基于AFM1抗独特型纳米抗体替代抗原的VHH-ELISA方法与流程

基于afm1抗独特型纳米抗体替代抗原的vhh
‑
elisa方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体作为黄曲霉毒素m1抗原替代物的应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素是由黄曲霉或者寄生曲霉产生的代谢物，它们污染了多种农产品，在农作物的生长、收获、贮存和加工过程中均被发现。这些代谢物是剧毒，致突变，致畸和致癌的化合物，已被认为是人肝和肝外致癌作用的致病因子。黄曲霉毒素b1(afb1)毒性最高，被国际癌症研究机构归为1类人类致癌物。afm1是afb1的羟基化代谢产物。摄取被afb1污染的饲料的泌乳动物会将afm1排泄到牛奶中，因此可以在各种各样的牛奶产品中找到它。 afm1也具有毒性和致癌作用，已被分类为1类致癌物。由于afm1污染对人体健康(特别是对婴儿和儿童)的危害，已成为全球关注的问题。欧盟对牛奶中afm1的限制为0.05ng/ml。但是，中国、美国和巴西的限定标准均为0.5ng/ml。
3.先前已经建立了许多用于afm1检测的方法。高效液相色谱(hplc)和荧光检测(fd) 成功取代了薄层色谱法(tlc)，仍然是应用最广泛的方法之一。目前，液相色谱串联质谱 (lc
‑
ms/ms)和电喷雾电离四极杆飞行时间质谱已经开发了。所有这些步骤都依赖昂贵的成本，设备完善的实验室和几个小时，从而削弱了它们在afm1检测中的应用。另一方面，酶联免疫吸附测定(elisa)由于其成本低廉且易于应用而变得越来越流行。免疫学方法适用于快速检测黄曲霉毒素。elisa检测方法所需样品量少，是一种高通量测定afm1的常规分析方法。由于afm1为小分子物质，不能单独作为抗原，因此常与牛血清白蛋白(bsa)、卵清白蛋白(ova)等偶联后作为完全抗原后使用。但是，完全抗原的合成工艺复杂且昂贵，需要使用大量的afm1标准品，不仅对操作人员造成极大的威胁，同时还可能会对环境造成二次污染。因此，抗独特型抗体(anti
‑
idiotype)的提出可以为此提供解决方案，识别独特型抗体可变区的抗独特型抗体模仿了抗原的三维结构，这些抗原表达了jerne所描述的免疫学“内部图像”，并且模仿抗原的构型，所以抗独特型抗体可以用作afm1抗原替代品来开发一种elisa的安全形式。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种基于afm1抗独特型纳米抗体替代黄曲霉毒素m1标准品的elisa免疫分析方法。
5.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
6.提供黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体作为黄曲霉毒素m1抗原替代物的应用，所述黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体为黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体vhh c4，其氨基酸序列如 seq id no:1所示。
7.按上述方案，编码黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体氨基酸的核苷酸序列如seq id no:2 所示。
8.基于afm1抗独特型纳米抗体替代黄曲霉毒素m1标准品的elisa免疫分析方法，步骤如下：将黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体vhh c4替代黄曲霉毒素m1抗原包被酶标板，将待检测样品(含黄曲霉毒素m1的样品)作为竞争物进行竞争抑制elisa反应，检测获得结合率b/b0值，基于黄曲霉毒素m1浓度
‑
结合率b/b0值标准曲线，获得黄曲霉毒素m1的浓度。
9.按上述方案，所述的竞争抑制elisa反应具体为：将黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体vhh c4稀释后包被于酶标板，4℃包被过夜；次日，用封闭液进行封闭，37℃下孵育1h；向酶标孔中加入甲醇/pbs缓冲液，将黄曲霉毒素m1单克隆抗体和竞争物用pbs 7.4缓冲液稀释后加入到酶标孔中，37℃孵育1h；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃温育1h；再加入显色液，37℃反应15min后，测定od
450
，获得结合率b/b0值。
