一种检测SARS-CoV-2与其D614G突变株的引物组合及其应用的制作方法

一种检测sars
‑
cov
‑
2与其d614g突变株的引物组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域中，一种检测sars
‑
cov
‑
2与其d614g突变株的引物组合及其应用。


背景技术：

2.冠状病毒(hcov)主要引起呼吸道和胃肠道感染，基因上主要分为四个属：α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。目前已经确定了六种感染人的冠状病毒包括α冠状病毒属的hcov
‑
nl63和hcov
‑
229e及β冠状病毒属的hcov
‑ꢀ
oc43、hcov
‑
hku1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars
‑
cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(mers
‑
cov)。2020年2月11日，世界卫生组织(who)将2019新型冠状病毒命名为covid
‑
19，国际病毒分类委员会(ictv)将其命名为严重急性呼吸综合证冠状病毒 2(sars
‑
cov
‑
2)。sars
‑
cov
‑
2是人类历史上确定的第七种可感染人的hcov，其全基因组与sars
‑
cov的序列同源性达76％，相较而言，与其它5种冠状病毒序列差异更大。
3.自新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2在世界各地迅速大面积蔓延，并逐渐出现变种，传染性强，危害严重。d614g突变是指sars
‑
cov
‑
2的s蛋白上的第614氨基酸位点d(天冬氨酸)突变为g(甘氨酸)。携带d614g突变的毒株早期占全球新冠病毒测序序列不到10％。经过4个多月的扩散传播，成为病毒传播的主要基因型。
4.疫情大面积爆发时，能够对感染者或携带者快速准确检测诊断对于疫情防控具有至关重要的作用及意义，能够对确诊病例感染的sars
‑
cov
‑
2进一步分型更有助于分析对比病理特征及追溯感染源。核酸检测是判定sars
‑
cov
‑
2的金标准。目前运用最多的检测方法是实时荧光rt
‑
pcr法。目前检测sars
‑
cov
‑
2的pcr检测试剂盒在实际应用过程中出现了大量的假阴性和大量复阳的情况，且每日处理的样本能力有限，不利于临床快速准确大规模的进行病例筛查；对样本要求较高，临床上出院的标准要求进行三次核酸检测均为阴性；与其他感染人的冠状病毒序列相似，目的基因及特异性序列的选定没有参考其他冠状病毒序列进行特异性甄选，引物探针检测的灵敏度和准确性都有待提高；只能对病例进行确诊，不能对确诊病例所感染的sars
‑
cov
‑
2进行进一步分型。
5.因此，迫切需要一种特异性高、灵敏度高、高通量且操作相对简单的低成本的检测方法来对新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2检测鉴定与分型。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是如何检测新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2，并进一步如何检测d614g突变株，d614g突变株为s基因中编码其第614位天冬氨酸的密码子由“gat”突变为甘氨酸的密码子“ggt”的sars
‑
cov
‑
2。
7.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合(记为引物组合1)，所述引物组合1由名称分别为orf1b
‑
p、n1
‑
p、n2
‑
p、s
‑
p和s(d614g)
‑
p的引物对与名称分别为orf1b
‑
t、n1
‑
t、n2
‑
t、s
‑
t和s(d614g)
‑
t的mpe引物组成；
8.所述orf1b
‑
p由名称分别为orf1b
‑
f和orf1b
‑
r的单链dna组成，所述orf1b
‑
f 和所述orf1b
‑
r的序列分别为序列1和2；
9.所述n1
‑
p由名称分别为n1
‑
f和n1
‑
r的单链dna组成，所述n1
‑
f和所述n1
‑
r 的序列分别为序列4和5；
10.所述n2
‑
p由名称分别为n2
‑
f和n2
‑
r的单链dna组成，所述n2
‑
f和所述n2
‑
r 的序列分别为序列7和8；
11.所述s
‑
p由名称分别为s
‑
f和s
‑
r的单链dna组成，所述s
‑
f和所述s
‑
r的序列分别为序列10和11；
12.所述s(d614g)
‑
p由名称分别为s(d614g)
‑
f和s(d614g)
‑
r的单链dna组成，所述s(d614g)
‑
f和所述s(d614g)
‑
r的序列分别为序列13和14；
13.所述orf1b
‑
t为序列表中序列3所示的单链dna；
14.所述n1
‑
t为序列表中序列6所示的单链dna；
15.所述n2
‑
t为序列表中序列9所示的单链dna；
16.所述s
‑
t为序列表中序列12所示的单链dna；
17.所述s(d614g)
‑
t为序列表中序列15所示的单链dna。
18.所述引物组合1中，所述orf1b
‑
f、所述orf1b
‑
r、所述n1
‑
f、所述n1
‑
r、所述 n2
‑
f、所述n2
‑
r、所述s
‑
f、所述s
‑
r、所述s(d614g)
‑
f、所述s(d614g)
‑
r的摩尔数均可相等。
19.所述引物组合1中，orf1b
‑
t、n1
‑
t、n2
‑
t、s
‑
t和s(d614g)
‑
t的摩尔比可为 13.07：8.72：11.09：9.99：11.99。
20.所述引物组合1可具有如下任一用途：
21.x1、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2；
22.x2、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2产品；
23.x3、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2；
