类风湿性关节炎的血清学诊断方法与流程

类风湿性关节炎的血清学诊断方法
1.本技术是国际申请日2015年4月22日、国际申请号pct/ep2015/058738于2016年11月4日进入中国国家阶段、申请号201580023645.x、发明名称“类风湿性关节炎的血清学诊断方法”的申请的分案申请。
技术领域
2.本发明处于诊断方法的领域。它提供了类风湿性关节炎的新标记抗体以及检测类风湿性关节炎的新方法。它还提供了预测受试者是否会发展类风湿性关节炎的手段和方法。本发明是基于类风湿性关节炎患者在他们的循环中具有与瓜氨酸化抗体特异性反应的抗体这一发现。


背景技术：

3.血清学诊断性检验在类风湿性关节炎(ra)的早期检测和辩别中具有日益增长的重要性。除传统的类风湿因子检测之外，瓜氨酸化抗原的新的特异性自身抗体已经为ra的诊断做出了重大贡献[26]。
[0004]
类风湿因子是自身抗体，其可以是igm、igg或iga，并且在1922年被首次提到[1]。它识别人类igg的fc片段的ch2和ch3域并且是由美国风湿病学会(american college of rheumatology)出版的ra分类标准的组分[2]。
[0005]
类风湿因子(rf)可以通过各种试验方法测定；elisa(酶联免疫吸附分析法)和比浊法是标准化方法。rf检测的平均特异性约79％，灵敏度约60％[3]。近年来，在ra患者的血清中已经检测并表征出新的自身抗体。它们表现出更高的特异性并因此能有助于改进血清学诊断性检验。
[0006]
近年来风湿病学中最重要的血清学发现之一是针对瓜氨酸化聚角蛋白微丝蛋白(filaggrin)的自身抗体的表征[4]。该发现的起点是抗角蛋白抗体(aka)的靶抗原的鉴定。这些在1979年首次描述并且对ra是高度特异性的[4]。
[0007]
所述靶抗原聚角蛋白微丝蛋白只在上皮细胞中表达而在关节或其他器官不表达，因此这种发现的致病意义最初是不清晰的。schellekens等[6]表明aka只识别聚角蛋白微丝蛋白的瓜氨酸化形式。
[0008]
聚角蛋白微丝蛋白可以通过精氨酸残基的酶脱亚胺(deimination)而瓜氨酸化，以产生瓜氨酸残基。瓜氨酸化是一种翻译后修饰，其改变蛋白质的电荷，导致它三维结构的变化，后者又导致抗原性性质的变化[7]。瓜氨酸化在细胞分化和细胞程序性死亡(凋亡)中具有必要的生理和生化作用。
[0009]
检测抗瓜氨酸化聚角蛋白微丝蛋白抗体的第一代elisa显示对ra的特异性约85％，灵敏度65％至70％。第二代elisa使用合成肽作为抗原，所述合成肽由于分子内二硫键形成而有环状结构。使用这些环状的瓜氨酸化肽(ccp)将特异性改善到96％和98％之间，灵敏度不变[8]。
[0010]
几项研究现在已经表明，抗ccp抗体不仅是高度特异性的，而且对于所述疾病的侵
蚀过程有高度预测价值并因此具有预后价值[9]。
[0011]
关于纤维蛋白和纤维蛋白原的瓜氨酸化肽的研究现在已经表明了聚角蛋白微丝蛋白和瓜氨酸化纤维蛋白之间的交叉反应[12]。一些出版物已经发现对于在ra患者中检测抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体的高度诊断特异性和灵敏度[13]。与elisa一起，对于ra的灵敏度约75％，特异性为98％。
[0012]
另一种感兴趣的瓜氨酸化自体抗原是α
‑
烯醇酶的瓜氨酸化形式，所述酶在糖酵解中发挥作用[15]。瓜氨酸化α
‑
烯醇酶已经在类风湿性关节炎患者的滑膜组织中与其他瓜氨酸化抗原一起检测出[16]。
[0013]