10.按上述方案，所述黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体的包被浓度为20μg/ml～1.25μg/ml。
11.按上述方案，所述封闭液为3％bsa、1.5％ova或3％脱脂奶粉。
12.按上述方案，所述甲醇/pbs缓冲液的ph值为7.0～7.4。
13.按上述方案，所述甲醇/pbs缓冲液中甲醇浓度为5％～10％。
14.按上述方案，所述的待检测样品(含黄曲霉毒素m1的样品)为乳产品，包括酸奶，牛奶或奶粉等。
15.本发明提供了黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体vhh c4作为黄曲霉毒素m1抗原替代物的应用。提供了一种基于纳米抗体替代抗原的vhh
‑
elisa方法，同时优化了基于纳米抗体替代抗原的vhh
‑
elisa方法中使用的包被浓度、黄曲霉毒素m1单克隆抗体工作浓度、封闭试剂、ph、甲醇浓度。
16.本发明的有益效果如下：
17.本发明提供了黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体vhh c4作为黄曲霉毒素m1抗原替代物的应用，并建立了黄曲霉毒素m1抗独特型基于纳米抗体替代抗原的vhh
‑
elisa方法。本发明选用样品测定黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体velisa的添加回收率，回收率在84.1％～119.1％之间，准确度良好，证明黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体替代抗原vhh
‑
elisa法结果准确、可靠，是一种有效、可行的免疫分析方法。
附图说明
18.图1为用于判断噬菌体展示纳米抗体免疫文库多样性的测试结果。
19.图2为phage
‑
elisa鉴定阳性克隆。
20.图3为vhh c4与抗黄曲霉毒素b1(简称afb1)、赭曲霉毒素a(简称ota)、t
‑
2毒素(简称t
‑
2)单克隆抗体的结合情况。
21.图4为棋盘法优化vhh c4包被浓度和黄曲霉毒素m1单克隆抗体工作浓度。
22.图5为封闭试剂对velisa的影响。
23.图6为磷酸盐缓冲液ph值对velisa的影响。
24.图7为盐离子浓度对velisa的影响。
25.图8为甲醇浓度对velisa的影响。
26.图9为基于vhh c4的velisa对黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g1和黄曲霉毒素m2的交叉反应情况。
27.图10为vhh c4在不同样品基质中对afm1的竞争曲线。
具体实施方式
28.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
29.以下实施例中，所述黄曲霉毒素m1单克隆抗体是由保藏编号为cctcc no.c201018的杂交瘤细胞株2c9分泌产生，杂交瘤细胞株2c9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，且已在专利《杂交瘤细胞株2c9、其产生的抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体及其应用》，申请号：201110108230.6中公开。
30.实施例1噬菌体展示纳米抗体免疫文库的构建
31.1.羊驼免疫
32.取抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体(溶于pbs7.4)200μg，与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，对三周岁的雄性羊驼(alpaca)进行皮下多点注射，此后每隔两周免疫一次，共免疫8 次，四免后开始采血检测。在第四次免疫后7～10天，用edta真空采血管颈静脉采血10ml，同时轻柔颠倒采血管避免血液凝固，再用leukolock试剂盒中的滤器处理血液，然后依次用3mlpbs缓冲液和3ml rnalater缓冲液冲洗滤器，则所需的白细胞就截留在滤器里，最后将滤器密封保存于
‑
80℃，以备提rna用。
33.2.总rna提取
34.按照life technology公司leukolock total rna提取试剂盒的操作手册分离羊驼血液中总rna，具体操作如下：
35.(1)向2.5ml裂解/结合液中加入70μlph调节缓冲液，现配现用；(2)将密封的滤器放置恢复至室温，打开滤帽，用2ml注射器将滤器内残留的rnalater缓冲液冲去；(3)用 2.5ml注射器吸取2.5ml现配裂解/结合缓冲液冲洗滤器一次，流出液用15mlrnase
