分析方法、微生物的识别方法以及检查方法与流程

1.本发明涉及分析方法、微生物的识别方法以及检查方法。


背景技术：

2.微生物的识别以及致病性、抗药性等的检查在医疗、微生物的研究等中是很重要的。在此，关于同属同种的微生物，已知在不同株的微生物中致病性、抗药性存在不同。例如，引起食物中毒的肠出血性大肠杆菌与作为健康人的肠道常驻菌存在的大肠杆菌是同属同种。这样的同属同种、但不同株的微生物的识别通常通过分解性试验等来进行，该分解性试验是在存在规定的糖的情况下培养微生物，通过显色来鉴别因糖的分解而导致的培养基的ph的变化。
3.在这种方法中，只能进行有无显色这样的二选一的判定，难以获得关于微生物的分类或性状的详细的信息。为了获得更详细的信息，需要用多种糖来进行分解性试验等，很麻烦。关于这一点，在专利文献1中，通过将对用加入了抗生素的培养基培养的微生物进行质谱分析而得到的质谱与基准质谱进行比较，来判定微生物对抗生素的抗性。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：美国专利第8293496号说明书


技术实现要素：

7.发明要解决的问题
8.优选的是，通过对利用不同的条件培养的微生物进行质谱分析，来获得更多的信息。
9.用于解决问题的方案
10.根据本发明的第一方式，分析方法包括以下步骤：准备含有微生物的试样；在第一条件下配置了所述微生物之后，对所述微生物所产生的物质进行第一质谱分析；以及，基于通过所述第一质谱分析获得的第一数据与在第二条件下配置了所述微生物之后对所述微生物所产生的物质进行第二质谱分析而获得的第二数据之间的差异、以及所述微生物的分类或性状与通过所述微生物的质谱分析获得的数据相对应的参照数据，来获得关于所述试样中含有的微生物的性状或分类的信息，其中，所述第一条件与所述第二条件中配置了所述微生物的环境中的糖的浓度或氧浓度不同。
11.根据本发明的第二方式，优选的是，在第一方式的分析方法中包括以下步骤：在所述第二条件下配置了所述微生物之后，对所述微生物所产生的物质进行所述第二质谱分析。
12.根据本发明的第三方式，优选的是，在第一方式或第二方式的分析方法中，所述第一条件与所述第二条件中所述糖的浓度不同，所述糖是从由单糖类、二糖类、三糖类以及四糖类组成的组中选择的至少一种糖类。
13.根据本发明的第四方式，优选的是，在第三方式的分析方法中，所述糖是从由阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、岩藻糖、墨角藻糖(fuculose)、鼠李糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖、脱氧核糖、景天庚酮糖、丁酮糖、赤藓酮糖、丁醛糖、赤藓糖、苏糖、丙酮糖以及丙醛糖组成的组中选择的至少一种单糖类。
14.根据本发明的第五方式，优选的是，在第三方式的分析方法中，所述糖是从由蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、松二糖以及纤维二糖组成的组中选择的至少一种二糖类。
15.根据本发明的第六方式，优选的是，在第三方式的分析方法中，所述糖是从由棉子糖、松三糖以及麦芽三糖组成的组中选择的至少一种三糖类。
16.根据本发明的第七方式，优选的是，在第三方式的分析方法中，所述糖是从由阿卡波糖和水苏糖组成的组中选择的至少一种四糖类。
17.根据本发明的第八方式，优选的是，在第一方式至第七方式中的任一个方式的分析方法中，所述差异是质谱中有无峰、或者峰的强度或面积之差。
18.根据本发明的第九方式，优选的是，在第八方式的分析方法中，所述峰是与酸休克蛋白(acid shock protein)对应的峰。
19.根据本发明的第十方式，优选的是，在第一方式至第九方式中的任一个方式的分析方法中，使用包含酸和有机溶剂中的至少一种的水溶液来制备用于所述第一质谱分析和所述第二质谱分析中的至少一者的分析用试样。
20.根据本发明的第十一方式，优选的是，在第十方式的分析方法中，所述酸是三氟乙酸。
21.根据本发明的第十二方式，优选的是，在第十方式的分析方法中，所述有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈。
22.根据本发明的第十三方式，优选的是，在第一方式至第十二方式中的任一个方式的分析方法中，在所述第一质谱分析和所述第二质谱分析中，通过基质辅助激光解吸电离或电喷雾电离来进行离子化。
23.根据本发明的第十四方式，优选的是，在第一方式至第十三方式中的任一个方式的分析方法中，所述信息是微生物的株。
24.根据本发明的第十五方式，微生物的识别方法利用第一方式至第十四方式中的任一个方式的分析方法来进行微生物的分析，所述信息是微生物的分类，根据所述信息来进行所述微生物的识别。