瓜氨酸化波形蛋白已被描述为在滑膜组织中表达的相关自身抗原。随后，阐明了瓜氨酸化波形蛋白与以前已知的抗原sa一致，sa代表savoie，即首次鉴定出相应自身抗体应答的患者的名字。对于类风湿性关节炎患者，抗sa抗体提供了>98％的高特异性，但灵敏度有限，22％至40％[17]。
[0014]
一段时间以来，基于突变型瓜氨酸化波形蛋白(mcv)的elisa已经可商购用于诊断类风湿性关节炎，并且具有与抗ccp抗体大致相同的诊断灵敏度和特异性[18，19，20]。
[0015]
还描述了在ra患者的血清中出现针对氨甲酰化蛋白(包含高瓜氨酸残基的蛋白)的抗体(28，29)。发现高瓜氨酸在类风湿结节中与瓜氨酸一起存在(28)，并发现针对氨甲酰化蛋白的抗体预测关节损伤(29)。
[0016]
最近已经开发了两种用于ra早期检测的血清学现场检验(point of care test)(poct)。rheuma
‑
chec检验(orgentec，mainz，德国)结合了两种用于诊断ra的生物标志物—类风湿因子和mcv抗体。ccp抗体用ccpoint分析法(euro
‑
diagnostica，瑞典)检测[25]。所述检验只需要一滴全血并且任何全科医生都可以在几分钟内施行它们。
[0017]
尽管有上述进步，但仍有改进类风湿性关节炎现有的血清学检验的空间，特别是在灵敏度、特异性和易于操作方面。


技术实现要素：

[0018]
现在已经意外地发现，类风湿性关节炎(ra)患者产生针对瓜氨酸化抗体的抗体。这允许制造各种形式的新的诊断性检验。
[0019]
本发明因此涉及包含瓜氨酸残基的抗体。本发明还涉及这样的抗体的诊断性应用，例如作为抗原来测定ra患者或倾向于发展ra的受试者的循环中抗瓜氨酸化抗体(aca)的存在。本发明因此还涉及预测受试者是否已经或将发展ra的方法。
附图说明
[0020]
图1：elisa分析法结果。来自正常对照受试者(n＝7)和没有类风湿因子的ra患者(n＝7)的血清在elisa分析法中以1:100稀释度用固定化的瓜氨酸化兔igg抗体作为抗原进行检验。
具体实施方式
[0021]
我们发现类风湿性关节炎(ra)患者产生抗体，所述抗体特异性针对包含瓜氨酸或高瓜氨酸残基的抗体。这些抗体在本文中将被称为瓜氨酸化抗体。
[0022]
我们以两种方式制备瓜氨酸化抗体。第一，我们通过将家兔igg的纯化制品进行用肽酰精氨酸脱亚胺酶(pad，ec 3.5.3.15)处理来制备瓜氨酸化抗体。这种酶催化蛋白质结合型精氨酸转化成瓜氨酸[27]。我们还通过化学氨甲酰化制备了瓜氨酸化抗体。在这种方法中，抗体中存在的赖氨酸残基转化为高瓜氨酸残基。我们由此得到瓜氨酸化兔igg抗体(实施例1和2)。
[0023]
如本文中定义，术语“抗体”用来指称能够与通常称为抗原的靶化合物特异性结合的特异性结合分子，例如蛋白质、或其部分。
[0024]
这样的特异性结合分子的优选实例是多肽或蛋白或其部分，例如单链可变片段(scfv)、抗原结合片段区(fab)、单域抗体(sdab)亦称vhh抗体、纳米抗体(骆驼来源的单域抗体)、或称为vnar的鲨鱼ignar来源的单域抗体片段、或其其他活性组分例如蛋白质适配体。在一种替代实施方式中，特异性结合分子是包含抗体的抗原结合域的融合蛋白。
[0025]
在功能型语言中，术语“抗体”是指能够与经常被称为“抗原”的靶分子特异性结合的蛋白质或多肽。抗体(亦称免疫球蛋白)优选是在脊椎动物的血液或其他体液中发现并被免疫系统用于识别和中和外来物例如细菌和病毒的γ球蛋白。
[0026]
天然存在的人类抗体通常由各自具有两个大的重链和两个小的轻链的基本结构单元构成，形成例如，具有一个单元的单体、具有两个单元的二聚体或具有五个单元的五聚体。
[0027]
