氯化锂的制药用途的制作方法

1.本发明属于高血压治疗领域，具体涉及氯化锂(licl)对于血管紧张素ii(ang ii)诱导的高血压小鼠的降血压及保护内皮的作用。


背景技术：

2.氯化锂是一种锂盐，分子式为licl，分子量为42.39。是白色的晶体，具有潮解性。味咸，易溶于水，乙醇，丙酮等有机溶剂。锂盐具有镇定作用，被广泛用于治疗双向情感障碍。并且目前虽然很难确定动物体内锂的正常功能，但锂确实会影响许多生物系统，因此可以视为调节分子。高血压是一种常见的慢性疾病，是目前世界上致残和导致过早死亡的主要危险因素。据who统计，截止2015年，每年全球有940万人的死亡归因于高血压。另外，据2019年中国心血管健康与疾病报告显示，中国心血管疾病的患者有2.9亿，而这其中患有高血压的就高达2.7亿。血管紧张素转换酶抑制剂(ace
‑
is)、血管紧张素
‑
ii受体阻滞剂(arbs)、钙拮抗剂(ccbs)、利尿剂和β受体阻滞剂，是目前作为抗高血压的一类药物，当血压控制不佳时会联合或者配伍其他药物使用。即使这样目前仍然有近一半的高血压患者在服用抗高血压药物后血压值并没有降低到目标血压，还有这些药物都存在许多不同的副作用。对于高血压的治疗目前尚还没有十分有效且副作用较小的药物。而氯化锂凭借其细胞保护作用，已成为重大疾病靶向治疗研究的新热点，具有极其重要的理论研究和临床应用前景。


技术实现要素：

3.解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种氯化锂的制药用途，可对于血管紧张素ii(ang ii)诱导的高血压小鼠的降血压及保护内皮的作用。
4.技术方案：氯化锂在制备拮抗血管紧张素ii引起的高血压药物中的应用。
5.氯化锂的剂量为100mg/kg/day。
6.有益效果：使用腹腔注射氯化锂可以有效降低血管紧张素ii引起的高血压，将小鼠血压降低至接近健康小鼠的水平，并且可以明显改善血管紧张素ii引起的内皮依赖性舒张功能受损。此外，在实验中对小鼠监测并未发现腹腔注射氯化锂后小鼠的不良反应。
附图说明
7.图1为各组小鼠血压监测2周线型图；
8.图2各组小鼠血压监测阶段统计图；
9.图3为各组小鼠血管内皮依赖性舒张功能统计图；
10.图4为western blot检测huvec细胞p
‑
gsk3β(ser9)、p
‑
akt(ser473)、p
‑
akt(thr308)、p
‑
enos表达图；
11.图5为western blot检测huvec细胞p
‑
gsk3β(ser9)、p
‑
akt(ser473)、p
‑
akt(thr308)、p
‑
enos表达统计图。
具体实施方式
12.下面的实施例可使本领域技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
13.探究氯化锂对血管功能的影响，步骤为：
14.1)皮下埋入1.008mg/kg/day angⅱ微量渗透泵，造模14天，对照组泵入生理盐水。造模期间，给予对照组和造模组小鼠腹腔注射生理盐水或100mg/kg、200mg/kg的氯化锂，期间持续对血压进行监测，每两天记录一次血压值；
15.2)angⅱ造模两周后，收取各组小鼠主动脉，检测乙酰胆碱(ach)介导的内皮依赖性舒张功能；
16.3)提取人体脐静脉内皮细胞(huvec)，给予甘氨酸，氯化锂以及甘氨酸和氯化锂共同刺激，甘氨酸刺激半小时，氯化锂刺激一小时后，提取细胞蛋白，通过western blot的方法检测其p
‑
gsk3β(ser9)、p
‑
akt(ser473)、p
‑
akt(thr308)和p
‑
enos的表达情况。
17.实施例1
18.以高血压造模小鼠在体腹腔注射氯化锂后血压监测为例，详细实验步骤如下：
19.1.诱导高血压小鼠模型
20.(1)选取36只8周龄健康c57bl/6j雄性小鼠，随机分为4组。小鼠饲养于昼夜时间分配12h/12h，恒温(23