25.根据本发明的第十六方式，检查方法进行第一方式至第十三方式中的任一个方式的分析方法，所述信息是微生物的性状，根据所述信息来进行所述微生物的性状的检查。
26.发明的效果
27.根据本发明，能够基于培养条件等的不同，使用质谱分析来获得关于微生物的分类或性状等的信息。
附图说明
28.图1是示出一个实施方式的分析方法的流程的流程图。
29.图2是示出一个实施方式的分析方法的流程的流程图。
30.图3是示出一个实施方式的分析方法的流程的流程图。
31.图4是在含有葡萄糖的培养基(上段)和不含葡萄糖的培养基(下段)中分别培养大肠杆菌k12株，并对由该菌生成的物质进行质谱分析而获得的质谱。
32.图5是在含有葡萄糖的培养基(上段)和不含葡萄糖的培养基(下段)中分别培养大肠杆菌环境分离株，并对由该菌生成的物质进行质谱分析而获得的质谱。
33.图6是在含有葡萄糖的培养基中分别培养大肠杆菌环境分离株(上段)和k12株(下段)，并对由该菌生成的物质进行质谱分析而获得的质谱。
34.图7是对下述分子进行串联质谱分析时的产物离子谱，所述分子是与在含有葡萄糖的培养基中培养大肠杆菌k12株时在质谱中观察到的m/z为3823的峰对应的分子。
35.图8是在低氧浓度下(上段)和通常的氧浓度(约20％)下(下段)分别培养大肠杆菌k12株，并对由该菌生成的物质进行质谱分析而获得的质谱。
36.图9是在不含葡萄糖的培养基(上段)和含有葡萄糖的培养基(下段)中分别培养不动杆菌，并对由该菌生成的物质进行质谱分析而获得的质谱。
37.图10是示出从在含有葡萄糖的培养基(从上起第1段)和不含葡萄糖的培养基(从上起第2段)中分别进行培养后的大肠杆菌k12株获得的质谱、以及从在含有葡萄糖的培养基(从上起第3段)和不含葡萄糖的培养基(从上起第4段)中分别进行培养后的大肠杆菌jm109株获得的质谱的图。
38.图11是示出从在含有乳糖的培养基中进行培养后的jm109株获得的质谱(上段)、以及从在含有乳糖的培养基中进行培养后的k12株获得的质谱(下段)的图。
具体实施方式
39.下面，参照附图来说明用于实施本发明的方式。
40.‑
第一实施方式
‑
41.本实施方式的分析方法用于：基于对在第一条件下配置的微生物所产生的物质进行质谱分析(以下称为第一质谱分析)而获得的数据与对在第二条件下配置的微生物所产生的物质进行质谱分析(以下称为第二质谱分析)而获得的数据之间的差异，对该微生物获得关于性状或分类的信息。
42.第一条件与第二条件是不同的条件。发明人们发现，当第一条件与第二条件中配置了微生物的环境中的糖的浓度或氧浓度等不同时，在第一质谱分析与第二质谱分析中，会根据微生物的分类或性状等获得不同的数据。因而，优选的是，第一条件与第二条件中配置了微生物的环境中的糖的浓度和氧浓度中的至少一者不同。
43.(关于试样)
44.为了本实施方式的分析方法而准备的试样只要含有微生物即可，没有特别限定。关于试样中的微生物，优选使用通过分离培养等而提高了一种微生物的纯度的试样。例如，试样来源于食品或药品等。源于这些的试样能够用于利用本实施方式的分析方法进行食品或药品等的质量管理的检查中。在其它例中，试样来源于饮用水或土壤等从环境提取出的物质。源于这些的试样能够用于利用本实施方式的分析方法检查试样所来源的环境是否满足规定的基准等。试样所含有的微生物只要能够在第一质谱分析与第二质谱分析中获得根据微生物的分类或性状等而不同的数据即可，没有特别限定，但是优选为细菌，更优选为大
肠杆菌、不动杆菌或肠杆菌。
45.(关于第一条件和第二条件下的培养)
46.试样所含有的微生物分为至少2份，在第一条件和第二条件下分别培养。在第一条件和第二条件下，培养微生物的培养基既可以是琼脂培养基等固体培养基，也可以是液体培养基。培养基的基本组成没有特别限定，能够使用ifo 802培养基(水溶液的组成：多聚蛋白胨(hipolypeptone)为1质量％、酵母抽提物为0.2质量％、mgso4·
7h2o为0.1质量％、ph为7.0)等已知的培养基等。
47.关于第一条件与第二条件之间的不同点，只要通过第一条件与第二条件之间的不同而使第一质谱分析和第二质谱分析中获得的数据产生差异，并能够基于该差异来获得关于微生物的分类或性状的信息即可，没有特别限定。优选的是，第一条件与第二条件中用于培养微生物的培养基中的糖的浓度不同，或者微生物接触的气体中的氧浓度不同。也可以是该糖的浓度和氧浓度两者均不同。
48.在培养基中的糖的浓度不同的情况下，只要能够基于获得的数据的差异来获得关于微生物或性状的信息即可，第一条件与第二条件中的糖的浓度没有限定。为了获得更明确的结果，优选的是，第一条件与第二条件中的一者在培养基中不加入糖，另一者在培养基中以使糖为0.1％以上且10％以下等适当的浓度加入糖。
49.在第一条件和第二条件中，培养基中以不同的浓度含有的糖的种类没有特别限定，但是优选为单糖类、二糖类、三糖类以及四糖类。