抗体由一种称为b细胞的白细胞产生。有几种不同类型的抗体重链、和几种不同种类的抗体，所述抗体基于它们拥有的重链而分为不同的同种型。已知五种不同的抗体同种型在哺乳动物中执行不同的作用，并帮助对于它们遇到的各种不同类型的外来物引导适当的免疫应答。一些动物物种例如骆驼(例如美洲驼)和鲨鱼可具有异常的抗体结构。
[0028]
虽然所有抗体的一般结构很相似，但在蛋白质末端的小区域是极为可变的，使得存在数百万具有稍有不同的末端结构的抗体。这个区域被称为高变区。这些变体各自可以与称为抗原的不同的靶结合。这种巨大的抗体多样性允许免疫系统识别同等广泛的抗原多样性。所述抗原被抗体识别的独特部分称作表位。这些表位与它们的抗体以高度特异性相互作用结合，所述相互作用使得抗体在构成生物体的数百万不同分子当中只识别和结合它们的独特抗原。抗原被抗体识别标示了它以便被免疫系统的其他部分攻击。抗体也可以直接中和靶，例如，通过与病原体造成感染所需要的部分结合。
[0029]
庞大并且多样的抗体种群通过编码不同抗原结合位点(或互补位)的一组基因片段随机组合而产生，之后在所述抗体基因的这个区域中随机突变，产生进一步的多样性。抗体基因也在称为类别转换的过程中再组织，将重链的碱基改变为另一种碱基，产生保留了所述抗原特异性可变区的不同的抗体同种型。这使得单种抗体以多个不同的同种型被免疫系统的几个不同部分使用。
[0030]
因此，术语“抗体”用在本文中时明确地包括单链抗体、抗原结合片段区、重组产生的抗体、单克隆抗体、纳米抗体、单域抗体等等。
[0031]
术语“或其部分”在抗体或其他特异性结合分子的环境中意味着是指构成所述抗体或特异性结合分子的特异性结合部位的所述抗体或特异性结合分子的部分，并且可以解释为仍然能够与同衍生出所述片段的整个抗体或特异性结合分子相同的表位反应的抗体或特异性结合分子的部分。
[0032]
所有种类的特异性结合分子及其衍生物例如抗体、包含抗体的特异性结合域的融合蛋白、抗体片段、单域抗体片段、其他蛋白质结合域例如抗转运蛋白(anticalin)、和特异性结合瓜氨酸化表位的小分子可用于本发明。
[0033]
术语“与瓜氨酸化表位特异性反应的抗体”等应被解释为在较大的结构例如多肽或肽或肽核酸或蛋白质适配体或肽模拟结构的环境中与瓜氨酸残基或高瓜氨酸残基特异性反应但是不与其中瓜氨酸残基被精氨酸残基置换的类似结构反应的抗体。
[0034]
瓜氨酸是在翻译期间不纳入蛋白质中的氨基酸，然而，它可以通过精氨酸残基被肽酰精氨酸脱亚胺酶(pad)的翻译后修饰而产生。
[0035]
瓜氨酸化是精氨酸残基的翻译后转化为瓜氨酸残基，其是由肽酰精氨酸脱亚胺酶(pad)催化的。肽酰精氨酸脱亚胺酶(pad；ec 3.5.3.15)催化蛋白质中的精氨酸残基转化为瓜氨酸残基。瓜氨酸的trna不存在，蛋白质中瓜氨酸残基的存在唯一是翻译后修饰的结果。在哺乳动物(人类、小鼠和大鼠)中，已经鉴定了五种pad同种型(pad1
–
pad6；
‘
pad4’和
‘
pad5’用于相同的同种型)，各自由不同的基因编码(vossenaar等，bioessays 25，1106
‑
1118，2003)。所有这些酶在活性上强烈依赖于ca2 的存在并且不能将游离的l
‑
精氨酸转化为游离的l
‑
瓜氨酸。游离的l
‑
精氨酸可以通过真核生物中的一氧化氮合酶(ec1.14.13.39)或通过细菌中的精氨酸脱亚胺酶(ec 3.5.3.6)转化为游离的l
‑
