一种检测腹水或腹腔灌洗液中癌细胞的试剂盒的制作方法

1.本发明属于腹膜癌病检测技术领域，尤其涉及一种检测腹水或腹腔灌洗液中癌细胞的试剂盒。


背景技术：

2.胃癌、结直肠癌、原发性腹膜癌等腹盆腔恶性肿瘤局域性进展易形成腹膜表面肿瘤，通常称为腹膜癌病(peritoneal carcinomatosis，pc)(简称腹膜癌)。腹水或腹腔灌洗液细胞学检查腹腔游离癌细胞(cytology，cy)是诊断腹膜微转移的金标准。有文献认为，腹腔内游离的癌细胞是形成腹膜转移的先决条件，是胃癌的独立预后不良因素(lee sd,ryu kw,eom bw,et al.prognostic significance ofperitoneal washing cytology in patients with gastric cancer[j].br j surg,2012,99(3):397
‑
403.doi:10.1002/bjs.7812.)。腹腔游离癌细胞阳性可作为ⅳ期胃癌的独立诊断指标。但当灌洗液中仅存在少量的游离癌细胞时，常规技术可能无法达到预期目的。


技术实现要素：

[0003]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测腹腔灌洗液中癌细胞的试剂组合，本发明基于腹腔游离上皮细胞与腹腔中其他细胞(主要是粒细胞)之间细胞直径大小、结构差异及形变能力不同，利用纳米微孔滤膜过滤装置将上皮细胞从腹腔灌洗液中分离及富集，然后采用荧光原位杂交(fish)和免疫荧光染色(if)技术对分离获得的胃肠道肿瘤细胞进行染色体cep8和/或cep17标记及特异性蛋白标记表面抗原鉴别出肿瘤细胞或异倍体细胞以实现恶性上皮细胞的精准检测，实现腹膜微转移的早发现早诊断。
[0004]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0005]
本发明提供了一种检测腹水或腹腔灌洗液中癌细胞的试剂盒，包括用来收集腹腔灌洗液中的上皮细胞的纳米微孔滤膜过滤装置和if
‑
fish试剂，所述if
‑
fish试剂的检测标记物包括以下组分中的一种或几种：cep8、cep17和epcam蛋白。
[0006]
优选的，所述腹水或腹腔灌洗液中的癌细胞的数量≤101。
[0007]
优选的，所述纳米微孔滤膜过滤装置为循环肿瘤细胞分离仪。
[0008]
优选的，所述if
‑
fish试剂包括固定液、穿孔剂、cep8探针、cep17探针、溶液a、溶液b、细胞核染色液、一抗cd45 antibody cocktail(mouse)、二抗goat anti
‑
mouse igg(h l)highly cross
‑
adsorbed secondary antibody、一抗epcam polyclonal antibody(rabbit))和二抗goat anti
‑
rabbit igg(h l)highly cross
‑
adsorbed secondary antibody。
[0009]
优选的，所述溶液a是氯化钠和tris
‑
hcl的混合溶液，所述溶液b是np
‑
40溶液，溶液a和溶液b用于杂交样本的清洗。
[0010]
优选的，还包括以下试剂：封闭试剂、无水乙醇、甲醇、质量浓度为4％多聚甲醛溶液、pbs缓冲液和生理盐水。
cross
‑
adsorbed secondary antibody、一抗epcam polyclonal antibody(rabbit))和二抗goat anti
‑
rabbit igg(h l)highly cross
‑
adsorbed secondary antibody。所述溶液a是氯化钠和tris
‑
hcl的混合溶液，溶液b是np
‑
40溶液，溶液a和溶液b用于杂交样本的清洗。固定液、穿孔剂、cep8探针、cep17探针、溶液a、溶液b和细胞核染色液优选购自yzymed公司。所述一抗cd45 antibody cocktail(mouse)和二抗goat anti