50.在培养基所含有的上述糖为单糖类的情况下，优选为阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、岩藻糖、墨角藻糖、鼠李糖、阿洛酮糖(也称为阿卢糖、allulose)、果糖、山梨糖、塔格糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖、脱氧核糖、景天庚酮糖、丁酮糖、丁醛糖、丙酮糖(二羟基丙酮)或丙醛糖(甘油醛)。作为丁酮糖，优选为赤藓酮糖。作为丁醛糖，优选为赤藓糖或苏糖。也可以将这些单糖中的多种糖组合使用。上述糖更优选为葡萄糖。
51.在培养基所含有的上述糖为二糖类的情况下，优选为从由蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、松二糖以及纤维二糖组成的组中选择的至少一种二糖类。上述糖更优选为乳糖。
52.在培养基所含有的上述糖为三糖类的情况下，优选为从由棉子糖、松三糖以及麦芽三糖组成的组中选择的至少一种三糖类。
53.在培养基所含有的上述糖为四糖类的情况下，优选为从由阿卡波糖和水苏糖组成的组中选择的至少一种四糖类。
54.此外，培养基所含有的上述糖可以是上述列举以外的单糖类、二糖类、三糖类或四糖类的化合物，此外还可以是5个以上的单糖结合而成的糖。
55.在第一条件与第二条件中使微生物接触的气体的氧浓度不同的情况下，只要能够基于获得的数据的差异来获得关于微生物的分类或性状的信息即可，第一条件和第二条件的氧浓度的值没有特别限定。第一条件与第二条件中氧浓度之差优选为10％以上，更优选为15％以上。作为理想的例子，可以在一种条件中使微生物的周围气氛为空气，在另一种条件中将微生物、培养基和吸氧剂配置于密闭的容器等内等以降低氧浓度。在该情况下，降低后的氧浓度优选设为5％以下，更优选设为1％以下。作为吸氧剂，能够使用anaeropack(注册商标)等已知的产品所含的吸氧剂。
56.培养时的培养基的温度没有特别限定，优选为25℃～40℃，更优选为37℃，能够适当地选择适于微生物的增殖的温度。培养时间只要根据所选择的培养条件并基于设定的微生物的增殖速度等来适当决定即可，优选为12小时～36小时，例如能够设定为18小时等。在通过质谱分析来进行微生物的分析的情况下，与以往的分解性试验等相比，不需要用于积累显色所需要的分子的时间等，因此能够以短时间进行培养。
57.(关于分析用试样的制备)
58.当第一条件和第二条件的各条件下的培养结束时，制备用于第一质谱分析和第二质谱分析的分析用试样。在进行采用基质辅助激光解吸电离(以下称为maldi)的质谱分析的情况下，对通过培养而得到的微生物进行回收，向所得到的试样中加入含有基质的溶液(以下称为基质溶液)后使其滴到maldi用试样板来干燥。也可以在将试样配置于maldi用试样板之后加入基质溶液。基质的种类没有特别限定，能够使用chca(α
‑
cyano
‑4‑
hydroxycinnamic acid，α
‑
氰基
‑4‑
羟基肉桂酸)或芥子酸等。能够使用酸和有机溶剂中的至少一种来制备基质溶液的溶剂。关于该有机溶剂，优选使用甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈。关于该溶剂，例如能够使用向含有数十体积％的乙腈等有机溶剂的水溶液添加0～3体积％的三氟乙酸(tfa)而成的溶剂等。
59.此外，也可以在从通过培养而得到的微生物提取出蛋白质之后，向提取物加入基质溶液来制备分析用试样。另外，即使在不采用maldi进行质谱分析的情况下，也能够适当地与离子化的方法和质谱分析计的种类相配合地利用已知的方法等来进行分析用试样的制备。
60.(关于第一质谱分析和第二质谱分析)
61.关于第一质谱分析和第二质谱分析中的离子化的方法，使用maldi则易于生成1价的离子且易于分析，因此是优选的。另外，飞行时间型质谱分析在高精度地检测数kda以上等高质量的分子的方面是优选的。采用了maldi的飞行时间型质谱分析(以下称为maldi
‑
tofms)兼具maldi和飞行时间型质谱分析的优点，因此是特别优选的。但是，关于第一质谱分析和第二质谱分析的方法，只要能够基于通过第一质谱分析获得的数据(以下称为第一数据)与通过第二质谱分析获得的数据(以下称为第二数据)之间的差异来获得微生物的分类或性状的信息即可，没有特别限定。例如，能够采用电喷雾法等任意的离子化的方法。另外，能够使用四极质量过滤器或离子阱等质谱分析器，除了使用单质谱分析计以外，也可以将任意的多个质谱分析器组合使用来进行多阶段的质谱分析。在第一质谱分析和第二质谱分析中，生成与通过对离子化的试样进行检测而获得的质谱对应的数据。将通过第一质谱分析和第二质谱分析获得的质谱分别称为第一质谱和第二质谱。
62.(关于数据分析)
63.关于数据分析的方法，只要能够基于第一数据与第二数据的差异来获得关于微生物的分类或性状的信息即可，没有特别限定。优选基于第一质谱与第二质谱中有无规定的峰或该峰的大小差异来进行数据分析。能够使用个人计算机等信息处理装置、质谱分析装置内的处理装置等任意的数据分析装置来进行数据分析。