瓜氨酸。这些酶不是ca2 依赖性的。微生物pad酶是优选的。来自牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)和禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的pad酶是特别优选的。这样的酶已有描述在异源表达系统例如黑曲霉(aspergillus niger)(ep 2032697 a1)中表达。
[0036]
高度同源的pad酶之间最明显的差异是它们的组织特异性表达。在表皮中，pad1(同义词:pad i，i型pad)在角化细胞分化的最终阶段期间参与角蛋白丝的瓜氨酸化，这对角化包膜的再组织是重要的。表皮中瓜氨酸化的另一个部位是毛囊，其含有pad3(同义词pad iii，iii型pad)和它的天然底物毛透明蛋白(thh)。thh是毛囊的内根鞘细胞和髓质层的主要结构蛋白并且，在较低的程度上，是其他特化上皮细胞的主要结构蛋白。最近鉴定的pad同种型，pad6(同义词：epad)，是在小鼠卵母细胞的胞质板(cytoplasmic sheet)中发现的，胞质板在早期胚胎发生中起重要作用。它的人类直系同源的表达发现限于卵巢、精巢和外周血白细胞(chavanas等，gene vol 330；19
‑
27，2004)。最初，这种pad同种型被命名为epad，但基于其他pad的系统性编号，这种同种型改名为pad6(vossenaar等，bioessays vol 25 1106
‑
1118，2003)。最广泛表达的同种型，pad2(同义词pad ii，ii型pad，pad
‑
h19)，存在于许多不同组织如骨骼肌、脑、脾、分泌腺和巨噬细胞中。尽管这种广泛的表达模式，但只有髓鞘碱性蛋白(mbp)和波形蛋白已被鉴定为天然底物。在多发性硬化(ms)中，患者发展出针对mbp的自身免疫应答。mbp是丰富的髓鞘蛋白质，并且它在中枢神经系统发育期间发生瓜氨酸化。在人类和小鼠巨噬细胞的钙离子载体诱导的凋亡期间观察到波形蛋白的瓜氨酸化，并且如上所述，瓜氨酸化的波形蛋白被表明是ra特异性抗sa自身抗体的靶。与上文论述的pad全部都主要定位在细胞的胞质中相反，pad4同种型(同义词：pad iv，iv型pad，hl
‑
60pad，pad v，v型pad，padi4)定位在细胞核中。pad4的核定位信号在所述蛋白质的n端区域中发现。pad4主要在外周血粒细胞和单核细胞中表达。pad4在细胞核中的底物是组蛋白核心蛋白(h2a、h3和h4)和核磷蛋白/b23，后者是在核糖体装配、核质运输和中心体复制中起作用的核仁蛋白质。
[0037]
瓜氨酸化免疫球蛋白或抗体也可以通过将赖氨酸残基转化为高瓜氨酸残基而化学上得到。这种方法经常被称为氨甲酰化(实施例2)。
[0038]
如实施例1或2中所述的瓜氨酸化抗体被固定在固体载体上，并且在如实施例3中制备的elisa分析法中测定得自ra患者的血样是否含有与瓜氨酸化抗体上的瓜氨酸化表位特异性反应的抗体。
[0039]
我们发现，来自ra患者的血清含有与瓜氨酸化抗体特异性反应的抗体，特别是igg。为此目的，我们选择了7名在他们的血清中不含类风湿因子的ra患者。当在实施例3的elisa分析法中检验得自这些患者的血清时，7名患者中的六名(86％)显示具有针对瓜氨酸化igg的循环抗体(图1)。这6名患者没有针对非瓜氨酸化igg的抗体，并且在7个随机选择的正常人血清中也没有发现抗瓜氨酸化抗体(aca)抗体。
[0040]
我们得出结论，瓜氨酸化抗体是检测ra特异性自身抗体的有用试剂。在一个方面，本发明因此涉及包含瓜氨酸残基的抗体。
[0041]
这样的抗体可以得自如上所述的任何物种。优选所述抗体是脊椎动物抗体，例如哺乳动物抗体，例如兔、小鼠或大鼠抗体，更加优选igg抗体、其fab片段或纳米抗体。瓜氨酸化人igg抗体也可以使用，然而，在某些分析法形式中，这不是优选的。例如，瓜氨酸化人igg抗体可以在如本文中所述的间接elisa分析法中通过与用于检测aca抗体的标记的抗人igg抗体交叉反应而引起非特异性背景反应。
