结合TIGIT抗原的抗体及其制备方法与应用与流程

结合tigit抗原的抗体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术-抗体领域。本发明涉及一种拮抗抑制t细胞免疫球蛋白和itim结构域蛋白tigit(t-cell immunoreceptor with ig and itim domains)与其配体结合的抗体及其编码序列与其制备方法和用途。


背景技术：

2.t淋巴细胞介导的细胞免疫在识别监控、与攻击杀灭肿瘤细胞的过程中起着非常关键的作用。t淋巴细胞通过协同刺激因子(co-stimulatory molecules)或协同抑制因子(co-inhibitory molecules)与表达在如肿瘤靶细胞或抗原呈递细胞(antigen presenting cells，apc)上的配体结合而传导免疫功效。其中协同抑制因子也叫免疫抑制检查点(inhibitory immune checkpoint molecules)，主要包括ctla-4(cytotoxic t-lymphocyte antigen-4)与其配体b7-1(cd80)、b7-2(cd86)；程序性死亡受体pd-1(programmed death-1)与其配体pd-l1和pd-l2；lag-3(lymphocyte activation gene-3)与其配体；tim-3(t-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3)与其配体；btla(b and t lymphocyte attenuator)与其配体等。这些免疫检查点蛋白在分子结构上都很相似，多数属于免疫球蛋白超家族成员。
3.已有多个拮抗抑制ctla-4，或pd-1/pd-l1的单克隆抗体药物上市销售，在多种肿瘤治疗上表现出显著的疗效。如2011年美国fda批准上市用于治疗晚期黑色素瘤(melanoma)的抗ctla-4单抗药物ipilimumab(商品名yervoy)；2014年批准用于治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,nsclc)的抗pd-1单抗药物nivolumab(商品名opdivo)、pembrolizumab(商品名keytruda)和2016年批准用于治疗非小细胞肺癌的抗pd-l1单抗药物atezolizumab(商品名tecentriq)等。
4.目前该领域的一大热点是寻找新型靶点以研究开发出更多类似靶向ctla-4和pd-1/pd-l等拮抗免疫抑制检查点的单抗类药物。tigit则是新发现的一种具有类似潜在药物开发前景的免疫抑制检查点分子。
5.tigit(t cell immunoreceptor with ig and itim domain)，最早由yu x等发现与报道(yu x：nat immunol.2009，10:48-57)。tigit又称为wucam(washington university cell adhesion molecule；vermi ks：eur j immunol 2009,39:695-703)，vstm3(v-set and transmembrane domain-containing protein 3；levin s：eur j immunol 2011,41:902-915)或vsig9(v-set and immunoglobulin domain-containing protein 9)。
6.人tigit蛋白全长有244个氨基酸，其中胞外区有141个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞质区80个氨基酸。小鼠tigit蛋白全长有241个氨基酸，与人tigit蛋白氨基酸序列同源性为60％。tigit蛋白的一个重要结构特征是在其胞内区尾部存在典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif,itim)，从而介导出免疫抑制信号，itim同样也存在于pd-1结构域中。
7.与pd-1类似，tigit主要表达在t细胞(包括辅助性t细胞，记忆性t细胞，cd8 效应t
细胞)和自然杀伤(natural killer,nk)细胞上，而识别与结合tigit的配体则主要表达在抗原呈递细胞如树突状细胞(dendritic cells，dc)、巨噬细胞、肿瘤细胞等靶向细胞上。
8.已知的识别与结合tigit的配体主要有3个：分别为cd155、cd112和cd113。cd155又称为pvr(poliovirus receptor，脊髓灰质炎病毒受体)；cd112和cd113则又分别称为pvrl-2和pvrl-3(poliovirus receptor-related protein-2，-3)。cd155与tigit的结合强于cd112或cd113与tigit的结合(yu x,nat immunol.2009,10:48-57；stanietsky n,proc natl acad sci u s a.2009,106:17858-63)。cd155、cd112及cd113均为nectin家族成员。
9.cd155或cd112也可与协同刺激因子cd226(dnam-1)结合，从而激活或上调t细胞免疫功效。但cd155或cd112与免疫抑制因子tigit结合的强度要稍高于其与cd226(dnam-1)的结合。tigit-cd226/cd155-cd112这种相互作用形成的平衡系统类似于cd28-ctla4/cd80-cd86免疫网络平衡系统。
10.cd155在人多种正常细胞上低水平表达，而在多种肿瘤细胞上高表达。肿瘤细胞通过上调表达cd155而抑制t细胞/nk细胞的免疫杀伤作用。因此，如开发出拮抗阻断tigit与其配体如cd155结合的单克隆抗体，则可解除免疫抑制，达到恢复t细胞/nk细胞对肿瘤的攻击杀伤作用。
11.国际上目前尚无tigit靶点相关药物获批上市，但已有多家制药企业如美国基因泰克公司(genentech)、百时美施贵宝(bms)、默沙东(msd)、oncomed等启动了抗tigit抗体新药研制并申请了相关专利保护。其中临床进展最快的为genentech公司代号为mtig-7192a的抗tigit单抗tiragolumab,目前已进入iii期临床试验阶段，用于联合靶向pd-l1单克隆抗体atezolizumab(商品名tecentriq)治疗非小细胞肺癌；genentech公司递交申请了抗tigit单抗一系列专利(包括授权美国专利号：us9499596b2及us10017572b2)。