‑
free离心管收集；(4)加入不含核酸酶的ddh2o 2.5ml，涡旋混匀，加入25μl蛋白酶k，将离心管于室温250g震荡5min；(5)取出保存于4℃的rna结合磁珠，涡旋混匀后吸取50μl至上述离心管中，涡旋离心管，再向离心管中加入异丙醇2.5ml，室温震荡5min；(6)将上述离心管于3200g离心3min，仔细吸出上清弃去，注意不要吸到沉淀的磁珠；(7)加入600μl 洗液i，反复吹打沉淀的磁珠使其分散均匀，转移悬液至1.5ml离心管，再用600μl洗液i 漂洗15ml离心管一次，并转移至同一1.5ml离心管中；(8)将1.5ml离心管于16000g离心30s，小心弃去上清；(9)加入750μl洗液2/3，剧烈涡旋震荡30s使聚集沉淀的磁珠分散开，于16000g离心30s收集磁珠，小心弃去上清；(10)将离心管敞开盖子在超净台中静置 2min，挥发洗液2/3中残留的酒精，期间，现配turbodnase master混液，取4μlturbo dnase (20u/μl)加入到296μl leukolock dnase缓冲液中，混合均匀后转移至上述离心管中，用移液枪反复吹打沉淀的磁珠，使之分散均匀，室温下1000g震摇10min，中途轻轻颠倒混合几次；(11)向上述离心管中依次加入裂解/结合液(未加ph调节缓冲液)和异丙醇各300μl，混匀后点动离心2s，然后室温下孵育3min；(12)于16000g离心30s，弃上清，加750μl洗液2/3，剧烈涡旋30s，16000g离心30s，弃上清，再次加入750μl洗液2/3，剧烈涡旋30s， 16000g离心1min，尽可能弃干上清，室温敞口静置3min，使残留的洗液挥发掉，注意不能放置过久以免磁珠过度干燥；(13)加入洗脱液60μl，涡旋震荡30s，16000g离心2min后，洗脱下来的rna溶液转移至另一不含核酸酶的
1.5ml离心管中，留取1μlrna溶液用 nanodrop测浓度，再取3μl左右rna溶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩下的rna溶液立即全部反转成cdna，防止发生降解。
36.3.cdna的合成
37.按照反转录试剂盒说明书合成cdna第一链，步骤如下：
38.(1)取两支200μl不含核酸酶的pcr管，各加入3μl 10mm dntpmix、3μl 50μm oligo(dt)20、24μlrna，轻柔混匀；
39.(2)65℃加热5min，使模板变性，二级结构打开；
40.(3)立即置于冰上冷却至少1min；
41.(4)现配合成cdna的预混液：
[0042]042][0043]
(5)向两支pcr管中各加30μl预混液，用微量移液器混匀；
[0044]
(6)将反应混合液进行加热：50℃退火反应50min，然后85℃加热5min使反应终止；
[0045]
(7)向反应混合液中各加入3μlrnaseh并混匀，在37℃加热处理20min，分解未完全反应的rna；
[0046]
(8)第一链cdna的合成完成，分装后于
‑
20℃保存备用。
[0047]
4.重链抗体可变区vhh基因的扩增
[0048]
取igg2和igg3可变区vhh基因各自的简并引物对，以cdna为模板分别进行聚合酶链式反应(pcr)扩增，引物对f、r2用于克隆igg2亚型，引物对f、r1用于igg3亚型的克隆，反应体系如下：
[0049][0050]
pcr程序为：
[0051][0052]
其中扩增igg2、igg3对应的上游引物分别为引物r2、r1，引物序列如表1所示。
[0053]
表1 vhh抗体基因扩增与测序引物序列表
[0054][0055]
5.噬菌体展示纳米抗体文库的构建
[0056]
采用sfii分别对载体pcomb3x和vhh进行酶,运用t4连接酶连接酶切后的vhh片段与载体pcomb3x，取3μl连接产物到25μl e.coli er2738感受态细胞中，轻混后全部吸出转移至预冷电转杯(内径为1mm)中，快速放置于电转仪中进行电转化；电击后，立即加入1ml37℃预热的soc培养基到电转杯中，用移液枪轻轻吸打混匀，转移至摇菌管中，于37℃摇床中250g震荡复苏培养1h；重复电转了10次，每次3μl连接产物，汇集10次转化的菌液并取1μl用无菌水稀释10倍后涂布在lb
‑
amp平板上，于37℃培养箱培养过夜用于估算库容量。将全部转化菌转至200mlsb培养基中，加入羧苄青霉素至50μg/ml、四环素至 20μg/ml；250g，37℃培养至od
600
为0.6；加入1ml辅助噬菌体(1