64.在第一条件与第二条件中改变了培养基中的糖的浓度的情况下，能够进行如下数据分析。设为在第一条件中培养基含有糖，在第二条件中培养基不含糖。此时，鉴定在第二质谱中未出现、在第一质谱中出现的峰(以下称为特有峰)。为了去除噪声和不显著的峰，例
如能够提取相对于任意的基准峰而言具有一定以上的相对强度或相对峰面积的峰来作为特有峰。
65.另一方面，预先获取了从过去的测定数据或理论值等获得的、微生物的株等分类中的、在培养基中加入有糖的情况下能够检测到、在培养基中未加入糖的情况下不能检测到的峰(以下称为参照峰)的m/z。在下面，将微生物的分类或性状与通过该微生物的质谱分析而获得的数据即参照峰相对应的数据称为参照数据。本实施方式的分析方法中的用于数据分析的数据分析装置构成为：具备将参照数据保存为数据库的存储介质、或能够借助通信从该存储介质对参照数据进行参照。
66.判定特有峰的m/z与参照峰的m/z是否处于第一质谱分析和第二质谱分析的基于精度的误差范围内。在判定为处于该误差范围内的情况下，则特有峰与参照峰相对应。在判定为不处于该误差范围内的情况下，则特有峰与参照峰不对应。在微生物的某个株等的所有参照峰均与特有峰相对应的情况下，能够识别为试样所含有的微生物是该株等的微生物。或者，也可以基于与参照峰相对应的特有峰的数量等来计算试样所含有的微生物是与该参照峰对应的微生物的概率。这种微生物的分类能够针对同属同种中的不同株来进行，此外也可以针对属、种等株以外的分类来进行。
67.此外，以上基于有无与参照峰的m/z对应的特有峰来进行了参照峰与特有峰的对应，但是也可以进一步基于峰的强度、面积等定量性数值来进行对应。以下也是同样的。
68.如上所述，提供一种微生物的识别方法，其使用本实施方式的分析方法来获取关于试样所含有的微生物的分类的信息。
69.作为参照数据，也可以使用致病性或抗药性等微生物的性状与参照峰相对应的数据。微生物的性状是指糖的同化性、最适生长温度或者致病性、抗药性等微生物特征，例如能够包括在微生物的分类内不同的特征。在该情况下，例如，在具有某个特定的性状的微生物所共同具有的所有参照峰均与特有峰相对应的情况下，能够获得试样所含有的微生物具有该性状这一信息。或者如上所述也可以计算概率。关于作为分析的对象的致病性，只要能够基于第一数据与第二数据的差异来进行数据分析即可，没有特别限定，例如是大肠杆菌的肠出血性等。作为分析的对象的抗药性也同样没有特别限定，例如是抗菌抗性(日语：抗菌耐性)等。
70.如上所述，提供一种微生物的检查方法，其采用本实施方式的分析方法来获取关于试样所含有的微生物的性状的信息，并通过该信息来进行微生物的性状检查。
71.在第一条件与第二条件下进行培养时，在改变了微生物接触的气体的氧浓度的情况下也能够进行同样的数据分析。设为，在第一条件中上述氧浓度为5％以下等低氧浓度，在第二条件中上述氧浓度为18％以上且22％以下等与空气相近的氧浓度。此时，将在第二质谱中未出现、在第一质谱中出现的峰设为特有峰。另外，基于过去的测定数据或理论值等，将在低氧浓度下培养微生物时能够检测到、在与空气相近的氧浓度下培养微生物时不能检测到的峰设为参照峰。在该情况下也与使糖的浓度变化的情况下同样地，能够基于特有峰与参照峰的对应来获取关于微生物的分类或性状的信息。
72.图1是示出本实施方式的分析方法的流程的流程图。在步骤s1001中，准备含有微生物的试样。当步骤s1001结束时，开始步骤s1003a和步骤s1003b这两方。
73.在步骤s1003a中，在第一条件下培养微生物。当步骤s1003a结束时，开始步骤
s1005a。在步骤s1005a中，制备含有在第一条件下配置的微生物所产生的物质的分析用试样(以下称为第一分析用试样)。当步骤s1005a结束时，开始步骤s1007a。在步骤s1007a中，进行第一分析用试样的第一质谱分析，获取与第一质谱对应的第一数据。
74.在步骤s1003b中，在第二条件下培养微生物。当步骤s1003b结束时，开始步骤s1005b。在步骤s1005b中，制备含有在第二条件下配置的微生物所产生的物质的分析用试样(以下称为第二分析用试样)。当步骤s1005b结束时，开始步骤s1007b。在步骤s1007b中，进行第二分析用试样的第二质谱分析，数据分析装置获取与第二质谱对应的第二数据。当步骤s1007a和步骤s1007b结束时，开始步骤s1009。
75.在步骤s1009中，基于第一质谱与第二质谱中的有无峰等差异、以及参照数据，来获得关于微生物的分类或性状的信息。例如，从数据库检索与通过第一质谱分析和第二质谱分析获得的特有峰相对应的参照峰。当步骤s1009结束时，开始步骤s1011。在步骤s1011中，输出在步骤s1009中获得的信息。该信息被显示于与数据分析装置连接的显示器或者由打印机等印刷来进行输出。