12.bms公司代号为“bms-986207”的抗tigit单抗药物处于ii期临床研究阶段，用于单药或与bms公司的pd-1靶向药nivolumab(商品名opdivo)联合使用治疗肿瘤；bms公司递交申请了抗tigit单抗专利及授权(美国专利申请号:2016/0176963a1；授权美国专利号：us10189902b2)。
13.msd公司代号为“mk-7684”的抗tigit单抗药物在i/ii期临床研究阶段，用于与pembrolizumab(商品名keytruda)联合使用治疗肿瘤；msd公司递交申请了抗tigit单抗专利及授权(美国专利申请号:2016/0355589a1；授权美国专利号:us10618958b2)。
14.除此之外，目前国外还有其他几家企业，分别有抗tigit单克隆抗体药物进入临床研究阶段，其中包括potenza therapeutics公司代号为“asp8374”单抗(授权美国专利号:us9713641b2)；oncomed公司代号为“omp-313m32”单抗(美国专利申请号为no：2016/0376365 a1；授权美国专利号:us10544219b2)和arcus biosciences公司代号为“ab-154”单抗。
15.鉴于小鼠tigit与人tigit蛋白氨基酸序列同源性为60％左右，因此，理论上推测，采用传统的抗原蛋白免疫小鼠及杂交瘤技术，应可以制造或开发出全新的、或针对tigit抗原不同表位(epitope)的单克隆抗体。这些新的单抗可作为单药或与在研发的或已上市的其他药物如抗pd-1单抗、抗ctla-4单抗、抗41bb单抗、抗ox40单抗、抗cd38单抗、抗cd47单抗、抗vista单抗、抗btla单抗,抗vegf/vegfr等药物联合使用，用于治疗包括肿瘤在内的多种疾病。
16.本发明的一个目的在于获得新的、可高亲和力结合人tigit抗原并拮抗阻断tigit抗原与其配体如cd155(pvr)或cd122(pvrl-2)的单抗。该类抗体或其衍生体可作为药物成分，单独使用或与其他已上市或在研药物组合用于治疗包括肿瘤在内的多种疾病。


技术实现要素：

17.本发明要解决的技术问题之一是提供一种结合人tigit抗原的抗体或其衍生体如抗体fab片段、单链抗体等。该抗体或其衍生体可高亲和力结合人tigit抗原并拮抗阻断tigit抗原与其配体如cd155(pvr)结合。
18.本发明要解决的技术问题之二是提供编码上述抗体的dna分子或基因。
19.本发明要解决的技术问题之三是提供含有上述抗体的药物或药物组合物。
20.本发明要解决的技术问题之四是提供上述抗体或其衍生体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
21.本发明要解决的技术问题之五是提供制备上述抗体或其衍生体的方法。
22.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
23.在本发明第一方面，提供了一种高亲和力结合人tigit抗原并拮抗抑制tigit与其配体cd155结合的抗体或其衍生体，其包含第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区cdr1，cdr2和cdr3分别为seq id no：9，seq id no：10及seq id no：11所示的氨基酸序列；其中所述第二可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区cdr1，cdr2和cdr3分别为seq id no：14，seq id no：15及seq id no：16所示的氨基酸序列。
24.所述抗体包括人源化单克隆抗体，所述衍生体包括抗体fab片段、单链抗体、双特异抗体(bi-specific)等。
25.作为本发明优选的技术方案，所述抗体或其衍生体具有以下一项或多项特征：
26.a)包含抗体轻链可变区及抗体重链可变区，其轻链可变区序列与seq id no：17所示的氨基酸序列至少90％以上相同，其重链可变区序列与seq id no：19所示的氨基酸序列至少90％以上相同；
27.b)其与人tigit抗原结合的亲和力常数值(binding affinity，kd value)为10nm或者小于10nm(at 10nm or below 10nm)，该亲和力常数值可由fortebio-octet，biacore或其他类似的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance，spr)测定；
28.c)拮抗阻断tigit与其配体cd155(pvr)或cd112(pvrl2)结合。优选地，所述拮抗阻断tigit与其配体cd155(pvr)结合的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，ic50)为1nm或者小于1nm(at 1nm or below 1nm)(ic50是指表示物质发挥其最大抑制效果的一半时的浓度)。
29.作为本发明优选的技术方案，所述第一可变区是抗体轻链可变区，为seq id no：17所示的氨基酸序列；其所述第二可变区是抗体重链可变区，为seq id no：19所示的氨基酸序列。
30.作为本发明优选的技术方案，所述第一可变区是抗体轻链可变区，其氨基酸序列为seq id no：8所示；所述第二可变区是抗体重链可变区，其氨基酸序列为seq id no：13所示。
31.作为本发明优选的技术方案，所述抗体或其衍生体能拮抗阻断tigit与其配体cd155(pvr)或cd112(pvrl2)结合。
32.作为本发明优选的技术方案，其包含所述抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区，及包含所述抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的铰链区，ch1区，ch 2区和ch3区。
33.作为本发明优选的技术方案，所述人抗体轻链恒定区来自人抗体kappa链或抗体lamda链，所述人抗体重链恒定区来自人igg1，igg2，igg3或igg4等亚型，其中优选的为igg4亚型。
