一种生防产酶溶杆菌OH11来源的群体感应淬灭蛋白及其应用的制作方法

一种生防产酶溶杆菌oh11来源的群体感应淬灭蛋白及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种生防产酶溶杆菌oh11来源的群体感应淬灭蛋白及其应用。


背景技术：

2.群体感应(quorum sensing，qs)是指微生物在生长过程中能合成并释放某种特定的信号分子(又称为自诱导物)，其浓度随群体微生物密度增加而增加，当浓度达到一定阈值时，能够启动自身相关基因的表达，从而调控微生物群体行为的现象；群体感应这种个体与个体间的化学通讯系统首先是在细菌中发现，它对病原细菌致病基因表达、生物膜形成、与寄主共生、运动性以及抗生素(抗菌活性物质)合成等方面发挥着至关重要的作用，因此群体感应成为科学家们关注的热点(miller,m b and bassler,b l,2001)。革兰氏阴性菌中包括一类以n-酰基-高丝氨酸内酯(n-acyl-homoserine lactones，ahls)为信号分子和一类以不饱和脂肪酸(diffusible signaling factor，dsf)为信号分子的典型群体感应信号系统。
3.目前人们已将qs系统中群体感应信号分子作为生物防治细菌病害的新靶标，建立了一种控制细菌感染的“群体感应猝灭”方法，即通过群体感应信号的失活使细菌病原体的群体感应系统瘫痪(zhang,x,zhang,l and wang,l,et al.,2001)。根据群体感应通讯系统的特点及其组成，目前群体感应淬灭方式主要分为以下两种：1.降解环境中群体感应信号分子，使其处于低浓度水平从而无法启动群体感应系统来调控相关基因表达(zhang,x,zhang,l and wang,l,et al.,2001)；2.阻碍群体感应信号分子与其受体蛋白结合，干扰群体感应通讯(rasmussen,t b and givskov,m,2006)。然而目前主流使用的n-酰基高丝氨酸内酯酶，其耐热性差且比活力较低，限制了其发挥空间，而其他群体感应干扰剂运用成本高，使用有限；因此寻找新的群体感应淬灭途径意义非凡。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种群体感应淬灭蛋白及其应用，本发明为以群体感应系统为靶点的微生物新型疗法提供新思路新技术。
5.本发明的第一个方面是提供一种群体感应淬灭蛋白le0959，其包含seq id no:1所示的氨基酸序列，或者将seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能够抑制群体感应的由seq id no:1衍生的蛋白质。
6.在一种实施例中，本发明所述的群体感应淬灭蛋白le0959，其氨基酸序列如seq id no:1所示，其是由458个氨基酸残基组成的多肽，预测分子量48.65kda，蛋白等电点为5.82。
7.本发明公开的如seq id no:1所示的淬灭蛋白le0959，来自产酶溶杆菌oh11(lysobacter enzymogenes)。
8.本发明的第二个方面是提供编码本发明第一方面所述的群体感应淬灭蛋白
le0959的基因。
9.在一种实施例中，本发明所述的基因，其核苷酸序列如seqid no:2所示，或者在严格条件下与seqid no:2限定的dna序列杂交且编码具有能够抑制群体感应的蛋白质的dna分子。
10.所述严格条件可为在0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
11.在一种具体实施例中，本发明所述的基因，其核苷酸序列如seqid no:2所示，其序列全长1377bp，存在一个开放阅读框(orf)。
12.本发明的第三个方面在于提供一种包含本发明所述的编码群体感应淬灭蛋白le0959的基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
13.在本发明的一种实施例中，本发明所述的包含本发明所述的编码群体感应淬灭蛋白le0959的基因的重组表达载体，是将le0959基因克隆至组成型表达载体pbbrmcs-5中。
14.本发明的第四个方面是提供本发明所述的蛋白le0959、编码基因、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在微生物群体感应淬灭中的应用。
15.本发明所述的微生物存在ahl(n-酰基-高丝氨酸内酯，n-acyl-homoserine lactones)群体感应系统，在一些实施例中，所述的微生物存在ahl(n-酰基-高丝氨酸内酯，n-acyl-homoserine lactones)群体感应信号系统，但不具有dsf(不饱和脂肪酸，diffusible signaling factor)群体感应信号系统。
16.在本发明的一些具体的实施例中，本发明所述的存在ahl群体感应系统的微生物包括并不限于荧光假单胞菌2p24(pseudomonas fluorescens)，该菌是属于荧光假单胞属，也是一种革兰氏阴性生防细菌，广泛存在于植物根际中。