×
10
13
pfu/ml)，37℃静置侵染30min；250g，37℃培养2h，加入卡那霉素至浓度为70μg/ml，继续培养过夜；次日，将菌液离心，4℃、10000g离心15min；取上清到无菌离心管中，加1/4体积peg/nacl溶液，冰浴2h，再离心，弃上清，用10ml重悬液(含1
×
蛋白酶抑制剂、0.02％nan3、0.5％bsa 的pbs缓冲液)重悬沉淀；用0.22μm滤器过滤噬菌体溶液，除去残留的细菌等；所得噬菌体溶液即为噬菌体展示纳米抗体文库，将其分装、做好记号，保存于
‑
70℃。
[0057]
6.噬菌体展示纳米抗体免疫文库的鉴定
[0058]
从平板上随机挑30个单克隆各至1mlsb培养基中，37℃培养至菌液od
600
约为0.8，取出菌液，以gback为引物(见表1)，送公司测序，分析克隆序列，判定所建库的多样性程度。测序结果如图1所示，从所选30个单克隆的插入片段的氨基酸序列可以看出，纳米抗体的保守区fr1、fr2、fr3和fr4具有高度的相似性，而可变区cdr1、cdr2和cdr3 区不尽相同。尤其是cdr3区(氨基酸100位至120位之前的区域)的高度多样性使得噬菌体展示文库具有丰富的多样性，表明所构建的噬菌体展示纳米抗体库多样性良好，可用于后续的筛选工作。
[0059]
实施例2黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体的淘选及鉴定
[0060]
(一)黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体的淘选
[0061]
以黄曲霉毒素m1单克隆抗体为靶标物(所述黄曲霉毒素m1单克隆抗体是由保藏编号为 cctcc no.c201018的杂交瘤细胞株2c9分泌产生，杂交瘤细胞株2c9已于2010年7月13 日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，且已在专利《杂交瘤细胞株2c9、其产生的抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体及其应用》，申请号：201110108230.6中公开)，通过逐轮降低包被原浓度、竞争洗脱的黄曲霉毒素m1标准品浓度，交替使用封闭试剂，进行亲和富集淘选，获得针对黄曲霉毒素m1单克隆抗体的抗体，即抗抗体，又称作抗独特型抗体，淘选步骤如下：
[0062]
(1)包被：包被黄曲霉毒素m1单克隆抗体，50μg/ml，100μl/孔，包6孔，用包被buffer 稀释均可；去吸附孔，包被3％bsa/pbs，300μl/孔，包6孔；4度过夜包被的效果优于37℃孵育2h；
[0063]
(2)封闭：3％pbstm，300μl/孔，37℃孵育2h后，手洗板3次；
[0064]
(3)加库至包被抗原孔：100μl/孔，37℃反应1h，再室温摇床反应1h，然后用带滤芯枪头手洗这6个孔，洗板10次；
[0065]
(4)洗脱：配制100ng/ml黄曲霉毒素m1标准品，室温摇床反应30min；
[0066]
(5)去吸附：将洗脱液转移到去吸附孔，100μl/孔，室温反应1h；
[0067]
(6)汇集600μl洗脱物，称为“1st output”，第一轮淘选完成；1st output需经过扩增才能用于第二轮的淘选；
[0068]
(7)测定“1st output”滴度，取10μl“1st output”，梯度稀释至103、104、105，这3个稀释液各取10μl侵染90μl er2738(od为0.8)，37℃静置30min，涂布lb
‑
amp(氨苄)平板，37℃过夜培养，次日数平板上的单克隆数，估算滴度。
[0069]
在随后的淘选中，包被抗体浓度逐步减少，洗脱液中黄曲霉毒素m1浓度逐渐降低，进行三轮淘选，淘选过程见表2，淘选富集结果见表3。
[0070]
表2噬菌体纳米抗体库的淘选
[0071][0072]
表3每轮淘选噬菌体富集结果
[0073]
[0074]
(二)阳性噬菌体克隆的鉴定
[0075]
(1)从最后一轮淘选的output滴度平板上随机挑取30个单克隆,于lb
‑
amp平板上保菌,同时接入3mlsb培养基；
[0076]
(2)37℃摇床培养4
‑
5h，至od值为0.8，加入30μlm13ko7辅助噬菌体，37℃静置30min；
[0077]
(3)37℃摇床培养1h，加终浓度为70μg/mlkana，37℃培养；
[0078]
(4)次日，各取500μl菌液离心，5000g、10min，上清直接用于phage
‑
elisa；
[0079]
(5)elisa板封闭，3％pbstm，300μl/孔，37℃孵育1h，机洗板3次；