76.图2是示出在本实施方式的分析方法中根据通过第一质谱分析和第二质谱分析获得的数据制作包含参照数据的数据库的流程的流程图。实际上，在进行图1示出的分析方法之前，通过图2中示出的方法来预先制作参照数据的数据库。在图2中，示出将第一质谱的特有峰作为参照数据记录到数据库的例子，但是针对第二质谱也进行该流程。
77.在步骤s2001中，准备含有规定种类的微生物的试样。微生物的种类既可以是已知的，也可以在步骤s2013之前通过已知的方法等进行鉴定。当步骤s2001结束时，开始步骤s2003a和步骤s2003b这两方。步骤s2003a～s2007a和步骤s2003b～s2007b分别与图1的流程图中的步骤s1003a～s1007a和步骤s1003b～s1007b相同，因此省略说明。当步骤s2007a和步骤s2007b结束时，开始步骤s2009。
78.在步骤s2009中，将第一质谱与第二质谱进行比较，来确定第一质谱所特有的峰。当步骤s2009结束时，开始步骤s2011。在步骤s2011中，针对其它多个种类的微生物也进行步骤s2001～s2009，来确定第一质谱所特有的峰。当步骤s2011结束时，开始步骤s2013。
79.在步骤s2013中，将使微生物的种类与第一质谱中的特有的峰的m/z相对应的数据(参照数据)存储到数据库。当步骤s2013结束时，结束数据库的构建处理。
80.此外，在步骤s2009或步骤s2011中，也可以是：当确定出某个微生物特有的峰时，依次如步骤s2013那样将对应的参照数据存储到数据库。
81.(关于特有峰的一例)
82.在将用含有糖的培养基培养微生物(大肠杆菌k12株)的情况设为第一条件、将用不含糖的培养基培养微生物(大肠杆菌k12株)的情况设为第二条件的情况下，发明人们将与m/z为2371、2401及3823分别对应的峰确定为在第一质谱中观察到的特有峰。并且，发明人们通过串联质谱分析鉴定出与它们对应的分子(参照后述的实施例2)。
83.上述特有峰与构成大肠杆菌k12株的酸休克蛋白(uniprot登记编号：p36560)的一部分的分子对应。大肠杆菌k12株的酸休克蛋白的氨基酸序列为“mkkvlalvva aamglssaaf aaettttpap tatttkaapa ktthhkkqhk aapaqkaqaa kkhhkntkae qkapeqkaqa akkhakkhsh qqpakpaaqp aa”(序列号1)。与m/z为3823对应的特有峰(参照图4)是与酸休克蛋白的氨基酸序列中的第22位至第58位的氨基酸对应的分子。与m/z为2371对应的特有峰是与酸休克
蛋白的氨基酸序列中的第59位至第79位的氨基酸对应的分子。与m/z为2401对应的特有峰是与酸休克蛋白的氨基酸序列中的第80位至第102位的氨基酸对应的分子。
84.也存在表达与酸休克蛋白对应的蛋白质的其它属的微生物。例如，d群志贺菌(shigella sonnei：宋内志贺菌)具备编码具有与大肠杆菌k12株的酸休克蛋白不同的氨基酸序列的酸休克蛋白(uniprot登记编号：a0a236hjk2)的基因。因而，推测本实施方式的分析方法至少能够优选地适用于表达酸休克蛋白的各种微生物。通过在第一条件与第二条件之间糖的浓度或氧浓度等不同，当配置了微生物的环境为酸性时，能够表达酸休克蛋白并获取特有峰。因而，在本实施方式的分析方法中，可以在第一条件和第二条件中的任一方中使配置了微生物的环境为酸性。
85.此外，上述的酸休克蛋白是在第一条件与第二条件中使糖的浓度、氧浓度不同时在一方的条件下独特地表达的分子的一例，本发明并不仅将与酸休克蛋白对应的峰限定为特有峰。只要在使糖的浓度、氧浓度等不同时第一数据与第二数据存在差异，且能够基于该差异获得关于微生物的分类或性状的信息即可，成为该差异的原因的分子等没有特别限定。
86.根据上述的实施方式，能够获得以下作用效果。
87.(1)本实施方式的分析方法包括以下步骤：在第一条件下配置了微生物之后，对微生物所产生的物质进行第一质谱分析；在第二条件下配置了微生物之后，对微生物所产生的物质进行第二质谱分析；以及，基于通过第一质谱分析获得的第一数据与通过第二质谱分析获得的第二数据之间的差异、以及所述微生物的分类或性状与通过所述微生物的质谱分析获得的数据相对应的参照数据，来获得关于微生物的性状或分类的信息，其中，第一条件与第二条件中配置了微生物的环境中的糖的浓度或氧浓度不同。由此，能够基于培养条件等的不同，通过质谱分析来获得关于微生物的分类或性状等的信息。
88.(2)在本实施方式的分析方法中，上述差异是质谱中有无特有峰、或者峰的强度或面积之差。由此，能够利用包含各种分子的定量性的信息的质谱来进行更详细的分析。
89.(3)在本实施方式的分析方法中，特有峰包括与酸休克蛋白对应的峰。由此，能够利用酸休克蛋白在每个种、株之间的偏差来进行分析。
90.如下变形也为本发明的范围内，能够与上述的实施方式进行组合。在以下的变形例中，关于与上述的实施方式相同的部分，适当省略说明。