[0042]
此外，本发明涉及检测来自受试者的样品中类风湿性关节炎特异性抗体的方法，其中使所述样品与瓜氨酸化抗体接触并且其中测定所述样品是否包含与所述瓜氨酸化抗体特异性反应的抗体。
[0043]
用在本文中时，术语“与...特异性反应”是指其中来自ra个体的第一抗体与第二抗体上存在的瓜氨酸化表位反应而当所述表位中的瓜氨酸残基被精氨酸残基置换时所述第一抗体不与所述第二抗体反应的免疫反应。
[0044]
如本文中所述的aca的特异反应性不应该与类风湿因子(rf)混淆。类风湿因子(rf)是针对igg的fc部分的自身抗体。rf和igg可以结合起来形成促成疾病过程的免疫复合物。类风湿因子也可以是冷球蛋白(在血样冷却时沉淀的抗体)；它可以是单克隆或多克隆igm。罕见发现其他同种型，例如iga、igg、ige和igd。然而，因为rf在正常、非瓜氨酸化抗体和瓜氨酸化抗体之间不能辨别，所以类风湿因子不与aca特异性反应。此外，rf针对igg，而aca针对每种同种型的瓜氨酸化抗体。
[0045]
在优选的本发明方法中，要注意rf不干扰分析的结果。这可以用技术人员已知的众多方式进行。
[0046]
在本发明方法中rf的干扰可以例如通过进行对照来防止，所述对照检测抗体非特异性针对瓜氨酸化表位的结合。所述对照值然后可以从如上所述的方法中得到的值中减去。
[0047]
在另一种实施方式中，可以避免rf与所述瓜氨酸化抗体结合。例如，所述方法中使用的瓜氨酸化抗体可以用它不与rf反应这样的方式来选择。这可以例如通过使用缺乏所述igg分子的fc部分的瓜氨酸化fab片段来实现。在一种替代实施方式中，所述瓜氨酸化抗体可以是igm、iga、ige或igd同种型。
[0048]
在另一种替代安排中，所述瓜氨酸化抗体可以是非人类来源的，例如重组抗体，例
如单域抗体。
[0049]
用在本文中时，术语“单域抗体”是指含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能性质的抗体衍生蛋白质。该技术最初在发现骆驼科(骆驼和美洲驼)拥有缺乏轻链的全功能抗体之后开发的。这些重链抗体含有单个可变域(vhh)和两个恒定域(ch2和ch3)。重要的是，所述克隆和分离的vhh域是完全稳定的多肽，其怀有原始重链抗体的全部抗原结合能力。
[0050]
单域抗体(sdab，也被开发者ablynx称为纳米抗体)是由单个单体可变抗体域组成的抗体片段。像完整抗体一样，它能够选择性地与特异性抗原结合。只有12
–
15kda的分子量，单域抗体比由两个重蛋白链和两个轻链组成的普通抗体(150
–
160kda)小得多，甚至比fab片段(～50kda，一个轻链和半个重链)和单链可变片段(～25kda，两个可变域，一个来自轻链和一个来自重链)更小。
[0051]
软骨鱼也具有重链抗体(ignar，
‘
免疫球蛋白新抗原受体’)，从其可以得到称为vnar片段的单域抗体。另一种途径是将来自哺乳动物例如兔、小鼠、大鼠或人类的普通免疫球蛋白g(igg)的二聚体可变域分裂成单体。虽然大多数从事单域抗体的研究目前是基于重链可变域，但源自于轻链的纳米抗体也已经显示出与靶表位特异性结合。
[0052]
单域抗体是长约110个氨基酸的肽链，包含重链抗体、或普通igg的一个可变域(vh)。这些肽具有与完整抗体相似的对抗原的亲合力，但更耐热并且对清洁剂和高浓度尿素稳定。源自于骆驼和鱼抗体的那些单域抗体由于它们的互补决定区3(cdr)形成伸长的覆盖正常与轻链结合的亲脂性部位的环，所以有较低的亲脂性并且更可溶于水。与普通抗体相反，一些单域抗体耐热高达90摄氏度。