34.在本发明第二方面，提供了一种编码上述抗体或其衍生体的dna分子或基因(对应以下抗体或其衍生体：所述第一可变区是抗体轻链可变区，其氨基酸序列为seq id no：17所示；所述第二可变区是抗体重链可变区，其氨基酸序列为seq id no：19所示)，编码抗体轻链可变区的核苷酸序列如seq id no：18所示，编码抗体重链可变区的核苷酸序列如seq id no：20所示。
35.本发明还提供了另一种编码上述抗体或其衍生体的dna分子或基因(对应以下抗体或其衍生体：所述第一可变区是抗体轻链可变区，其氨基酸序列为seq id no：8所示；所述第二可变区是抗体重链可变区，其氨基酸序列为seq id no：13所示)，编码抗体轻链可变区的核苷酸序列如seq id no：7所示，编码抗体重链可变区的核苷酸序列如seq id no：12所示。
36.本发明的第三方面是提供了一种表达载体，它含有编码上述抗体或其衍生体的dna分子或基因以及与该dna分子或基因操作性相连的表达调控序列。
37.本发明的第四方面提供了一种重组宿主细胞，它由上述表达载体转化而成。该重组宿主细胞或其子代细胞表达上述抗体或其衍生体。该抗体包括人源化单克隆抗体，衍生体包括抗体fab片段、单链抗体、双特异抗体(bi-specific)等。
38.本发明的第五方面是提供一种药物或药物组合物，它含有药学上有效量的上述抗体或其衍生体，以及药学上可接受的载体。所述药物组合物成分包含如抗程序性细胞死亡-1(programmed death-1,pd-1)抗体或抗pdl-1抗体等其他类似抗体与药物。
39.本发明的第六方面是提供上述抗体或其衍生体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。上述抗体可作为单药或与在研发的或已上市的其他药物如抗pd-1抗体、抗pdl1抗体、抗ctla-4抗体、抗41bb抗体、抗ox40抗体、抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd24抗体、抗cd27抗体、抗cd28抗体、抗cd33抗体、抗cd38抗体、抗cd40抗体、抗cd47抗体、抗btla抗体、抗egfr抗体、抗her2抗体、抗vista抗体、抗vegf抗体、抗vegfr抗体等药物联合使用，用于治疗包括肿瘤在内的多种疾病。
40.在本发明的具体实施实例中，本发明描述了该抗tigit单抗33d2与抗pd-1单抗在小鼠体内抑制结肠癌生长的应用。
41.本发明第七方面是提供制备上述抗体或其衍生体的方法，该方法包括：
42.a)提供上述表达载体，该表达载体含有上述dna分子或基因以及与该分子或基因操作性相连的表达调控序列；
43.b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
44.c)在适合所述抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞：和
45.d)采用亲合层析从该宿主细胞培养液中分离纯化获得所述抗体或其衍生体。
46.本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
47.本文所采用的术语“人源化单克隆抗体”系将鼠源单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区(complementarity-determining regions，cdr)外，其它序列(包括可变区中的框架区序列)全部或大部分替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。
48.本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
49.本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。互补决定区(cdr)的氨基酸序列的界定可参考kabat系统(kabat,e.a.,et al.(1991)sequences of proteins of immunological interest,fifth edition,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242)或(见下表1)：
50.其中在本发明描述中，互补决定区(cdr)的氨基酸序列的界定采用kabat系统。
51.表1
[0052][0053]
可变区中较保守的部分称为构架区(framework regions，fr)。抗体重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等，nih publ.no.91-3242，卷1，647-669页(1991))。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，adcc)或补体介导毒性(complement-dependent cytotoxicity，cdc)。
[0054]
本发明的抗体通常可以通过以下方法来制备：
[0055]
首先，将含有编码本发明的抗体的基因插入到含有合适的表达调控序列的表达载体中。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制基因表达的序列。表达调控序列包括与目标基因操作性相连的启动子和终止信号。编码本发明抗体的基因(dna)序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的蛋白质序列人工合成或用pcr法扩增得到。其后可用本领域熟知的方法将合成或pcr扩增得到的dna片段插入到合适的表达载体中。
[0056]
本发明中所用的表达载体可以是本领域技术人员已知的市售表达载体，如invitrogen公司的pcdna3.1表达载体或自制载体如公司的pqy系列载体。
[0057]
用于接纳表达载体转化的合适宿主细胞一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在本发明中，较佳的宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是中华仓鼠卵巢(cho)细胞如cho-s。
[0058]
表达载体转化的宿主细胞在合适的条件下(如以无血清培养基在细胞培养瓶或生