91.(变形例1)
92.在上述的实施方式中，进行第一质谱分析和第二质谱分析双方来获取与各自对应的数据。但是，也可以仅进行第一质谱分析和第二质谱分析中的任一方，对于另一方，利用过去获取到的信息。
93.在以下的说明中，设为进行第一质谱分析，而对于应该通过第二质谱分析获得的第二数据，利用过去获取到的信息。本变形例特别在第二条件是比第一条件更基本、或更通用的条件的情况下有用，但是没有特别限定。例如，在将第一条件设为用含有糖的培养基来培养微生物、将第二条件设为用不含糖的培养基来培养微生物的情况下，第二数据能够设为包含第二质谱、或者第二质谱中出现的峰的m/z的值的数据。由此，能够基于第一质谱和第二数据来鉴定第一光谱中的特有峰。若获得了基于培养基中有无糖的特有峰，则能够进行与基于有无糖的参照数据的对应，来获得关于微生物的分类或性状的信息。
94.图3是示出本实施方式的分析方法的流程的流程图。步骤s3001～步骤s3007与上述的图1的流程图中的步骤s1001和s1003a～s1007a分别相同，因此省略说明。当步骤s3007结束时，开始步骤s3009。
95.在步骤s3009中，数据分析装置获取第二数据，该第二数据是在第二条件下培养了与试样所含有的微生物相同种类的微生物之后，通过该微生物所产生的物质的第二质谱分析来获得的。当步骤s3009结束时，开始步骤s3011。步骤s3011和步骤s3013与上述的图1的流程图的步骤s1009和步骤s1011相同，因此省略说明。当步骤s3013结束时，处理结束。
96.在本变形例的分析方法中，包括以下步骤：在第一条件下配置了微生物之后对微生物所产生的物质进行第一质谱分析；以及基于通过第一质谱分析获得的第一数据与在第二条件下配置了微生物之后对微生物所产生的物质进行第二质谱分析而获得的第二数据之间的差异、以及参照数据，来获得关于试样所含有的微生物的分类或性状的信息，其中，第一条件与第二条件中配置了微生物的环境中的糖的浓度或氧浓度不同。由此，能够减少质谱分析的次数，能够更高效地进行分析。
97.本发明并不限定于上述实施方式的内容。在本发明的技术思想的范围内能够想到的其它方式也包含于本发明的范围内。
98.实施例
99.下面，示出本实施方式的实施例，但是本发明并不限定于下述的实施例的数值、装置等条件。
100.(实施例1)
101.在实施例1中，将第一条件与第二条件之间的不同点设为培养基中有无糖，使用特有峰来进行了2个不同株的大肠杆菌的识别。
102.<关于试样>
103.关于试样，准备了大肠杆菌k12株和大肠杆菌环境分离株。关于大肠杆菌环境分离株，在从一般的环境中采集、并涂布于固体培养基来得到分离株之后，通过基于maldi的微生物鉴定方法而鉴定为大肠杆菌。大肠杆菌k12株与大肠杆菌环境分离株为同属同种，通过以往的生物化学上的性状检查无法识别。
104.<大肠杆菌k12株的培养及质谱分析>
105.将大肠杆菌k12株分开，在向ifo 802培养基加入有葡萄糖(0.5质量％)的培养基、以及ifo 802培养基中分别以37℃、18小时的条件进行了培养。对培养后的微生物进行离心并舍弃了上清液，向余下的菌体中加入三氟乙酸
‑
乙腈水溶液来使其悬浮。对悬浮后的溶液进行离心分离并回收了上清液。用乙腈水溶液对所回收的上清液进行了稀释并滴到maldi质谱分析用板来使其干燥。向干燥后的试样加入作为基质的chca并再次干燥，使用maldi质谱分析装置(岛津制作所axima performance)来进行了飞行时间型的质谱分析。
106.图4是示出从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的k12株获得的质谱(上段)、以及从用未加入葡萄糖的培养基来培养后的k12株获得的质谱(下段)的图。在用加入有葡萄糖的培养基来培养大肠杆菌k12株的情况下，根据与用未加入葡萄糖的培养基进行培养的情况的比较，在获得的质谱中观察到m/z为2371、m/z为2401以及m/z为3823的特有峰。
107.<大肠杆菌环境分离株的培养及质谱分析>
108.将大肠杆菌环境分离株分开，在向ifo 802培养基加入有葡萄糖(0.5质量％)的培
养基、以及ifo 802培养基中分别以37℃、18小时的条件进行了培养。对培养后的微生物，通过与针对大肠杆菌k12株的上述的方法相同的方法进行了质谱分析。
109.图5是示出从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的环境分离株获得的质谱(上段)、以及从用未加入葡萄糖的培养基来培养后的环境分离株获得的质谱(下段)的图。在用加入有葡萄糖的培养基来培养大肠杆菌环境分离株的情况下，根据与用未加入葡萄糖的培养基进行培养的情况的比较，在获得的质谱中观察到m/z为2341、m/z为2401以及m/z为3792的特有峰。