24.x4、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2产品；
25.x5、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
26.x6、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
27.x7、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
28.x8、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
29.x9、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变；
30.x10、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变产品；
31.x11、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病；
32.x12、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病产品；
33.x13、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病；
34.x14、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病产品；
35.x15、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者；
36.x16、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者产品；
37.x17、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者；
38.x18、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者产品。
39.本发明还提供了另一种引物组合(记为引物组合2)，所述引物组合2由名称为 s
(d614g)
‑
p的引物对与名称为s(d614g)
‑
t的mpe引物组成；
40.所述s(d614g)
‑
p由名称分别为s(d614g)
‑
f和s(d614g)
‑
r的单链dna组成，所述s(d614g)
‑
f和所述s(d614g)
‑
r的序列分别为序列13和14；
41.所述s(d614g)
‑
t为序列表中序列15所示的单链dna。
42.所述引物组合2中，所述s(d614g)
‑
f、所述s(d614g)
‑
r的摩尔数均可相等。
43.所述引物组合2具有如下任一用途：
44.y1、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
45.y2、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
46.y3、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
47.y4、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
48.y5、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变；
49.y6、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变产品；
50.y7、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病；
51.y8、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病产品；
52.y9、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者；
53.y10、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者产品。
54.本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述引物组合1或引物组合2。
55.所述试剂盒还可含有进行pcr扩增所需的其他试剂和/或进行质量延伸所需的其他试剂。
56.所述进行pcr扩增所需的其他试剂和所述进行质量延伸所需的其他试剂均可为snp分型试剂盒(qt
‑
sj09
‑
snps)(融智生物科技(青岛)有限公司)中试剂，如a1 组分：pcr预混液、sap酶、sap缓冲液、mpe酶、mpe缓冲液、e
–
ddntpmix、基质液、树脂、oligoplate。
57.所述试剂盒可具有如下任一用途：
58.x1、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2；
59.x2、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2产品；
60.x3、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2；
61.x4、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2产品；
62.x5、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
63.x6、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
64.x7、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
65.x8、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
66.x9、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变；
67.x10、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变产品；