‑
mouse igg(h l)highly cross
‑
adsorbed secondary antibody,alexa fluor plus 488，作为对照检测试剂使用。所述if
‑
fish试剂优选包括一抗epcam polyclonal antibody(rabbit))和所述二抗goat anti
‑
rabbit igg(h l)highly cross
‑
adsorbed secondary antibody，alexa fluor 546，该抗体对用于免疫检测epcam蛋白。
[0032]
在本发明中，所述试剂盒优选还包括以下试剂：封闭试剂、无水乙醇、甲醇、质量浓度为8％多聚甲醛溶液、pbs缓冲液和生理盐水。封闭试剂为质量百分含量5％bsa的pbs溶液；无水乙醇，优选为分析纯及以上，用于细胞脱水；甲醇，用于固定分离后的细胞；质量浓度为4％多聚甲醛溶液(pfa)，用于前处理样本时固定细胞用；pbs缓冲液，用于漂洗；生理盐水，用稀释样品。在本发明具体实施过程中所用试剂的规格和用途详见表1记载。
[0033]
在本发明中，所述试剂盒检测腹腔灌洗液中癌细胞的方法，优选包括以下步骤：用纳米微孔滤膜过滤装置收集腹水或腹腔灌洗液，经润洗，得到收集的癌细胞；将所述癌细胞转移至玻片上制片，依次在固定液、穿孔剂、封闭液的作用下处理癌细胞，然后再依次添加一抗和二抗进行免疫反应，再次依次用固定液、穿孔剂、封闭液处理癌细胞，添加cep8探针和cep17探针后进行结合反应，封片，检测。
[0034]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0035]
实施例1
[0036]
1.本实施例主要涉及的材料见表1。
[0037]
表1主要耗材与试剂
[0038]
[0039][0040]
2.样品的收集及润洗
[0041]
1)样本收集：
[0042]
a)先用50ml无菌管采集30ml腹水或腹腔灌洗液标本。
[0043]
b)样本保存无需冷藏，室温即可，采集后需要在2小时内进行前处理(步骤3)。如不能在2小时内移交检测，请竖直静置于4℃冰箱保存，保存时间不得超过24小时。放置于4℃
冰箱保存的样本，处理前至少在室温环境下复温30分钟。
[0044]
2)滤器润洗
[0045]
a)打开滤器上下塞并将滤器放置在润洗支架上。
[0046]
b)用巴氏管向滤器内加入约2ml的75％医用酒精待其从滤器下口自然滤出。
[0047]
c)向滤器内加入4ml生理盐水进行漂洗，去除滤器内残留酒精，自然滤出生理盐水。
[0048]
d)重复步骤c)，留适量生理盐水以保证滤膜湿润即可，装上滤器下塞。
[0049]
注意：如果在滤器润洗过程中存在酒精无法自然滤出或滤出过慢的情况，请立即弃用该滤器。
[0050]
3)样本前处理：取1000μl 8％pfa加入50ml离心管中，取腹水或腹腔灌洗液样本20ml加入50ml离心管中并轻轻颠倒混匀8次，室温静置10min，对细胞进行预固定。
[0051]
样本分离及切片制作
[0052]
1)样本分离：样本分离的过程由仪器半自动完成，具体如下：
[0053]
a)将滤器放于a10支撑模块的正中间，确保下胶塞被下针刺穿。
[0054]
b)用巴氏管向滤器中加入约10ml固定好的样本，点击“开始”，待样本分离完毕后，再用巴氏管向滤器中加入剩余10ml样本，再次点击“开始”，完成样本分离。
[0055]
c)向滤器管中加入4ml pbs，点击“开始”，进行样本漂洗。
[0056]
d)重复步骤c)2次。
[0057]
2)甲醇固定：向滤器中加入500μl甲醇，室温固定1min后，点击“开始”按钮运行设备排尽甲醇。如有甲醇残留，将滤器从机器上取下，打开下胶塞，盖上上胶塞，使得残余的甲醇自然流出。
[0058]
3)取膜，贴膜：按图1的方式拆卸滤器取出滤膜，在载玻片一端上滴加5μl甲醇，将滤膜正面朝上贴于玻片，自然晾干10min。
[0059]
4)去除滤膜背面细胞：滴加10μl的甲醇于玻片上，将晾干的滤膜用镊子揭下后再贴平到滴加有甲醇的玻片处，尽量贴平整，50℃10min。