‑
25℃)，恒湿(50
‑
65％)的环境中，并且可以自由地摄取水和饲料。
21.(2)使用生理盐水配制ang ii溶液，浓度为10mg/ml，避光保存。小鼠建立高血压模型的ang ii剂量为1.0mg/kg/day，根据小鼠体重计算出微量泵中使用ang ii的体积，并用生理盐水补足至微量泵总体积，以激活其释放。对照组则使用生理盐水进行微量泵灌注。
22.(3)将小鼠麻醉并称量体重，根据体重在微量泵中加入适量ang ii，并用生理盐水补齐总体积后封闭微量泵。同时，在小鼠背部脖颈处脱毛，碘伏消毒，用眼科镊将颈部皮肤轻轻提起，横向切开1cm左右切口。随后，用钝头剪刀将背部皮肤与肌肉钝性分离，并将微量泵经切口处埋入小鼠背部皮下，缝合伤口，碘伏消毒。最后将小鼠置于37℃热毯上至小鼠苏醒。
23.2.无创血压监测
24.(1)腹腔注射甘氨酸或生理盐水治疗前，使用bp2000无创血压仪测定小鼠血压。正式测量前连续三天进行预测量以让小鼠稳定并熟悉环境。
25.(2)造模后，每天固定时间对四组小鼠分别注射等体积生理盐水、氯化锂(100mg/kg)和氯化锂(200mg/kg)。使用bp2000无创血压仪持续监测小鼠血压变化2周，实验组分为：
①
wt saline；
②
wt angⅱ saline；
③
wt angⅱ 100mg/kg氯化锂；
④
wt angⅱ 200mg/kg氯化锂四组。
26.3.小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能检测
27.造模两周结束后，采用异氟烷吸入麻醉，眼球后动脉取血，收取小鼠主动脉监测乙酰胆碱介导的内皮依赖性舒张功能的变化。
28.(1)准备的溶液：kreb’s(需要现配现用)，800mmol/l氯化钾、去甲肾上腺素(ne，10
‑4mmol/l)、不同浓度的ach(10
‑6、9
×
10
‑6、9
×
10
‑5、9
×
10
‑4、9
×
10
‑3mmol/l)；
29.(2)小鼠称重后，麻醉，固定于鼠板，酒精棉球擦拭胸腹部；
30.(3)将小鼠胸腔打开，从胸骨部分进行开胸，暴露出心脏，剪破右心耳，头皮针经左
心尖处缓慢注射入预冷的kreb's溶液，将主动脉中的血液灌流干净；
31.(4)仔细剪去多余组织，于体式显微镜下在紧贴脊柱处找到主动脉后，从胸主动脉根部至髂总动脉分支处轻轻分离干净，去除干净血管周围的结缔组织和脂肪组织；
32.(5)将主动脉与心脏迅速分离，紧接着放入盛有预冷kreb's缓冲液的平皿中待用；
33.(6)在平皿中进一步分离干净主动脉周围残留脂肪组织后，将剥离出的主动脉等长剪开成约3mm长的小段；
34.(7)预先在dmt血管张力仪的浴槽中加入现配的kreb's缓冲液，预热至37℃，并通入95％o2与5％co2混合气；
35.(8)将分段好的主动脉段小心悬挂于dmt血管张力仪探针上，设定血管初始张力为3.0mn，稳定10分钟；
36.(9)将每段血管的初始张力维持1小时，期间每20分钟更换37℃预热的kreb's缓冲液一次，更换时切勿触碰到探针和血管；
37.(10)平衡1小时后，给予终浓度80mmol/l氯化钾预刺激，血管收缩15分钟，待血管收缩曲线趋于平衡后，37℃预热的kreb's缓冲液冲洗浴槽3次，使血管张力恢复至初始张力，更换时切勿触碰到探针和血管；
38.(11)保持血管平衡30分钟，间隔15分钟更换预热的kreb's缓冲液一次；
39.(12)30分钟后，给予10
‑7mmo/l浓度ne收缩血管，待达到平台后，依次给予10
‑9mmol/l、10
‑8mmol/l、10
‑7mmol/l、10
‑6mmol/l、10
‑5mmol/l的乙酰胆碱，在浓度是10
‑5mmol/l时，血管张力达80％为血管内皮完整的评价标准；
40.(13)实验结束，使用完dmt血管张力仪后，用80％乙酸浸泡浴槽3分钟，并用双蒸水冲洗3次，最后用吸水纸吸干残留液体，关闭混合气。