[0053]
在另一种替代实施方式中，来自受试者的待检验样品可以耗尽rf，或rf可以在检验之前失活。为此目的，特异性igm阻滞剂是可商购的。技术人员能充分意识到可以使用多种多样的方法来防止rf对本公开方法的干扰。
[0054]
在这样的方法的优选实施方式中，所述瓜氨酸化抗体被固定在固体载体上。有许多方式来执行这样的方法，并且技术人员能充分意识到各种固体载体，所述载体全部具有它们特定的优点和缺点。所述固体载体可以有利地选自玻璃、硝化纤维素、聚苯乙烯、纸或任何其他种类的可商购载体。在特别优选的实施方式中，所述固体载体是聚苯乙烯，例如elisa板。在另一种优选实施方式中，本发明涉及以elisa分析法形式执行的方法。
[0055]
ra患者产生针对瓜氨酸化抗体的抗体(aca)这一发现，允许我们制备具有超过现有技术中描述的分析法的特定优点的分析法形式。
[0056]
在根据本发明优选实施方式的方法中，瓜氨酸化抗体附着于红血细胞。这可以通过红血细胞与有随机特异性的瓜氨酸化抗体、例如igg抗体或任何其他同种型的抗体一起温育来实行。它也可以用特定的方式来实行，即通过使用与红血细胞的细胞外表面的组分特异性反应的瓜氨酸化抗体。
[0057]
例如，我们制备了针对红血细胞的细胞外表面的组分——血型糖蛋白a的瓜氨酸化抗体。实施例1显示了所述抗体和它利用pad瓜氨酸化的准确细节。
[0058]
术语“红血细胞的细胞外表面的组分”在本文中用于指示在红血细胞外侧表达的抗原决定簇。目前有超过300个红血细胞表面抗原决定簇被国际输血协会(international society of blood transfusion)识别。它们中的大部分属于29个血型系统之一(daniels，
g.，isbt science series，1：3
–
8(2006))。mns抗原系统是基于4号染色体上的两个基因(血型糖蛋白a和血型糖蛋白b)的人类血型系统。
[0059]
供选和/或优选的细胞外表面组分在daniels(同前)的表1中列出，并包括尿素通道蛋白(ut)
‑
b、水通道蛋白1、水通道蛋白3、cd233、cd241、cd240d、cd240ce、xk蛋白、cd234、cd329、cd242、ermap、cd147、cd47、cd55、cd59、cd35、cd44、cd99、cd108、cd151、乙酰胆固醇酶、cd238、cd297、cd236c、cd236d、cd235a和cd235b。
[0060]
血型糖蛋白a(gypa)和b(gypb)是其中优选的，并且是携带m、n和ss血型的抗原决定簇的人类红细胞膜的主要唾液酸糖蛋白。除了在所有群体中普遍存在的m或n和s或s抗原之外，还已经鉴定了约40种相关变体表现型。这些变体包括所有miltenberger复合体的变体和sta的几种同种型；还有，dantu、sat、he、mg、以及缺失变体ena、s
‑
s
‑
u
‑
和mk。所述变体的大多数是gypa和gypb之间基因重组的结果。[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？db＝gene&cmd＝showdetailview&te rmtosearch＝2993]
[0061]
针对人类血型糖蛋白a的抗体可购自，例如，biolegend(http://www.biolegend.com/pacific
‑
blue
‑
anti
‑
human
‑
cd235a
‑
glycophorin
‑
a
‑
antibody
‑