物反应器中贴壁或悬浮培养)培养后，收获培养上清液，然后用包括protein-a亲和层析、离子交换层析、过滤除菌等本领域技术人员熟知的常规分离步骤或手段纯化得到本发明的抗体。纯化得到的本发明抗体可以溶于适当的溶剂如无菌生理盐水液体中，溶度可以制备成0.01至100mg/ml之间，理想的最终溶度可以制备成1至20mg/ml之间。
[0059]
该类抗体或或其衍生体可作为药物成分，单独使用或与在研发的或已上市的其他药物如抗pd-1抗体、抗pdl1抗体、抗ctla-4抗体、抗41bb抗体、抗ox40抗体、抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd24抗体、抗cd27抗体、抗cd28抗体、抗cd33抗体、抗cd38抗体、抗cd40抗体、抗cd47抗体、抗btla抗体、抗egfr抗体、抗her2抗体、抗vista抗体、抗vegf抗体、抗vegfr抗体等药物联合使用，用于治疗包括肿瘤在内的多种疾病。
[0060]
其中在本发明中，特别描述了该类抗体或其衍生体与抗pd-1单抗合联合给药，用于在tigit/pd-1双人源化小鼠(human pd-1and human tigit double gene knock-in mice)体内测试其药物活性及其结果(见实施例10)；测试结果表明，本发明中的抗tigit抗体，无论是单独给药或者是抗pd-1单抗联合给药，均表现出明显的抗肿瘤疗效。
[0061]
为获得可高亲和力结合人tigit抗原并拮抗抑制tigit与其配体cd155结合的鼠源单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，本发明选取哺乳动物表达的重组人tigit胞膜外蛋白为免疫抗原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌抗tigit蛋白的多克隆抗体；再从中挑取含高效价抗体的小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人tigit蛋白的抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中经elisa、免疫印迹、免疫组化及体外与tigit配体竞争结合等多种方法鉴定，获得一代号为m33d2(简称33d2)的小鼠杂交瘤细胞株亚克隆，其所分泌的单克隆抗体不但能够高亲和力特异结合人tigit蛋白，而且可阻断抑制tigit蛋白与其配体(如cd155,cd112)结合。
[0062]
本发明通过基因工程等手段获得了编码该鼠源抗体重链可变区及轻链可变区的基因片断，在此基础上对该抗体进行了人鼠嵌合及人源化基因工程改造。编码人鼠嵌合抗(c33d2)体或人源化抗体(h33d2)的基因经转染进入中华仓鼠卵巢(cho)细胞，获得稳定分泌表达该人鼠嵌合或人源化抗体的重组工程细胞，并从重组工程细胞培养液中分离纯化获得到具有拮抗tigit生物活性的人鼠嵌合及人源化抗体。
[0063]
该抗tigit抗体，作为单药或与在研发的或已上市的其他药物如抗pd-1抗体、抗pdl1抗体、抗ctla-4抗体、抗41bb抗体、抗ox40抗体、抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd24抗体、抗cd27抗体、抗cd28抗体、抗cd33抗体、抗cd38抗体、抗cd40抗体、抗cd47抗体、抗btla抗体、抗egfr抗体、抗her2抗体、抗vista抗体、抗vegf抗体、抗vegfr抗体等药物联合使用，用于治疗包括肿瘤在内的多种疾病。
附图说明
[0064]
图1为本发明实施例1中人tigit蛋白与小鼠tigit蛋白的氨基酸序列比对分析示意图。
[0065]
图2为本发明实施例1中以重组人tigit胞膜外蛋白包被96-孔板，通过间接elisa(in-direct elisa)法检测免疫后小鼠血清中抗tigit抗体的效价结果示意图。
[0066]
图3a为本发明实施例1中以重组人tigit胞膜外蛋白包被96-孔板，通过间接elisa
peptide)，以方框下划线粗体标注的氨基酸序列为tigit蛋白的跨细胞膜区域(transmembrane domain)。如图1所示：人tigit蛋白与小鼠tigit蛋白的氨基酸序列同源性仅有60％左右；其中在直接参与识别及结合其配体(cd155或cd112)的胞膜外区域,人tigit蛋白和小鼠tigit蛋白的氨基酸差异位点数也有30多个。因此推测，如采用传统的抗原蛋白免疫小鼠及杂交瘤制备技术，应可以制备出鼠抗人tigit单克隆抗体。
[0085]
2)分泌抗tigit抗体的小鼠杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定
[0086]
步骤1.重组人tigit蛋白(免疫抗原)的来源与动物免疫
[0087]
在本实施例中，用于免疫的抗原为由哺乳动物表达的c-端带组氨酸(histidine)-标签的重组人tigit胞膜外蛋白(tigit-his,sino biologicals北京义翘神州公司产品，产品编号10917-h08h)。该重组人tigit-his蛋白与弗氏完全佐剂(美国sigma公司产品)混合后，于皮下多点注射balb/c小鼠(100μl/只，每次10μg tigit-his蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射含人tigit-his蛋白与弗氏不完全佐剂(美国sigma公司产品)的混合物，加强免疫3-4次后，取少量小鼠血清，用包被重组人tigit-his蛋白的96-板以elisa法检测小鼠血清中抗tigit抗体的效价(见图2)，取效价高者小鼠的脾细胞用于下一步的细胞融合。
[0088]
步骤2、细胞融合
[0089]