[0080]
(6)每个克隆的噬菌体上清加到对应的3个孔中，每孔50μl，1,4,7,10列加50μl标准品，2,3,5,6,8,9,11,12列加50μl10％甲醇/pbs缓冲液，加好后酶标仪震荡混匀；
[0081]
(7)37℃静置1h，手洗板10次；
[0082]
(8)二抗，anti
‑
m13辣根过氧化物酶，1:5000稀释，37℃孵育1h；
[0083]
(9)显色，37℃温育15min，检测450nm处的吸光值。
[0084]
对30个克隆做phage
‑
elisa，发现它们与黄曲霉毒素m1单克隆抗体结合反应差别较大。phage
‑
elisa测定中，与抗体反应od
450
值较高，同时加入afm1后od
450
值明显降低现象的噬菌体克隆判定为阳性，结果如图2所示，通过四轮淘选共获得21个阳性克隆(依次为1、2、3、4、6、7、8、11、12、14、16、17、20、21、23、24、25、27、28、29、30号克隆)。根据上述elisa结果，将阳性克隆从保菌平板上挑出，活化培养后送至上海生工公司进行序列分析，测序引物为gback，对21个阳性克隆进行基因测序，结果显示21个单克隆具有相同的氨基酸序列，表明在筛选过程中成功富集到1株可以与黄曲霉毒素m1单克隆抗体特异性结合的纳米抗体，命名为黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体vhhc4其氨基酸序列如seqidno:1所示，核苷酸序列如seqidno:2所示。
[0085]
实施例3黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体的表达与纯化
[0086]
(一)top10f’感受态细胞的制备：
[0087]
(1)用挑取适量top10f’划线于lb
‑
四环素平板，37℃培养过夜；
[0088]
(2)挑取top10f’单克隆到5mllb培养基中，37℃、250rpm培养至od
600
为0.6～0.8；
[0089]
(3)将菌液置于冰上静置30min；
[0090]
(4)4℃下，5000g离心5min后迅速置回冰上，弃上清，加入1ml预冷的0.1mcacl2溶液重悬菌体，吸打混匀后冰浴7min；
[0091]
(5)重复上述操作一次；
[0092]
(6)4℃下，5000g离心5min后迅速置回冰上，彻底吸尽液体，沉淀用100μl预冷的0.1mcacl2溶液重悬，即为top10f’感受态细胞。
[0093]
(二)阳性噬菌体克隆质粒的提取与转化：
[0094]
(1)从vhhc4/er2738的甘油菌中，挑适量划线于lb
‑
氨卞平板，37℃培养过夜；
[0095]
(2)挑vhhc4/er2738单菌落到2mlsb培养基中，37℃培养到od
600
为0.8，提取vhhc4的质粒；
[0096]
(3)冰上，加1.5μlvhhc4质粒到上述制备的100μltop10f’感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；
[0097]
(4)42℃热击90s，迅速放回冰上，放置5min；
[0098]
(5)超净工作台内，向每个离心管中加入700μl lb培养基，37℃、200rpm复苏培养45min；
[0099]
(6)4℃下，12000g离心4min，吸弃上清，向离心管中加入100μl lb培养基重悬沉淀，混匀后涂布lb
‑
氨苄平板，37℃过夜培养。
[0100]
(三)纳米抗体的诱导表达与纯化
[0101]
在vhh c4/top10f’的平板上，挑单菌落到3mlsb培养基，37℃，250rpm摇床培养过夜后，转接200μl过夜菌到200mlsb培养基中，继续培养至od
600
为0.6，加入200μl 1m iptg， 37℃诱导过夜。4℃，8000g、15min离心收菌，根据菌体沉淀质量，按20ml/g加入裂解液 b
‑
per，充分分散沉淀后室温缓慢摇动10min，再12000g离心20min，上清即为纳米抗体的粗取液。用0.01m pbs7.4透析粗提液，再过0.22μm水相滤膜，以备镍柱纯化。
[0102]
使用ni
‑
nta his
·
bind resin试剂盒纯化纳米抗体粗提液，步骤如下：
[0103]
(1)依次用10倍层析柱体积的无菌ddh2o、0.01mol/l pbs7.4平衡柱子；
[0104]
(2)将过滤除菌后的粗提液加到层析柱中，与填料混合后，室温下摇动1h，使纳米抗体与填料充分结合；
[0105]
(3)将混合液装入柱中，用10倍柱体积的0.01mol/l pbs7.4平衡柱子；
[0106]