68.x11、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病；
69.x12、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病产品；
70.x13、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病；
71.x14、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病产品；
72.x15、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者；
73.x16、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者产品；
74.x17、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者；
75.x18、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者产品。
76.所述引物组合1或引物组合2的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
77.x1、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2；
78.x2、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2产品；
79.x3、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2；
80.x4、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2产品；
81.x5、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
82.x6、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
83.x7、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
84.x8、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
85.x9、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变；
86.x10、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变产品；
87.x11、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病；
88.x12、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病产品；
89.x13、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病；
90.x14、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病产品；
91.x15、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者；
92.x16、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者产品；
93.x17、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者；
94.x18、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者产品。
95.所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
96.x1、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2；
97.x2、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2产品；
98.x3、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2；
99.x4、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2产品；
100.x5、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
101.x6、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
102.x7、检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株；
103.x8、制备检测或辅助检测待测样本是否含有sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株产品；
104.x9、检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变；
105.x10、制备检测或辅助检测sars
‑
cov
‑
2是否发生d614g突变产品；
106.x11、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病；
107.x12、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2所致疾病产品；
108.x13、诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病；
109.x14、制备诊断或辅助诊断sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株所致疾病产品；
110.x15、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者；
111.x16、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2感染患者产品；
112.x17、筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者；
113.x18、制备筛查或辅助筛查sars
‑
cov
‑
2的d614g突变株感染患者产品。
114.本发明将多重pcr与maldi
‑
tofms方法相结合，获得了一组可以检测sars
‑ꢀ
cov
–
2及其d614g突变株的引物组合，该引物组合检测新型冠状病毒的特异性强，灵敏度高，样本检出限为1
‑
10拷贝数/反应，与其他6种感染人的冠状病毒不发生交叉反应，可以显著减少假阴性结果。本发明对样本要求少，检测成本低，可同时对上百份样本同时检测，实现短时间内高通量检测。此外还可对确诊病例感染的sars
‑ꢀ
cov
‑
2进一步分型，有助于分析对比病理特征及追溯感染源。本发明的引物组合可用于大规模快速体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本中的新型冠状病毒基因，具有很好的应用前景。
具体实施方式
115.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
116.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna的3
′
末端核苷酸。
117.snp分型试剂盒(qt
‑
sj09
‑
snps):融智生物科技(青岛)有限公司，该试剂盒含有如下试剂：
[0118][0119]
实施例1、检测新型冠状病毒的引物组合的制备
[0120]
1、引物组合的制备
[0121]
本实施例制备了检测新型冠状病毒的引物组合，该引物组合其由名称分别为 orf1b
‑
p、n1
‑
p、n2
‑
p、s
‑
p和s(d614g)
‑
p的引物对与名称分别为orf1b
‑
t、n1
‑
t、 n2
‑
t、s
‑
t和s(d614g)
‑
t的mpe引物组成。orf1b
‑
p由名称分别为orf1b
‑
f和 orf1b
‑
r的单链dna组成，其序列分别为序列1和2；n1
‑
p由名称分别为n1
‑
f和n1
‑ꢀ
r的单链dna组成，其序列分别为序列4和5；n2
‑
p由名称分别为n2
‑
f和n2
‑
r的单链dna组成，其序列分别为序列7和8；s
‑
p由名称分
别为s
‑
f和s
‑
r的单链dna组成，其序列分别为序列10和11；s(d614g)
‑
p由名称分别为s(d614g)
‑
f和 s(d614g)
‑
r的单链dna组成，其序列分别为序列13和14；orf1b
‑
t、n1
‑
t、n2
‑
t、 s
‑
t和s(d614g)
‑
t的序列分别为序列3、6、9、12、15。各引物序列信息如表1所示。
[0122]
该引物组合中，orf1b
‑
f、orf1b
‑
r、n1
‑
f、n1
‑
r、n2
‑
f、n2
‑
r、s
‑
f、s
‑
r、 s(d614g)
‑
f、s(d614g)
‑
r的摩尔数均相等；
[0123]
orf1b
‑
t、n1
‑
t、n2
‑
t、s
‑
t和s(d614g)
‑
t的摩尔比为13.07：8.72：11.09： 9.99：11.99。
[0124]
表1、引物组合信息
[0125][0126]
表1中，s(d614g)为s基因中编码其第614位天冬氨酸的密码子由“gat”突变为甘氨酸的密码子“ggt”，含有该突变的sars
‑
cov
‑
2为d614g突变株。
[0127]
mpe引物分子量与mpe产物分子量的理论值如表2所示，在实际检测过程中质量上会有
±
2da左右的偏差。
[0128]
表2、mpe引物分子量与mpe产物分子量的理论值
[0129]
[0130][0131]
2、重组质粒的制备
[0132]
构建hcov
‑
229e、hcov
‑
oc43、hcov
‑
nl63、hcov
‑
hku1、sars
‑
cov、mers
‑
cov、 sars
‑
cov
‑
2的dna片段的重组质粒，其中hcov
‑
hku1由于种内保守序列突变位点相对较多所以根据突变频率选择合成了两种质粒分别为puc57
‑
hcov
‑
hku1
‑
1和puc57
‑ꢀ
hcov
‑
hku1
‑
2。
[0133]
构建含有sars
‑
cov
‑
2的dna片段的重组质粒puc57
‑
sars
‑
cov
‑
2，puc57
‑
sars
‑ꢀ
cov
‑
2为将puc57质粒的saci与sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列16 所示的dna片段得到的重组质粒。
[0134]
构建含有hcov
‑
229e的dna片段的重组质粒puc57
‑
hcov
‑
229e，puc57
‑
hcov
‑ꢀ
229e为将puc57质粒的bamhi与sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列17 所示的dna片段得到的重组质粒。
[0135]
构建含有hcov
‑
oc43的dna片段的重组质粒puc57
‑
hcov
‑
oc43，puc57
‑
hcov
‑ꢀ
oc43为将puc57质粒的xbai与sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列18 所示的dna片段得到的重组质粒。
[0136]
构建含有hcov
‑
nl63的dna片段的重组质粒puc57
‑
hcov
‑
nl63，puc57
‑
hcov
‑ꢀ
nl63为将puc57质粒的bamhi与sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列19 所示的dna片段得到的重组质粒。
[0137]
构建puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
1，puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
