度提高，达到3.5x10
12 pfu/ml。因此，可利用发酵法对该噬菌体进行大规模工业制备，且发酵时间短发酵效率高，可有效节约生产成本。
[0045]
表3大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052的发酵动态
[0046][0047]
实施例5：
[0048]
噬菌体grh
‑
ecp052临床使用效果
[0049]
(1)大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052在防治家禽致病性大肠杆菌感染中的作用
[0050]
选用健康的1日龄蛋雏鸡80只，预饲2周并检测粪便中的噬菌体。确认粪便中不含能裂解攻毒菌株的噬菌体后，将雏鸡随机分为预防组、治疗组、攻毒组及空白对照组。第0d，空白对照组进行腹腔注射生理盐水；预防组给予噬菌体grh
‑
ecp052(浓度为 1.0x10
8 pfu/ml)1:1000稀释集中饮水3h，连饮3天后，腹腔注射禽致病性大肠杆菌(浓度为109cfu/ml，剂量为0.2ml)。治疗组腹腔注射禽致病性大肠杆菌(浓度为10
9 cfu/ml，剂量为0.2ml)，攻毒12h后，给予噬菌体grh
‑
ecp052(1.0x108 pfu/ml) 治疗，1:1000稀释，集中饮水3h，连饮3天
治疗。攻毒组腹腔注射禽致病性大肠杆菌 (浓度为109cfu/ml，剂量为0.2ml)，空白组不予处理。分别统计在攻毒后24h、 72h、144h雏鸡的死亡数及总死亡率，并与144h后对存活的雏鸡进行肝脏大肠杆菌分离，统计大肠杆菌阳性率。
[0051]
实验结果表明，大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052能够有效降低雏鸡死亡率(表4)，能够有效清除肝脏大肠杆菌的感染(表5)，能够有效预防与治疗致病性大肠杆菌感染。
[0052]
表4噬菌体grh
‑
ecp052对雏鸡死亡率的影响
[0053][0054]
表5雏鸡肝脏大肠杆菌检出情况
[0055]
组别数量大肠杆菌阳性雏鸡(羽)大肠杆菌阳性率(％)预防组2000治疗组2000攻毒组1111100空白对照组2000
[0056]
(2)大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052对仔猪黄白痢的治疗效果
[0057]
湖北某规模猪场，9日龄仔猪发生黄白痢腹泻。将病猪随机分成两组，分别为噬菌体组(70头)和抗生素组(73头)。噬菌体组：给予噬菌体grh
‑
ecp052 4ml/天/头，连续灌服3天；抗生素组灌服恩诺沙星4mg/kg体重/天(按有效成分计算)，连续灌服 3天；统计比较两者腹泻率与断奶存活率。
[0058]
结果如表5所示：大肠杆菌噬菌体grh
‑
ecp052可以有效治疗大肠杆菌引起的仔猪黄白痢，提高断奶仔猪存活率，且效果优于恩诺沙星。
[0059]
表5噬菌体grh
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ecp052对仔猪黄白痢的治疗效果
[0060]
分组治疗前腹泻率治疗后腹泻率断奶仔猪存活率噬菌体组100％4.3％100％抗生素组100％19.2％97.3％