(4)由1m咪唑分别配制20mm、40mm、300mm的咪唑
‑
pbs7.4各10ml，过0.22μm水相滤膜，用作洗脱液进行梯度洗脱，用2ml离心管收集流出液；
[0107]
(5)用10ml的20mm的咪唑
‑
pbs7.4过柱子，不收集流出液；
[0108]
(6)用10ml的40mm的咪唑
‑
pbs7.4过柱子，收集前3ml流出液
[0109]
(7)用10ml的300mm的咪唑
‑
pbs7.4过柱子，收集全部流出液；
[0110]
(8)用10倍柱体积的1m的咪唑
‑
pbs7.4洗柱子，不收集流出液，使非特异性结合的杂蛋白全部被洗脱下来；
[0111]
(9)依次用10倍柱体积的pbs、10倍柱体积的ddh2o、10倍柱体积的20％乙醇洗柱，最后用等体积20％乙醇水封柱保存。
[0112]
对各管流出液作sds
‑
page电泳分析，将有明显纳米抗体条带的流出液混合，于pbs 缓冲液中4℃透析过夜，然后用超滤管浓缩，即得vhh c4纳米抗体溶液，并分装于
‑
20℃保存。
[0113]
实施例4抗独特型纳米抗体vhh c4的特异性分析
[0114]
(1)抗独特型纳米抗体vhh c4的特异性分析：用包被缓冲液分别配制浓度为0.2μg/ml 的黄曲霉毒素b1抗原即afb1‑
bsa、赭曲霉毒素a抗原即ota
‑
bsa、t
‑
2毒素抗原即t
‑2‑
bsa 和黄曲霉毒素m1抗原即afm1‑
bsa，4℃过夜包被酶标板；次日，用3％脱脂奶粉/常规磷酸盐缓冲液常规磷酸盐吐温缓冲液溶液封闭，300μl/孔，37℃孵育1h，将抗黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素m1、赭曲霉毒素ota和t
‑
2毒素的四种单克隆抗体从10μg/ml开始，用常规磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，37℃孵育1h；加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠单克隆抗体，37℃温育1h；加入显色液，37℃显色15min，加入终止液，测定od
450
。
[0115]
按上述方法包被、封闭后，将vhh c4用常规磷酸盐缓冲液依次三倍稀释，按以上优化的浓度配制抗黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素m1、赭曲霉毒素ota和t
‑
2毒素的四种单克隆抗体，分别加入50μlvhh c4稀释液和50μl对应的单克隆抗体到各孔中，酶标仪振荡混匀， 37℃孵育1h；再按1:5000稀释加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，37℃反应1h；同以上方法
均不存在交叉反应，则velisa特异性好，可针对性地检测乳制品中的黄曲霉毒素m1。
[0126]
实施例6 vhh
‑
elisa样品分析方法的建立
[0127]
(1)纳米抗体vhh c4在不同样品基质中对afm1的竞争曲线
[0128]
对牛奶和酸奶空白样品直接取10ml在4℃下5000g离心10min，用去除乳脂层的下层清液直接稀释黄曲霉毒素m1标准品，建立基质提取液的velisa竞争抑制曲线；对于奶粉空白样品，在分析天平上准确称取10g溶于50℃预热纯水中，定容至100ml，充分混匀后取 10ml在4℃下5000g离心10min，用去除乳脂层的下层清液直接稀释黄曲霉毒素m1标准品，建立基质提取液的velisa竞争抑制曲线，并与不含基质的反应体系下建立的标准曲线进行比较，结果显示三种样品均对velisa存在较小的基质效应，使基质曲线与无基质时接近，结果如图10所示。
[0129]
(2)vhh
‑
elisa在实际样品检测中的应用
[0130]
为了评价velisa检测体系的准确性，采用新建立的velisa方法进行了牛奶、酸奶和奶粉样品的添加回收试验。分别对空白的牛奶、酸奶和奶粉样品添加400、600、800ng/l的黄曲霉毒素m1标准溶液，用新建立的方法velisa法检测样品提取液中的afm1含量，结果见表4。afm1的添加回收试验显示，样品添加回收率在84.1～119.1％之间，表明本研究建立的基于纳米抗体velisa方法能够应用于黄曲霉毒素m1的污染监测中。
[0131]
表4基于纳米抗体vhh
‑
eilsa的样品添加回收试验
[0132][0133][0134]
注：每个结果为重复三次的平均值
[0135]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变
动仍处于本发明创造的保护范围之内。