在末次免疫后3-4天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与小鼠sp2/0骨髓瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心)，以5：1或10：1的比例在50％peg-1000(美国sigma公司产品)作用下融合。融合按常规法(kohler g.and milstein c:nature 1975；256:495-497),peg用量1ml，60秒内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的rpmi-1640培养基终止反应，1000rpm离心10min,去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10％hat(h为次黄嘌呤、a氨基碟呤、t胸腺嘧啶核苷，为美国sigma公司产品)的rpmi 1640-10％fcs培养基将细胞浓度调节至1х106/ml，加入96孔平底细胞培养板(每孔200μl)，于37℃，5％co2培养箱中(美国thermo公司产品)培养2-3周。
[0090]
步骤3、酶联免疫吸附试验(elisa)筛选抗体分泌阳性的小鼠杂交瘤细胞
[0091]
同样，以重组人tigit-his蛋白(2μg/ml，ph 9.6，0.1m nahco3液)包被96-孔酶标板，37℃包被2小时后，再加入2％牛血清白蛋白(bsa)4℃封闭过夜。次日，包被板经pbs-0.1％tween20液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清液(以未融合的sp2/0骨髓瘤细培养上清为阴性对照)37℃孵育2小时；经pbs-0.1％tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶hrp-标记的羊抗小鼠igg(美国sigma公司产品)，37℃孵育1小时；再经pbs-0.1％tween20液充分洗涤后，加入邻苯二胺(opd)-0.1％h2o2底物液显色10-15min后再加入0.1m hcl终止反应。其后在mk3-multiskan酶标仪(美国thermo scientific公司产品)中读取492nm处od值。测得的od 492值比阴性对照值高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。
[0092]
其中图3a为elisa筛选结果阳性的11株小鼠杂交瘤细胞培养上清液复测结果。
[0093]
步骤4、阳性杂交瘤细胞的亚克隆-有限稀释法
[0094]
将上述初筛得到的阳性杂交瘤细胞以rpmi-1640-10％fcs培养基稀释至每孔1-10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37℃，5％co2培养箱中培养2-3周。待克隆长成，取上清液以elisa再次检测鉴定抗tigit抗体。
[0095]
其中图3b为以elisa法检测亚克隆细胞株上清的代表性结果：其中代号为33-d2，
33-f3，33-f6及33-f7的33号杂交瘤的各亚克隆上清液样品和代号为188-2-d7的杂交瘤亚克隆清均含高滴度的抗tigit抗体。
[0096]
步骤5、杂交瘤亚克隆在无血清培养基下扩大培养及上清中抗体的分离纯化
[0097]
在本实施例中，将上述代号为33d2的杂交瘤细胞株亚克隆及代号为188-2-d7的杂交瘤细胞株亚克隆改用无血清培养基进行扩大培养，各收集约1l杂交瘤上清后用protein g sepharose(ge公司产品)进行抗体蛋白纯化(方法参考说明书)；纯化后的抗体蛋白进行sds-page(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)分析。
[0098]
图4为纯化获得的鼠源33d2抗体蛋白样品经dtt还原(dtt-denatured)的sds-page分析图谱。如图4所示：还原后的抗体蛋白样品呈现两个条带：其中位于上端的为抗体重链，位于下端的为抗体轻链。
[0099]
实施例2 elisa法检测分析鼠源单抗与tigit及免疫相关其他蛋白的结合
[0100]
采用elisa法比较分析了纯化的鼠源33d2单抗、188-2-d7单抗与tigit及其他相关蛋白的结合活性。
[0101]
该elisa法检测基本步骤如下：将纯化的鼠源33d2单抗、188-2-d7单抗稀释至1μg/ml，分别加入到预包被了重组tigit-his蛋白或免疫相关其他基因-fc融合蛋白(包括cd28、b7-1、ctla4、cd3、pd-1、pd1h(pd2)、pd-l1、pd-l2等12种抗原，各抗原包被浓度均为2μg/ml)的96孔板中，经37℃孵育1h及洗涤后，96孔板各孔再加入hrp-标记的山羊抗鼠igg(美国jackson公司产品)，再经37℃孵育1h及洗涤后，各孔加入opd底物显色。
[0102]
表2为该elisa法检测分析纯化的33d2单抗、188-2-d7单抗与tigit及免疫相关其他蛋白结合的代表性结果(od at 492nm)：
[0103]
表2鼠源33d2单抗与tigit及免疫相关其他蛋白的结合(od at 495nm)
[0104][0105]
图5为根据表2的elisa法检测分析结果(od at 495nm)所作的直条图：结果显示，33d2单抗及188-2-d7单抗均仅特异结合人tigit蛋白，与免疫相关其他蛋白如pd-1、cd28、b7、ctla-4、cd3、pd-l1、pd-l2等均无明显结合。
[0106]
实施例3流式细胞仪(flow-cytometry)检测分析鼠源抗体与转染表达人tigit基因的cho细胞(cho/tigit)结合
[0107]
在本实施例中，以鼠源杂交瘤细胞株33d2上清为一抗，以fitc荧光标记的羊抗小鼠igg为二抗，采用流式细胞仪检测分析鼠源33d2单抗样品与稳定表达人tigit基因的cho细胞(cho/tigit)结合。为此,将cho/tigit细胞分别与含小鼠igg(阴性对照样品,isotype control)、鼠源33d2上清液及tigit抗原免疫小鼠阳性血清(阳性对照样品immu.sera，1:200稀释)；4℃孵育30min及经pbs-1％bsa液洗涤后，加入fitc-标记的羊抗小鼠igg(sigma公司产品)；4℃孵育30min及再经pbs-1％bsa液洗涤后，将样品上样至biosciences accuri c6流式细胞仪检测(美国bd公司)。
[0108]
图6为该流式细胞仪检测代表性结果示意图。如图6所示：与小鼠igg阴性对照样品
相比(isotype control)，tigit免疫小鼠阳性血清阳性样品(immu.sera)及测试样品33d2单抗上清(33d2)均可特异与cho/tigit细胞结合；33d2单抗样品的结合强度与阳性血清对照样品相近。
[0109]
实施例4流式细胞仪检测鼠源抗体与tigit人源化小鼠的外周血淋巴细胞的结合