1为将puc57质粒的xbai与 sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列20所示的dna片段得到的重组质粒。
[0138]
构建puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
2，puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
2为将puc57质粒的bamhi与 sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列21所示的dna片段得到的重组质粒。
[0139]
构建含有sars
–
cov的dna片段的重组质粒puc57
‑
sars
–
cov，puc57
‑
sars
–
cov为将puc57质粒的bamhi与sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列22 所示的dna片段得到的重组质粒。
[0140]
构建含有mers
‑
cov的dna片段的重组质粒，puc57
‑
mers
‑
cov为将puc57质粒的 bamhi与sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列23所示的dna片段得到的重组质粒。
[0141]
实施例2、利用实施例1的引物组合检测新型冠状病毒的方法建立
[0142]
检测实施例1的引物组合的扩增效率，采用snp分型试剂盒(qt
‑
sj09
‑
snps)进行，步骤如下：
[0143]
1、制备引物混合液
[0144]
制备引物混合液：利用无rna酶去离子水溶解实施例1的引物对orf1b
‑
p、n1
‑ꢀ
p、n2
‑
p、s
‑
p和s(d614g)
‑
p，得到引物混合液，该引物混合液中，orf1b
‑
f、orf1b
‑ꢀ
r、n1
‑
f、n1
‑
r、n2
‑
f、n2
‑
r、s
‑
f、s
‑
r、s(d614g)
‑
f和s(d614g)
‑
r的浓度均为 0.5μm。
[0145]
2、多重pcr扩增
[0146]
利用步骤1的引物混合液进行多重pcr扩增，dna模板为实施例1的puc57
‑
sars
‑
cov
‑ꢀ
2，体系如下：
[0147]
组分体积/μlpcr预混液2去离子水1引物混合液1dna模板(浓度为102copies/μl)1总计5
[0148]
利用rnase
‑
free ddh2o替换dna模板，作为阴性对照。每种体系设置两个重复。
[0149]
将所得体系于如下条件中进行多重pcr扩增，得到多重pcr产物：95℃15min； 95℃15s，59℃30s，72℃30s，30个循环；60℃10min；4℃保持。
[0150]
3、sap消化
[0151]
反应体系向步骤2的多重pcr产物中加入如下组分：
[0152]
组分体积/μl去离子水1.53sap缓冲液0.17sap酶0.3总计2
[0153]
将所得反应体系在如下条件下进行反应，得到sap消化产物：37℃40min；85℃5min；4℃保持。
[0154]
4、质量延伸(mpe)
[0155]
反应体系向步骤3的sap消化产物中加入如下组分：
[0156]
组分体积/μle
‑
ddntpmix1mep缓冲液1.4mep酶0.6mpe引物1总计4
[0157]
mpe引物为orf1b
‑
t、n1
‑
t、n2
‑
t、s
‑
t和s(d614g)
‑
t，orf1b
‑
t、n1
‑
t、n2
‑
t、 s
‑
t与s(d614g)
‑
t在体系中的浓度分别为13.07μm、8.72μm、11.09μm、9.99μ m、11.99μm。将所得反应体系在如下条件下进行反应，得到质量延伸产物：
[0158][0159]
5、树脂除盐
[0160]
①
步骤4反应结束后，在每个反应孔中加入14μl rnase
‑
free ddh2o。
[0161]
②
把装有树脂的八连排管轻轻翻转过来扣在样品板上，保证树脂孔与样品的每个孔对齐。然后轻敲树脂管，使树脂落入样本板的孔中。
[0162]
③
使用掌式离心机，瞬时离心，避免树脂附着在管壁上。
[0163]
④
将带有树脂的样品板放置在翻转混匀仪中，20rpm混匀30min。
[0164]
⑤
混匀结束后，样品2000rpm离心1min，收集上清液待测。
[0165]
6、核酸质谱待测
[0166]
①
充分混合基质液，超声2min。在靶点中央点1μl基质，置于室温4
‑
5 min，自然晾干。
[0167]
②
吸取0.5μl步骤5所得上清液于基质上，干燥结晶后待测。
[0168]
③
采用quantof i质谱仪进行上机检测。每个体系都点3个靶板进行上机检测。
[0169]
上机时的相关设置及参数：
[0170]
1)仪器参数设置
[0171]
采集机型：quantof i
[0172]
采集模式：线性正离子模式
[0173]
accelerate voltage:20kv
[0174]
mass range:3000
‑
11000da
[0175]
laser frequency:3000hz
[0176]
shots/spectrum:800
[0177]
激光能量:30uj
[0178]
2)仪器分子量校准
[0179]
利用校准品(4k
‑
10kda，融智生物科技(青岛)有限公司)对仪器进行校准，该套校准品的分子量分别为4550.0da，5478.6da，6332.2da，7717.0da， 9507.2da。
[0180]
各引物均可特异性扩增，结果如表3所示。
[0181]
表3 puc57
‑
sars
‑
cov
‑
2中的5个位点的检测结果
[0182][0183]
具体的，根据实施例1的引物组合的检测结果判断待测样本是否含有sars
‑
cov
‑ꢀ
2的方法如下：
[0184]
如果n1、n2、orf1b和s基因中至少有一个基因的mpe产物信号峰信噪比大于 4，待测样本含有sars
‑
cov
‑
2，且不为d614g突变株；如果n1、n2、orf1b和s基因的mpe产物信号峰信噪比均小于等于4，待测样本不含有sars
‑
cov
‑
2。
[0185]
进一步，在待测样本含有sars
‑
cov
‑
2时，如果s(d614g)的mpe产物扩增为g，且信号峰信噪比大于4，待测样本中的sars