41.(14)kreb’s配方(ph:7.4)
[0042][0043]
实验结果：
[0044]
1.为了验证氯化锂对angⅱ诱导的高血压的降压作用，我们对四组实验小鼠进行鼠尾压监测。实验结果表明，与angⅱ造模后腹腔注射生理盐水组小鼠相比，angⅱ造模后腹腔注射100mg/kg氯化锂组小鼠能够明显降低血压至正常值范围，angⅱ造模后腹腔注射200mg/kg氯化锂在前期具有更明显的降血压作用，但后期对高血压的保护作用却消失(图1、图2)。
[0045]
2.为了验证氯化锂对angⅱ诱导的内皮依赖性舒张功能受损的保护作用，我们检
测了四组实验小鼠的内皮依赖性舒张功能。结果表明，100mg/kg和200mg/kg氯化锂均能明显改善由angⅱ诱导的内皮依赖性舒张功能受损(图3)。
[0046]
以上动物实验结果充分证明，100mg/kg氯化锂能够降低angⅱ诱导的小鼠血压增高，并改善其内皮依赖性舒张功能。
[0047]
实施例2
[0048]
以氯化锂刺激huvec后检测蛋白表达水平为例，详细步骤如下：
[0049]
1.huvec分离与培养：
[0050]
标本采集方法:使用的是在无菌条件下健康产妇分娩后立即取出的新生儿脐带，挤出脐带血管中的血液，将脐带放入装有含青链霉素双抗的pbs缓冲液的广口瓶中，放置于准备好的冰桶中保存，6小时内进行人脐静脉内皮细胞的分离与培养。
[0051]
(1)于无菌条件下取出新生儿脐带，用解剖剪剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。
[0052]
(2)将脐带静脉一端插上灌胃针并用血管钳固定，经灌胃针接注射器，使用37℃预热的无菌pbs溶液冲洗残血。
[0053]
(3)待静脉内残血除净后，将血管另一端用血管钳夹闭，向脐静脉内灌注ia型胶原酶(1mg/ml)10
‑
15ml，随后夹闭血管两端，用紫外线消毒过后的锡箔纸包好，置于37℃消化10
‑
15分钟，消化过程中每3分钟按摩脐带，促使血管内胶原酶与内皮细胞均匀接触。
[0054]
(4)取出脐带，轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胶原酶收集于50ml离心管中，随后用内皮细胞培养液冲洗血管，终止消化，并将流出液同样收集于离心管。
[0055]
(5)将离心管1000转离心10分钟后弃上清，加入新的内皮细胞培养液重悬细胞，接种到培养瓶中，置于5％co2培养箱，37℃静置培养。
[0056]
(6)24小时后观察细胞状态，更换培养液。
[0057]
2.在huvec中分别给予甘氨酸和氯化锂刺激：
[0058]
(1)将huvec分为四组：对照组、甘氨酸处理组、氯化锂处理组、甘氨酸和氯化锂同时处理组。四组huvec培养至密度为70％
‑
80％时，将原培养液换成无血清培养液。
[0059]
(2)8小时后甘氨酸处理组给予甘氨酸(5mmol/l)刺激30分钟；氯化锂处理组给予氯化锂(20μmol/l)刺激1小时；甘氨酸与氯化锂同时处理组先给予氯化锂(20μmol/l)刺激1小时，随后再给予甘氨酸(5mmol/l)刺激30分钟。
[0060]
3.细胞蛋白的提取：
[0061]
(1)弃去细胞培养液，加入预冷的tbs清洗细胞2次，根据细胞密度加入适量细胞裂解液和磷酸酶抑制剂混合物(二者比例为9:1)。
[0062]
(2)用细胞刮将细胞刮下转移至1.5ml ep管中，放在冰上裂解30分钟后离心，12000rpm，4℃，15分钟，吸取上清，按bca protein assay reagent kit操作指南测定蛋白浓度。
[0063]
(3)蛋白定量后分装蛋白，100℃煮10分钟，让蛋白充分变性，最后将蛋白放于
‑
40℃冰箱保存待用。
[0064]
4.bca法测定蛋白浓度:
[0065]