110.图6是示出从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的大肠杆菌环境分离株获得的质谱(上段)、以及从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的大肠杆菌k12株获得的质谱(下段)的图。图6的2个质谱放大示出了图4、图5中的质谱的一部分。可知m/z为2341、m/z为2401以及m/z为3792的峰为大肠杆菌环境分离株的显著的特有峰。另外，可知m/z为2371、m/z为2401以及m/z为3823的峰为大肠杆菌k12株的显著的特有峰。这样，能够基于用含有糖的培养基来进行培养时产生的物质不同这一特征来进行不同株的识别。
111.(实施例2)
112.通过maldi对与用加入有葡萄糖的培养基来培养大肠杆菌k12株后进行质谱分析而获得的质谱中的、作为特有峰而观察到的m/z为3823对应的分子进行了离子化并进行了串联质谱分析。设为通过串联质谱分析而获得的产物离子谱中的各个峰相当于肽片段，来进行了数据分析并导出了该分子的氨基酸序列。
113.图7是示出通过串联质谱分析而获得的产物离子谱的图。对该产物离子谱进行数据分析的结果是，推测与上述m/z为3823对应的分子是具有“aettttpaptatttkaapaktthhkkqhkaapaqkaq”(序列号2)的氨基酸序列的肽。知道了该肽与大肠杆菌k12株的酸休克蛋白的氨基酸序列(序列号1)的第22位至第58位的氨基酸对应。进行了同样的分析而推测与m/z为2371对应的特有峰与酸休克蛋白的氨基酸序列中的第59位至第79位的氨基酸对应。推测与m/z为2401对应的特有峰与酸休克蛋白的氨基酸序列中的第80位至第102位的氨基酸对应。
114.(实施例3)
115.在实施例3中，将大肠杆菌k12株作为试样、将第一条件与第二条件之间的不同点设为培养时大肠杆菌k12株接触的气体的氧浓度，来进行了特有峰的检测。
116.<大肠杆菌k12株的培养及质谱分析>
117.制备了20ml的含有1％的多聚蛋白胨、0.2％的酵母抽提物、0.1％的硫酸镁的水溶液来作为培养基并加入了大肠杆菌k12株。将加入有大肠杆菌的培养基以每次10ml的方式进行分注，将一方使用厌氧培养系统anaeropack(三菱瓦斯化学)来设为低氧浓度(0.5％以下)。用设为低氧浓度的培养基和未设为低氧浓度的培养基来分别以37℃、24小时的条件培养了大肠杆菌。对培养后得到的培养液进行离心分离并弃掉了上清液，向余下的菌体加入100μl的2.5％的三氟乙酸50％的乙腈水溶液来使其悬浮。对悬浮后的溶液进行离心分离并分别回收了各自的上清液。将所回收的上清液用50％的乙腈水溶液稀释为400倍、或者1,600倍，将其中的0.5μl滴到maldi质谱分析用板来使其干燥。向干燥后的试样以重叠的方式加入2.5mg/ml的chca并进行再次干燥，使用maldi质谱分析装置(岛津制作所axima performance)来进行了飞行时间型的质谱分析。
118.图8是示出从在低氧浓度下培养的微生物获得的质谱(上段)、以及从未设为低氧浓度而培养出的微生物获得的质谱(下段)的图。在低氧浓度下培养大肠杆菌k12株的情况下，根据与未设为低氧而培养的情况的比较，在获得的质谱中观察到m/z为2371、m/z为2401以及m/z为3823的特有峰。认为该特有峰对应于与用含有糖的培养基来培养时的特有峰相同的分子(酸休克蛋白)。因而，知道了通过厌氧性条件的培养也能够表达该分子。即，能够利用在厌氧性条件的培养中表达酸休克蛋白或未表达酸休克蛋白这一特性，来获取关于微生物的分类或性状的信息。另外，也能够利用来源于该分子的m/z的值的不同，来获取关于微生物的分类或性状的信息。
119.(实施例4)
120.在实施例4中，将不动杆菌作为试样，将第一条件与第二条件之间的不同点设为培养基中有无糖，来进行了特有峰的检测。
121.<关于试样>
122.关于试样，准备了不动杆菌的环境分离株。关于不动杆菌的环境分离株，在从人的粪便采集、并涂布到固体培养基来得到了分离株之后，通过maldi微生物鉴定方法而鉴定为不动杆菌。
123.<不动杆菌的培养及质谱分析>
124.制备了10ml的含有1％的多聚蛋白胨、0.2％的酵母抽提物、0.1％的硫酸镁的水溶液(ifo 802培养基)并向其加入了不动杆菌。制备了10ml的含有0.5％的多聚蛋白胨、0.5％的酵母抽提物、0.5％的葡萄糖、0.1％的硫酸镁的水溶液(ifo 804培养基)并向其加入了不动杆菌。在两个培养基中以37℃、18小时的条件培养了不动杆菌。在培养后，对各个培养液进行离心分离并弃掉了上清液，向余下的菌体加入100μl的2.5％的三氟乙酸50％的乙腈水溶液来使其悬浮。对悬浮后的溶液进行离心分离并回收了上清液。将所回收的上清液用50％的乙腈水溶液稀释100倍，将其中的0.5μl滴到maldi质谱分析用板来使其干燥。向干燥后的试样以重叠的方式加入0.5μl的2.5mg/ml的chca并进行再次干燥，使用maldi质谱分析装置(岛津制作所axima performance)来进行了飞行时间型的质谱分析。