[0110]
在本实施例中，采取human tigit gene knock-in小鼠外周血(该tigit人源化小鼠来自于百奥赛图生物公司)，分离获得淋巴细胞，再以鼠源33d2上清为一抗，fitc标记的polyclonal rabbit anti-mouse igg为二抗(同时加入pe标记的anti-mouse cd3e以标记t淋巴细胞)，采用流式细胞仪检测分析33d2单抗样品与人源化tigit小鼠中tigit蛋白的结合。
[0111]
具体方法如下：
[0112]
1)预先在ep管内加入100μl的抗凝剂，分别取c57/b6野生型小鼠和human tigit gene knock-in小鼠尾静脉采血约150μl，混匀；加入溶血素(bd公司)，室温避光作用10min；离心弃上清，将tigit人源化小鼠样本平均分为三份，离心；其中两管分别做fitc单阳管和pe单阳管，一管为检测管。
[0113]
2)弃上清，pe单阳管加稀释液；fitc单阳管和其他检测管加抗tigit mab33-d2杂交瘤上清，500μl/孔，4℃作用30min。1500rpm，离心5min；弃上清，用1％bsa洗涤一次；其中fitc单阳管加入fitc标记的polyclonal rabbit anti-mouse igg，pe单阳管加入pe标记的anti-mouse cd3e(1:25),检测管加入pe标记的anti-mouse cd3e和fitc标记的polyclonal rabbit anti-mouse igg，100μl/孔，4℃作用30min。1500rpm，离心5min，用1％bsa洗涤一次，用150ul 1％bsa重悬细胞，将样品上样至biosciences accuric6流式细胞仪检测(美国bd公司)。
[0114]
图7为该流式细胞仪检测代表性结果示意图。如图7所示：33d2单抗样品能够与human tigit gene knock-in小鼠淋巴细胞特异结合，而不与c57/b6野生型小鼠淋巴细胞结合。
[0115]
实施例5竞争性elisa法检测单抗拮抗阻断tigit蛋白与其受体的结合
[0116]
体外检测抗tigit单抗的生物活性方法之一是采用竞争性elisa法检测其是否拮抗阻断tigit蛋白与其受体如cd155(pvr)的结合。
[0117]
其中，该竞争性elisa法检测的具体步骤如下：
[0118]
1)用重组人tigit-his胞膜外蛋白(北京义翘神州公司产品)包被96-孔板(包被溶度：2μg/ml，50μl/孔)，4℃过夜；
[0119]
2)经pbs液漂洗及5％牛奶(稀释在pbs-0.1％tween20液中)室温封闭后，分别加入含固定溶度的生物素标记的cd155(pvr)-fc蛋白(acro biosystems公司产品)与不同溶度的33d2抗体，或非相关的抗体(如抗vegf单抗hpv19)，37℃孵育1h；
[0120]
3)经pbs-t洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的avidin(1：5000)，37℃孵育1h；
[0121]
4)经pbs-t洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3％双氧水，室温5-10min至显色；
[0122]
5)加入1m hcl终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值。
[0123]
表3及图8为该竞争elisa法检测单抗样品拮抗阻断tigit蛋白与其受体cd155的结的代表性结果。
[0124]
表3体外竞争elisa法检测结果
[0125][0126][0127]
图8为根据表3的竞争elisa法检测结果(od at 495nm)使用作图软件(originpro 9.0)所作的拟合线图。
[0128]
如图8所示:在加入不同浓度的33d2单抗(33d2-sample#2,33d2-sample#4)与固定浓度的生物素标记的cd155-fc蛋白的样品中，各孔显色反应od值与加入的抗体蛋白量成反比关系：即加入的33d2单抗量越高，其显色od值越低；而非相关单抗样品(hpv19，抗vegf单抗)的加入量多少对各孔od值影响不大。此结果表明，33d2单抗体外可拮抗阻断tigit与其受体(cd155)结合，根据拟合线图测得其平均半数抑制浓度(ic
50
值)在0.13μg/ml(换算成摩尔浓度,其ic
50
均值为0.867nm),具体结果见表4。
[0129]
表4半数抑制浓度(ic
50
值)
[0130]
sample idic50(μg/ml)ic50(nm)33d2-sample#20.1350.90033d2-sample#40.1250.833average0.1300.867
[0131]
实施例6.鼠源33d2抗体可变区编码基因的克隆
[0132]
在此，先从小鼠33d2杂交瘤细胞中提取出总rna中，再以该rna为模板，采用简并引物(degenerate primers)，以reverse transcription-polymerase chain reaction(rt-pcr)法(wang y等：degenerated primer design to amplify the heavy chain variable region from immunoglobulin cdna。bmc bioinformatics.2006；7 suppl(4):s9)分别克隆扩增获得m33-d2抗体重链可变区及轻链可变区的cdna基因片段。其中cdna基因克隆步骤如下：
[0133]
步骤1、采用rna提取试剂(rnaiso plus，takara公司产品)从小鼠m33d2杂交瘤细胞中提取出总rna；
[0134]
步骤2、采用逆转录pcr(rt-pcr)方法在eppendorf管获得cdna模板。
[0135]
其中用于鼠源33d2抗体轻链可变区逆转录pcr引物(33-d2-l)序列为：tgt cgt tca ctg cca tca at(seq id no.:1)
[0136]
用于鼠源33d2抗体重链可变区逆转录pcr引物(33-d2-h)序列为：gca agg ctt aca acc aca atc(seq id no.:2)；
[0137]
rt-pcr反应体系如下：
[0138][0139]
于42℃温度下反应1小时，随后温度升至70℃，15分钟灭活后将获得的cdna置于-20℃，保存备用。