7880.html)；abcam，cambridge，uk；或antibodies online，abin337240，针对glyca的n端部分的兔多克隆igg抗体。血型糖蛋白a特异性的纳米抗体也已有描述(30)。
[0062]
根据实施例1中概括的程序得到的瓜氨酸化血型糖蛋白a抗体允许我们利用血凝分析法形式(实施例4)来测定从ra患者得到的样品中针对瓜氨酸化抗原的抗体(aca)的存在。
[0063]
在它的实施方式之一中，本发明因此涉及如上所述的方法，其中在血凝分析法中发生所述检测。
[0064]
更详细地说，本发明涉及如上所述的方法，其包括以下步骤：a)提供瓜氨酸化抗体，b)提供来自受试者的包含抗体的样品，c)提供红血细胞，d)使所述瓜氨酸化抗体与所述样品和所述红血细胞接触，和e)检测所述红血细胞是否发生凝集，其中凝集表明所述样品中存在对类风湿性关节炎特异性的抗瓜氨酸化抗体。
[0065]
上述方法的步骤d)不应该如此狭窄地解读为所述瓜氨酸化抗体与所述样品和所述红血细胞的接触必需应该同时实行。如果所述瓜氨酸化抗体首先与所述红血细胞接触并且只在其后与含有针对瓜氨酸化抗体的抗体(aca)的样品接触，所述方法也工作得很好。然而，从使用效率的视角来看，优选所述接触同时或大致同时发生。
[0066]
在这种语境下的术语“大致同时”意味着间隔小于5分钟，例如小于4分钟、或3、2或甚至1分钟。
[0067]
在另一种优选实施方式中，本发明涉及其中使用自体红血细胞的凝集分析法。换句话说，本发明涉及如上所述的方法，其中步骤b)中的抗体和步骤c)中的红血细胞被包含在同一样品中。在另一种优选实施方式中，所述红血细胞来自于受试者。
[0068]
我们开发了这样的自体凝集分析法并检验来自上述7名ra患者的样品，所述自体凝集分析法的结果证实了用所述elisa分析法得到的结果(表1)。
[0069]
表1：7个ra血清的自体凝集分析法
[0070] 阳性阴性类风湿性关节炎61
正常对照07
[0071]
我们发现超过80％的类风湿性关节炎患者具有在他们的血液中循环的aca。检验的对照患者无一具有这样的抗体。我们得出结论，aca是可靠的并且非常灵敏和特异性的ra标记抗体。
[0072]
不希望受理论约束，我们认为所述瓜氨酸化glyca抗体用瓜氨酸化表位覆盖红血细胞，从而使得所述红血细胞成为存在于ra患者的血清和血液中的aca的靶。当aca抗体存在时，所述红血细胞将会凝集。在自体凝集分析法中，所述ra患者的红血细胞变得被瓜氨酸化表位覆盖，并且如果血液中存在aca的话，所述患者自己的抗体将引起所述红血细胞凝集。
[0073]
在前瞻性研究中，我们发现没有类风湿性关节炎的临床征象、但将要在10年时间内发展类风湿性关节炎的许多受试者，也在循环中具有aca。我们得出结论，aca是预后ra的标记物。
[0074]
实施例
[0075]
实施例1：瓜氨酸化igg的制备
[0076]
兔igg(25ug)，由兔骨骼肌pad(75mu；sigma
‑
aldrich；ec3.5.3.15)在脱亚胺缓冲液(40mm tris
‑
hcl，ph 7.5，5mm cacl2和1mm dtt)中体外瓜氨酸化并在37℃温育3h。所述反应通过添加ph 8.0的egta到50mm的浓度而停止。在针对有2mm edta的10mm tris ph7.6透析过夜之后，得到瓜氨酸化兔igg。
[0077]
得自abcam，uk的山羊血型糖蛋白a抗体(25ug)，由兔骨骼肌pad(75mu；sigma
‑
aldrich；ec 3.5.3.15)在脱亚胺缓冲液(40mm tris
‑