125.图9是示出从用未加入葡萄糖的培养基来培养后的不动杆菌获得的质谱(上段)、以及从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的不动杆菌获得的质谱(下段)的图。在用加入有葡萄糖的培养基来培养不动杆菌的情况下，根据与用未加入葡萄糖的培养基进行培养的情况的比较，在获得的质谱中观察到m/z为8822的特有峰。因而显示出，通过利用加入有葡萄糖的培养基的培养而表达响应该条件的分子的现象不仅在大肠杆菌中可见，在其它微生物中也可见，上述的实施方式的分析方法是通用的。此外，m/z为4413也能够说是特有峰，但是该峰对应于与m/z为8822的特有峰对应的离子的二价离子。
126.(实施例5)
127.在实施例5中，将大肠杆菌k12株和大肠杆菌jm109株作为试样，将第一条件与第二条件之间的不同点设为培养基中有无糖，使用葡萄糖和乳糖来作为该糖。通过改变糖，特有峰的出现不同，利用该情况进行了2个不同株的大肠杆菌的识别。
128.<大肠杆菌k12株和大肠杆菌jm109株的培养(有无葡萄糖)及质谱分析>
129.将大肠杆菌k12株分开，在向ifo 802培养基加入有葡萄糖(0.5质量％)的培养基、以及ifo 802培养基中分别以37℃、18小时的条件进行了培养。对培养后的微生物进行离心
并舍弃了上清液，向余下的菌体加入三氟乙酸
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乙腈水溶液来使其悬浮。对悬浮后的溶液进行离心分离并回收了上清液。将所回收的上清液用乙腈水溶液稀释后滴到maldi质谱分析用板来使其干燥。向干燥后的试样加入作为基质的chca并再次干燥，使用maldi质谱分析装置(岛津制作所axima performance)来进行了飞行时间型的质谱分析。
130.在大肠杆菌jm109株的情况下，也与上述的大肠杆菌k12株的情况同样地，用向ifo 802培养基加入有葡萄糖(0.5质量％)的培养基和未加入葡萄糖的培养基进行培养，并与上述同样地制备试样来进行了质谱分析。
131.图10是示出从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的k12株获得的质谱(从上起第1段)、从用未加入葡萄糖的培养基来培养后的k12株获得的质谱(从上起第2段)、从用加入有葡萄糖的培养基来培养后的jm109株获得的质谱(从上起第3段)、以及从用未加入葡萄糖的培养基来培养后的jm109株获得的质谱(从上起第4段)的图。在大肠杆菌jm109株的情况下，也与大肠杆菌k12株同样地，在用加入有葡萄糖的培养基来进行培养的情况下在获得的质谱中观察到m/z为2371、m/z为2401以及m/z为3823的特有峰(参照用虚线围起来的矩形部分p1和p2)。即，大肠杆菌jm109株也具有酸休克蛋白的基因，通过用含有葡萄糖的培养基进行培养，该基因表达。
132.<大肠杆菌k12株和大肠杆菌jm109株的培养(添加乳糖)及质谱分析>
133.将大肠杆菌k12株和大肠杆菌jm109株用向ifo 802培养基加入了乳糖(1质量％)的培养基以37℃、18小时的条件来分别进行了培养。对培养后的微生物进行离心并舍弃了上清液，向余下的菌体加入三氟乙酸
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乙腈水溶液来使其悬浮。对悬浮后的溶液进行离心分离并回收了上清液。将所回收的上清液用乙腈水溶液稀释后滴到maldi质谱分析用板来使其干燥。向干燥后的试样加入作为基质的chca并再次干燥，使用maldi质谱分析装置(岛津制作所axima performance)来进行了飞行时间型的质谱分析。
134.图11是示出从用加入有乳糖的培养基来培养后的jm109株获得的质谱(上段)、以及从用加入有乳糖的培养基来培养后的k12株获得的质谱(下段)的图。在大肠杆菌k12株的情况下，与图10的加入有葡萄糖的情况同样地观察到特有的峰。与此相对，在大肠杆菌jm109株的情况下，与图10的未加入葡萄糖的情况同样地未观察到特有峰(参照箭头a1、a2及a3)。即，大肠杆菌k12株和大肠杆菌jm109株在添加有葡萄糖的培养基中同样地表达酸休克蛋白，与此相对地，在添加有乳糖的情况下，大肠杆菌k12株中表达酸休克蛋白，但是大肠杆菌jm109株中未表达酸休克蛋白。从而，改变糖的种类则获得的质谱的图案不同，可以利用这一点来识别菌株。
135.以下的优先权基础申请的公开内容作为引用内容而并入本文。
136.日本特愿2019
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071663号(2019年4月3日申请)。