[0140]
步骤3、鼠源33d2抗体轻链可变区及重链可变区基因的pcr克隆扩增
[0141]
用于克隆扩增该33d2抗体轻链可变区基因的一对引物为：
[0142]
正向引物：gac atc cag atg a(seq id no.:3)
[0143]
反向引物：ctg agg cac ctc cag atg tt(seq id no.:4)
[0144]
而用于克隆扩增33-d2抗体重链可变区基因的一对引物为：
[0145]
正向引物：gtg cag tct gga cct ga(seq id no.:5)
[0146]
反向引物：gtg ctg gag ggg aca gtc act(seq id no.:6)
[0147]
pcr扩增得到的dna产物在1.5％agarose胶中电泳分析。电泳结束后，将分离的dna条带切下并分别进行测序获得抗体轻链及重链可变区dna的核苷酸序列。测得的该鼠源抗体轻链可变区dna的核苷酸序列见seq id no.:7，由该dna核苷酸序列推测得到的抗体轻链可变区氨基酸序列见seq id no.:8。该轻链抗原互补决定区(complementarity-determining regions，cdr)的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列分别见seq id no.:9、seq id no.:10和seq id no.:11。
[0148]
测得的该鼠源抗体重链可变区dna的核苷酸序列见seq id no.:12，由该dna的核苷酸序列推测得到的抗体重链可变区氨基酸序列见seq id no.:13。该重链抗原互补决定区的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列分别见seq id no.:14、seq id no.:15和seq id no.:16。
[0149]
实施例7鼠源33d2抗体的人-鼠嵌合抗体(c33d2)的构建
[0150]
将实施例6中克隆扩增获得的鼠源33d2抗体轻链可变区基因和重链可变区基因分
region)内处于第228点位的氨基酸由原有的proline替换成serline(s228p)。经此基因工程系列改造，最后成功获得含人源化重链编码可变区、人igg4-重链恒定区(s228p)的全长h33d2抗体重链。其中人源化h33d2抗体重链可变区的氨基酸序列见seq id no.:19,其核苷酸序列为seq id no.：20所示。
[0162]
实施例9分泌表达人源化33d2抗体的细胞工程株的建立及抗体蛋白的分离纯化
[0163]
将实施例8含人源化重链基因(h33d2-h)、人源化轻链基因(h33d2-l)分步克隆到pqy-hygro表达载体，转入大肠杆菌后扩增分离获得表达人源化33d2抗体的重组质粒。其后将重组质粒分别瞬时转染cho-s细胞。转染48小时后，吸取孔内细胞培养上清，以tigit-his蛋白为包被抗原，hrp酶标记的goat-anti-human-igg为检测二抗(购自上海西塘生物公司)，opd为显色底物，以直接elisa法检测转染细胞上清中抗体与人tigit抗原结合的活性。
[0164]
下表6为该elisa代表性检测结果。
[0165]
表6 elisa分析瞬时转染cho细胞培养上清与人tigit蛋白的结合
[0166][0167][0168]
图9为根据表6的elisa法分析结果(od at 492nm)使用作图软件(originpro 9.0)所作的拟合线图，结果显示人源化h33d2抗体(igg4-kappa)可特异与人tigit蛋白结合，且其结合活性(或亲和力)与人-鼠嵌合型c33d2抗体相近似。
[0169]
上述转染细胞经克隆筛选及无血清培养基悬浮培养驯化后，成功获得多个稳定高效分泌表达人源化h33d2抗体蛋白的cho细胞工程株。
[0170]
其后，从中选取一细胞工程株再经无血清培养基放大扩增培养后，收集培养上清液，上清液经离心及0.45μm滤膜过滤后，上样至包括含protein a亲合层析柱(proteina-sepharose fast flow，美国通用电气ge公司)、离子交换析柱、病毒去除/灭活、及过滤除菌(0.22μm滤膜过滤)在内的多个分离纯化步骤后，最终获得高纯度(蛋白纯度达99％以上)的人源化抗体(h33d2)。纯化的人源化抗体(h33d2)再溶于无菌生理盐水中低温(-20℃以下)保存。
[0171]
实施例10抗体亲和动力学检测
[0172]
采用生物传感器(蛋白质相互作用仪：fortebio-octet red96,pall公司产品)实时监测与测定了纯化的人源化33d2单抗与tigit抗原结合的亲和力与动力学曲线。该检测方法及结果如下：
[0173]
1.生物传感器及实验材料溶液配制
[0174]
生物传感器芯片：表面用anti-human fab-ch1 2nd generation抗体(fab2g，fortebio公司产品，产品编号1802083)包被。
[0175]
其中实验材料溶液配制：
[0176]
1.1.kb buffer：0.1％bsa 0.05％tween 20以ph7.2的商品化pbs溶解。
[0177]
1.2.抗体工作溶液：人源化33d2单抗样品用kb buffer配制成10μg/ml。
[0178]
1.3.抗原工作溶液：重组人tigit-his蛋白(北京义翘神州公司产品，产品编号10917-h08h)用kb buffer配制成100nm、25nm、6.25nm 3个梯度。
[0179]
2.检测方法及步骤
[0180]
2.1.打开fortebio仪器及相关软件，选择advance kientics实验模式；
[0181]
2.2.分析程序按下表7进行
[0182]
表7
[0183]
assay stepassay time(s)samplebaseline60kb bufferloading400mab 33-d2baseline60kb bufferassociation400tigit-hisdissociation600kb buffer
[0184]
3.实验结果
[0185]
图10为人源化33d2单抗与tigit抗原结合结合解离动态结果曲线；0s到400s表示结合，400s到1000s表示解离，三条曲线从上到下分别表示人源化33d2单抗与100nm，25nm和12.5nm浓度的tigit-his结合的曲线。表8为亲和动力学检测常数：结果显示人源化33d2单抗与tigit具有较高的亲和力，结合亲和力(binding affinity)常数为0.843nm。