hcl，ph 7.5，5mm cacl2和1mm dtt)中体外瓜氨酸化并在37℃温育3h。所述反应通过添加ph 8.0的egta到50mm的浓度而停止。在针对有2mm edta的10mm tris ph 7.6透析过夜之后，得到瓜氨酸化山羊igg。
[0078]
另一种血型糖蛋白a抗体得自santa cruz biotechnology。r10sc
‑
53905是针对血型糖蛋白a的细胞外结构域的单克隆igg1小鼠抗体。这种抗体由兔骨骼肌pad(75mu；sigma
‑
aldrich；ec 3.5.3.15)在脱亚胺缓冲液(40mm tris
‑
hcl，ph 7.5，5mm cacl2和1mm dtt)中体外瓜氨酸化并在37℃温育3h。所述反应通过添加ph 8.0的egta到50mm的浓度而停止。在针对有2mm edta的10mm tris ph 7.6透析过夜之后，得到瓜氨酸化小鼠igg。
[0079]
平行温育不添加pad酶的物种匹配的igg制品充当阴性对照。
[0080]
实施例2：氨甲酰化igg的制备
[0081]
通过将溶解在1ml pbs中的1.18mg兔igg与1ml在0.1m na2hpo4缓冲液中的0.2m kcno一起在37摄氏度温育三小时，得到氨甲酰化igg。氨甲酰化igg然后在4摄氏度下针对0.9％nacl透析过夜并在4摄氏度储存直到使用。这种igg用作elisa分析法中的抗原用于检测ra患者血清中的抗瓜氨酸化抗体。非氨甲酰化igg在其中用作对照。
[0082]
实施例3：用瓜氨酸化抗体的elisa
[0083]
如下建立检测针对瓜氨酸化抗体的抗体的elisa分析法。如上所述制备的瓜氨酸化igg通过在37摄氏度下温育50微升/孔的100微克/毫升瓜氨酸化igg过夜，固定在nunc elisa板上。剩余的结合位点通过向所述微量滴定板的每个孔添加50微升在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的100微克/毫升牛血清清蛋白(bsa)并在37摄氏度温育1小时进行阻断。所述板然后用pbs 0.05％tween 20(pbs/tween)洗涤3次，并且如果不立即使用的话，在4摄氏度下
干燥储存。
[0084]
对照板以完全相同的方式制备，只是所述对照板含有固定于所述固相上的来自物种匹配对照的非瓜氨酸化抗体。
[0085]
来自已知类风湿因子阴性的ra患者的人血清的连续稀释液(1/10至1/100.000)用于研究针对瓜氨酸化igg的抗体的存在。五十微升的各连续稀释液填充到所述微量滴定板的孔中并在37摄氏度温育3小时。用pbs/tween洗涤3次之后，添加50微升的兔辣根过氧化物酶标记的抗人igg在pbs中1:1000的稀释液并在37摄氏度温育2小时。用pbs/tween洗涤3次之后，向各孔添加100微升的tmb并将所述板在黑暗中在37摄氏度下温育30分钟。所述反应通过向各孔添加50微升2m h2so4而停止，并用titertek多重扫描仪(flow laboratories，irvine uk)读出在450nm处的吸光度。
[0086]
用瓜氨酸化兔igg得到的代表性结果在图1中显示。如上所述的其他瓜氨酸化免疫球蛋白产生可比的结果。
[0087]
实施例4：血凝分析法
[0088]
在玻璃盖玻片上通过将50微升患者血液或对照血液与50微升有或者没有20微克/毫升瓜氨酸化血型糖蛋白a抗体并含有0.1％bsa的pbs混合，执行自体凝集试验。所述混合物在所述玻璃表面上展开成直径约1厘米的圆，并在2分钟后视觉评价凝集。
[0089]
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