‑
cov
‑
2为d614g突变株。
[0186]
实施例3、实施例1的引物组合的特异性
[0187]
将实施例1的puc57
‑
sars
‑
cov
‑
2、puc57
‑
hcov
‑
229e、puc57
‑
hcov
‑
oc43、puc57
‑
hcov
‑
nl63、puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
1、puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
2、puc57
‑
sars
–
cov 和puc57
‑
mers
‑
cov分别利用rnase
‑
free ddh2o溶解，得到质粒的浓度均为105拷贝/ μl的八种质粒溶液，即puc57
‑
sars
‑
cov
‑
2溶液、puc57
‑
hcov
‑
229e溶液、puc57
‑ꢀ
hcov
‑
oc43溶液、puc57
‑
hcov
‑
nl63溶液、puc57
‑
hcov
‑
hku1
–
1溶液、puc57
‑
hcov
‑ꢀ
hku1
–
2溶液、puc57
‑
sars
–
cov溶液和puc57
‑
mers
‑
cov溶液。
[0188]
利用实施例2中2
‑
6的方法，将dna模板分别替换为上述八种质粒溶液，其他步骤均不变，检测实施例1的引物组合的特异性。
[0189]
结果如表4所示，实施例1的引物组合的特异性很好，含有其他冠状病毒片段的质粒均未扩增，sars
‑
cov
‑
2的5个目标靶点均可特异性扩增并检出，sars
‑
cov
‑
2的检测不受其他冠状病毒的干扰。
[0190]
表4 sars
‑
cov
‑
2引物组合的特异性检测
[0191]
[0192][0193]
实施例4、实施例1的引物组合的灵敏度
[0194]
将实施例1的puc57
‑
sars
‑
cov
‑
2利用rnase
‑
free ddh2o溶解，并利用rnase
‑ꢀ
free ddh2o进行稀释，得到浓度分别为100拷贝/μl、101拷贝/μl、102拷贝/μl、 103拷贝/μl、104拷贝/μl、105拷贝/μl的质粒稀释液。
[0195]
利用实施例2中2
‑
6的方法，将dna模板分别替换为上述各质粒稀释液，多重 pcr扩增的循环数设置为30、35、40、45个循环，其他步骤均不变，检测实施例1的引物组合的灵敏度。每个体系中一种质粒稀释液，每种质粒稀释液每种多重pcr循环数 2个复孔。
[0196]
检测结果显示，循环数对灵敏度没有影响。45个循环的结果如表5所示，最低检出限为10拷贝/反应。
[0197]
当所添加质粒稀释液质粒浓度为10拷贝/μl时，5个目标靶点均可全检出。
[0198]
表5 45循环数下不同浓度puc57
‑
sars
‑
cov
‑
2扩增情况
[0199]
质粒浓度(拷贝/μl)
‑
重复n1n2orf1bss(d614g)100‑
重复1无扩增无扩增无扩增无扩增无扩增100‑
重复2无扩增无扩增无扩增无扩增无扩增101‑
重复1ggaga101‑
重复2ggaga
102‑
重复1ggaga102‑
重复2ggaga103‑
重复1ggaga103‑
重复2ggaga104‑
重复1ggaga104‑
重复2ggaga105‑
重复1ggaga105‑
重复2ggaga
[0200]
实施例5、实施例1的引物组合在检测实际样本中的应用
[0201]
收集到11份疑似sars
‑
cov
–
2感染病例的咽拭子临床样本，编号分别为1
ꢀ‑
11。
[0202]
各样本经全基因组测序检测如下：8份为阴性(编号为1
‑
8)，3份为阳性(编号为9
‑
11)。3份阳性中2份进一步分型为d614g突变株(编号为9
‑
10)。
[0203]
利用实施例1的引物组合检测临床样本的具体操作步骤如下：
[0204]
1.提取各咽拭子临床样本的总rna，反转录得到cdna。
[0205]
2.利用实施例2中2
‑
6的方法，将dna模板分别替换为上述各样本的cdna，每个样本做2个平行，设置2个阴性对照(即将dna模板替换为去离子水)。
[0206]
结果如表6至表16所示：
[0207]
由表14可知，9号样本在sars
‑
cov
‑
2的n1、n2、orf1b、s、s(d614g)4 个目的基因均发生了mpe，信噪比>4，证明其为阳性样本。
[0208]
由表14可知，9号样本在s基因(含d614g突变位点)mpe结果为g，说明该阳性样本中的sars
‑
cov
‑
2为d614g突变株。
[0209]
由表15可知，10号样本在sars
‑
cov
‑
2的n1、s、s(d614g)3个目的基因均发生了mpe，证明其为阳性样本。
[0210]
由表15可知，10号样本在s基因(含d614g突变位点)mpe结果为g，说明该阳性样本中的sars
‑
cov
‑
2为d614g突变株。
[0211]
由表16可知，11号样本在sars
‑
cov
‑
2的n1、n2、orf1b 3个目的基因均发生了mpe，证明其为阳性样本。
[0212]
由表16可知，11号样本在s基因(含d614g突变位点)未发生mpe，说明该阳性样本中的sars
‑
cov
‑
2不为d614g突变株。
[0213]
由表6至表13可知，1
‑
8号临床样本在sars
‑
cov
‑
2的5个目的基因均未发生mpe，证明各样本均为阴性。
[0214]
该结果与基因测序结果相吻合。
[0215]
表6 1号临床样本检测结果
[0216][0217]
表7 2号临床样本检测结果
[0218][0219]
表8 3号临床样本检测结果
[0220][0221][0222]
表9 4号临床样本检测结果
[0223][0224]
表10 5号临床样本检测结果
[0225][0226]
表11 6号临床样本检测结果
[0227][0228]
表12 7号临床样本检测结果
[0229][0230]
表13 8号临床样本检测结果
[0231][0232]
表14 9号临床样本检测结果
[0233][0234]
表15 10号临床样本检测结果
[0235][0236][0237]
表16 11号临床样本检测结果
[0238][0239]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。