[0186]
表8单抗亲和动力学检测结果(monovalent binding)
[0187][0188]
(表8表示在global的模式下计算出来的结合解离的数值和亲和力的数值，kd表示亲和力的数值，kon表示结合的数值，kdis表示解离的数值，r2表示拟合曲线与结合解离曲线之间的相关系数,该数值越接近1表示拟合计算出来的结果越接近真实的结果)
[0189]
实施例11 tigit/pd-1双人源化小鼠(human pd-1and human tigit double gene knock-in mice)体内测试抗tigit单抗的抗肿瘤疗效
[0190]
由于33d2单抗不识别小鼠tigit，故无法在一般的普通小鼠体内直接测试该单抗的疗效。为此，在本实施例中，特别选用表达cd155基因的小鼠结肠癌细胞(mc38-cd155)在
基因工程改造过的tigit/pd-1双人源化小鼠进行体内测试鼠抗人tigit单抗33d2，作为单药，或者与鼠抗人pd-1单抗hab21(思坦维公司自研产品)联合给药的抗肿瘤疗效的系列研究。
[0191]
该动物试验研究分两阶段，其中第一阶段的试验模型、给药分组及试验结果描述如下：
[0192]
第一阶段研究：
[0193]
动物试验模型及给药分组：
[0194]
将数量为1x106的表达cd155基因的mc38-cd155结肠癌细胞(mc38结肠癌细胞由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，来源于c57bl/6小鼠，)接种于基因背景同样为c57bl/6的tigit/pd-1双人源化纯合子小鼠右侧背部皮下(该小鼠品系简称hpdcd1/htigit，由南京大学模式动物研究所提供，其通过cas9方式利用基因同源重组，分别将人的pd-1基因及tigit基因相应替换到小鼠内源pd-1基因及内源tigit基因位置，从而表达人pd-1基因及人tigit基因而非小鼠pd-1基因及小鼠tigit基因)；待接种的肿瘤体积长至约米粒大小(约50-70mm3，肿瘤细胞接种后第5-6天左右)时将动物随机分为4实验组(如下表9)：
[0195]
表9实验分组
[0196][0197]
动物自分组当天起(即接种肿瘤后第5-6天)，每周腹腔注射(i.p.)给药2次(每隔3-4天给药1次)，共给药4次(连续给药2周)。期间每天观察动物一般临床症状，每隔3-4天测量肿瘤长径(mm)和短径(mm)及动物体重。
[0198]
肿瘤体积计算公式为：体积(mm3)＝长径(mm)x短径(mm)x短径(mm)x0.5。如测量时肿瘤体积超过4000mm3则对测试动物实行安乐死(euthanized)。
[0199]
动物试验结果：
[0200]
该试验结果汇总见下表10，表11a-11d，图11a-11d及图12a和图12b。
[0201]
图11a-11d则分别为各给药组每只个体动物体内肿瘤增长体积趋势图。
[0202]
图12a为各组试验动物肿瘤的平均增长体积趋势。
[0203]
图12b为各组试验动物平均体重增长趋势。
[0204]
表10实验结果
[0205][0206]
表11a实验a组(生理盐水阴性对照组)结果
[0207][0208]
*:numbers in()are days after received 1
st treatment
[0209]
表11b实验b组(anti-pd-1单抗治疗组)结果
[0210][0211]
*:numbers in()are days after received 1
st treatment
[0212]
表11c实验c组(anti-tigit单抗治疗组)结果
[0213][0214]
*:numbers in()are days after received 1
st treatment
[0215]
#:mean
±
se(without c01 animal,n＝5)
[0216]
表11d实验d组(anti-pd-1单抗与anti-tigit单抗联合给药组)结果
[0217]
group d:tumor volume(mm3)in tigit&pd1 double gene knock-in mice treated with anti-pd1 mab(1mg/kg)and anti-tigit mab(1mg/kg),n＝6)
[0218][0219]
*:numbers in()are days after received 1
st treatment
[0220]
如上表11a-11d，图11a-11d实验结果所示：生理盐水阴性治疗对照组(a组)肿瘤快速增长，没有观察到测试动物有肿瘤萎缩或被彻底排斥(complete rejection cr:0/6)；而pd-单抗治疗组(b组)、tigit单抗治疗组(c组)、pd-1单抗与tigit单抗联合给药组(d组)在给药后5-8天肿瘤增长即受到抑制，肿瘤出现萎缩或彻底消失。
[0221]
pd-单抗治疗组的结果与预期的一致，所有测试动物在给药2-3次后(即首次给药后第11-13天)肿瘤全部出现萎缩或彻底被排斥(complete rejection:6/6)，停止给药后整个实验期间未再见肿瘤复发(最长已观察到接种肿瘤后的第76天)；而更惊奇的及令人鼓舞是在tigit单抗治疗组，除1只小鼠(动物编号c01)肿瘤增长未受到抑制，其余5只小鼠(6/6)在仅给药2-3次后(即首次给药后第11-13天)肿瘤也全部出现萎缩或被彻底排斥(complete rejection:5/6)，且停止给药后整个实验期间也未再见肿瘤复发(最长已观察到接种肿瘤后的第76天)；pd-1单抗与tigit单抗联合治疗组在各自剂量减半(1mg/kg)的情况下，所有测试动物的仅给药2-3次后(即首次给药后第11-13天)肿瘤也全部萎缩或被彻底排斥(complete rejection:6/6),停止给药后整个实验期间未再见肿瘤复发(最长已观察到接种肿瘤后的第76天)；。
[0222]
图12a为各组试验动物肿瘤实验期间的平均增长体积趋势。
[0223]
图12b则为各组试验动物实验期间平均体重增长趋势。
[0224]
如图12b所示，与对照组相比，tigit单抗无论是单独给药还是与pd-单抗联合给药
后，实验期间对测试动物体重增均长无明显影响。