(1)制备蛋白标准曲线:使用浓度为2mg/ml的蛋白标准品和灭菌过的双蒸水，按以下体积分别加入酶标条中:
[0066][0067]
(2)每个样品孔中加入2μl待测蛋白样品和8μl双蒸水。
[0068]
(3)制备bca工作液:取出bca protein assay reagent kit中的a液和b液，按1:50的比例配制bca工作液，充分混匀后避光放置。
[0069]
(4)吸取200μl，预先混合的bca工作液加入标准曲线孔和样品孔内，轻轻晃匀后放置在37℃避光孵育30分钟。
[0070]
(5)用酶标仪读取波长550nm处的吸光度值；根据标准曲线的浓度和吸光度值绘制一条标准曲线，再根据标准曲线计算各蛋白样品的浓度。
[0071]
5.聚丙烯酰胺凝胶(sds
‑
page)电泳及免疫印迹:
[0072]
(1)配制聚丙烯酰胺凝胶：首先根据目的蛋白分子量选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，以一块1.5mm的10％分离胶为例，按照表1中的配方配制分离胶，将分离胶灌入玻璃板后，再加入无水乙醇覆盖液面，室温静置30分钟。待分离胶凝固之后弃去无水乙醇，再按表1中配方配制3％浓缩胶，将齿梳轻轻插入，避免气泡，室温静置20分钟。
[0073]
表1:聚丙烯酰胺凝胶配方
[0074][0075]
(2)取出蛋白样品，100℃加热5分钟，低速离心后待用。
[0076]
(3)电泳：将玻璃板取下固定在电泳槽内，倒入电泳缓冲液，使内槽液面高于外槽，先用微量进样针冲洗泳道，蛋白上样结束后，盖上电泳槽盖，将电压调为80v恒压进行电泳，当蛋白进入分离胶以后，再将电压调为120v，待溴酚蓝到分离胶底部时可停止电泳。
[0077]
(4)转膜：配制蛋白转膜缓冲液，倒入转膜盘中，放置好转膜夹，依次放上黑色海绵和滤纸片。电泳结束后，取出凝胶，切去浓缩胶，将分离胶小心转移至转膜夹的滤纸片上，pvdf膜经甲醇溶液激活15秒后取出，放置在分离胶上，用滚轴去除气泡后夹紧转膜夹，将转膜夹放入转膜槽中，凝胶对准负极，pvdf膜对准正极，350ma转膜2小时。
[0078]
(5)封闭：转膜结束后，取下pvdf膜，先用tbs
‑
t(0.05％吐温
‑
20)洗涤5分钟，再将膜浸泡在5％bsa/tbs
‑
t封闭液中，室温封闭2小时。
[0079]
(6)孵育一抗：封闭结束后将膜放在塑封袋内，用2.5％bsa/tbs
‑
t作为抗体稀释液，按抗体说明书加入适量抗体，混匀后加入塑封袋内，使其与膜充分接触，4℃摇动孵育过
夜。
[0080]
(7)孵育二抗：次日，将膜取出，弃去一抗，用tbs
‑
t洗3次，每隔10分钟换1次液。孵育二抗:用2.5％bsa/tbs
‑
t作为抗体稀释液，加入适量二抗，室温孵育1.5小时。
[0081]
(8)洗膜：弃去二抗，用tbs
‑
t洗膜4次，每隔10分钟换1次液。
[0082]
(9)显影：将ecl显影液a液与b液按1:1比例充分混匀，均匀滴加在pvdf膜表面，通过荧光成像系统观察实验结果，选择清晰合适的显影图片保存。
[0083]
(10)运用image lab软件对图片进行灰度分析，统计实验结果。
[0084]
实验结果：
[0085]
为了探究甘氨酸和氯化锂对内皮细胞的影响，首先使用甘氨酸、氯化锂、甘氨酸加氯化锂刺激人体脐静脉内皮细胞，然后收集细胞蛋白，western blot检测p
‑
gsk3β(ser9)、p
‑
akt(ser473)、p
‑
aktt(thr308)、p
‑
enos的表达水平(图4、图5)。结果表明，甘氨酸与氯化锂刺激后，p
‑
gsk3β(ser9)、p
‑
akt(ser473)、p
‑
akt(thr308)、p
‑
enos的表达水平均明显增加。以上的离体实验结果充分证明，氯化锂可以激活p
‑
gsk3β(ser9)、p
‑
akt(ser473)、p
‑
akt(thr308)、p
‑
enos，进而改善内皮功能。