[0060]
if
‑
fish染色及阅片
[0061]
1)组化笔画圈：用组化笔在滤膜周围画一个比滤膜稍大的封闭的圆圈，待2min晾干。
[0062]
2)细胞固定：向滤膜上滴加150μl固定液(荧光原位杂交样品处理试剂盒固定液)室温固定5min。完成后pbs漂洗3次，每次3min。
[0063]
3)细胞穿透：向滤膜上滴加150μl穿孔剂(荧光原位杂交样品处理试剂盒穿孔剂)室温放置3min。完成后pbs漂洗3次，每次3min。
[0064]
4)封闭及一抗孵育：一抗epcam polyclonal antibody(rabbit)和一抗cd45 antibody cocktail(mouse)混合(1:1，v/v)，见表1)，用5％bsa(pbs配制)按1:100稀释，轻轻吹打混匀。在滤膜上滴加150μl一抗，4℃孵育过夜，孵育完成后pbs漂洗5次，每次3min。
[0065]
5)二抗孵育：二抗alexa fluor 546goat anti
‑
rabbit、二抗alexa fluor 488goat anti
‑
mouse按照体积比1:1比例混合，然后用pbs按1:200稀释，吹打混匀后滤膜上滴加150μl二抗，37℃孵育45min，孵育完成后pbs漂洗5次，每次3min。
[0066]
6)二次固定：向滤膜上滴加150μl固定液室温放置5min，pbs漂洗2次，每次3min。
[0067]
7)二次穿透：再向滤膜上滴加150μl穿孔剂室温放置7min，完成后pbs漂洗3次，每次3min。
[0068]
8)脱水：将切片依次置于75％，85％，100％的乙醇溶液各2min，再将切片置于阴暗通风处晾干。
[0069]
9)探针覆盖：取出cep8/cep17探针，室温静置5min，混匀探针后短暂离心，取10μl滴加于滤膜正中心，立即盖上盖玻片(探针在盖玻片下均匀分布且无气泡，尽量避免过度挤压盖玻片)，用fixogum封片胶将盖玻片周围彻底封住。
[0070]
10)变性杂交：将玻片置于原位杂交仪上，95℃变性2min，42℃杂交1h。
[0071]
11)杂交样本清洗：用镊子小心撕去盖玻片周围封片胶，避免粘掉或者移动盖玻片；
[0072]
a)取溶液a(荧光原位杂交样品处理试剂盒溶液a)和去离子水，按照1:4的比例稀释，将载玻片放入稀释后的溶液中浸泡1min，待盖玻片自然脱落；
[0073]
b)取溶液a、溶液b(荧光原位杂交样品处理试剂盒溶液b)和去离子水按照1：1：3的比例混合，放入52℃水浴锅中预热至少30min，将载玻片放入稀释后的溶液(52℃)中浸泡5min；
[0074]
c)再将载玻片放入37℃预热的去离子水中浸泡10s，暗处自然干燥载玻片。
[0075]
12)封片及检测：向滤膜正中心滴加细胞核染色液(荧光原位杂交样品处理试剂盒细胞核染色液)，盖玻片封片，置于荧光显微镜下，先在低倍物镜(10
×
)下确认细胞区域；转到40
×
物镜下，找到一个细胞分布均匀的位置，再在高倍物镜(100
×
)下观察细胞核的if
‑
fish结果。
[0076]
13)实验及镜检完成后的样本，置于
‑
20℃条件下避光保存。
[0077]
附：实验中滴加液体的体积量可依据能够覆盖滤膜的最少量加入，避免试剂的浪费。
[0078]
注意事项：if
‑
fish过程为防止滤膜干燥和荧光信号猝灭，应该在不透光的湿盒中完成全部孵育过程；整个操作过程应避光操作。
[0079]
按照上述方法对48个样本进行检测，检测结果如表2所示。
[0080]
表2 48个样本的检测结果
[0081]
[0082]
[0083][0084]
由上述实施例可知，本发明提供的试剂盒能够实现腹膜微转移的早期筛查，并且三种检测标志物的同时检测有利于提高检测准确性，并且本发明提供的试剂盒能够检测个位数的癌细胞，极大程度提高了检测灵敏度。
[0085]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。