17.本发明的第五个方面是提供一种微生物群体感应淬灭方法，采用本发明所述的蛋白le0959、编码基因、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌抑制群体感应信号分子的产生。
18.本发明所述方法中的群体感应信号为ahl(n-酰基-高丝氨酸内酯，n-acyl-homoserine lactones)群体感应信号。
19.在一种具体的实施例中，本发明公开的微生物群体感应淬灭方法为本发明所述的蛋白le0959与群体感应信号分子合成蛋白直接相互作用，从源头上抑制群体感应信号分子的产生，从而使群体感应信号系统瘫痪。
20.发明人将产酶溶杆菌oh11中le0959基因克隆至组成型表达载体pbbrmcs-5中，构建重组表达载体pbbr-le0959，然后将重组表达载体转化至荧光假单胞2p24中，实验结果表明le0959基因表达显著减少荧光假单胞2p24中ahl信号分子的产量；同时将重组表达载体pbbr-le0959转化至荧光假单胞2p24信号分子合成基因缺失突变体δpcoi中，在该突变体中添加ahl信号分子孵育一段时间后，仍然检测到ahl信号分子的存在，表明le0959基因不是通过降解ahl信号分子来减少荧光假单胞2p24中ahl信号分子浓度；接下来发明人将产酶溶杆菌le0959基因与荧光假单胞ahl信号分子合成pcoi基因分别克隆至pet30a(带有his标签)载体与pgex(带有gst标签)载体上，进行pull down实验证明le0959与pcoi具有直接相互作用。由此表明淬灭蛋白le0959通过与群体感应信号分子合成蛋白直接相互作用抑制群体感应信号分子的产生。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明公开的新型群体感应淬灭蛋白能与群体感应信号合成蛋白直接相互作用，从源头上抑制信号分子的合成，本发明公开的新型群体感应淬灭方式及其淬灭蛋白，为以群体感应系统为靶点的新型疗法提供新思路新技术。
附图说明
22.图1重组载体电泳验证图；
23.图2生长曲线检测图；
24.图3ahl信号分子含量检测图；
25.图4pull down实验检测图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行，实施例所用的材料需要本领域的人可通过公众途径获得。
27.以下实施例中所用的大肠杆菌菌株(escherichia coli)dh5α与bl21(de3)均购置大连宝生物公司(takara)。根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)jza1由南京农业大学朱军老师惠赠，参考文献：高轶静,钟增涛,郑会明,王卉,朱军.华癸根瘤菌中自体诱导物的初步研究[j].微生物学报,2005(01):19-22.中公开。耐油具柄菌muricauda olearia th120由中国海洋大学王岩老师惠赠，参考文献：tang k,su y,brackman g,et al.moml,a novel marine-derived n-acyl homoserine lactonase from muricauda olearia[j].appl environ microbiol,2015,81(2):774-782.中公开。荧光假单胞菌2p24与δpcoi突变体由广西大学吴小刚老师惠赠，参考文献：wei h.l.,wang y.,zhang l.q.and tang w.2004a.identification and characterization of biocontrol bacterial strain 2p24and cpf-10.acta phytopathol.sin.34:80
–
85.中公开。产酶溶杆菌oh11由发明人分离并保存(专利申请号为：200710190998.6，菌株保藏号为cgmcc no.1978)。大肠杆菌菌株使用lb培养基培养(购自于索莱宝公司)，培养温度为37℃，液体培养的转速为225rpm/min。产酶溶杆菌使用lb培养基培养，培养温度为28℃，液体培养的转速为225rpm/min。庆大霉素(gm)、卡那霉素(km)、氨苄青霉素(amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)、(onpg)均购置南京助研生物公司，引物合成与测序由苏州金唯智公司完成。内切酶购自takara公司，同源重组酶购自诺唯赞公司。n-(3-oxodecanoyl)-l-homoserine lactone(n-3-氧-十二烷酰-l-高丝氨酸内酯，3-oxo-c12-hsl)为sigma(usa)产品。pbbrmcs-5、pet30a、pgex与带有msfgfp载体购自于invitrogen公司。
[0028]
实施例1重组表达载体的构建
[0029]
1)pbbr-le0959表达载体的构建
[0030]
以oh11菌株的基因组dna为模板，使用引物pbbr-le0959-f和pbbr-le0959-r(表1)pcr扩增目的基因le0959，片段用限制性核酸内切酶hindiii和xbai双酶切后，用t4连接酶连接于同样经hindiii和xbai双酶切的pbbrmcs-5载体上，连接产物经热激转化入大肠杆菌dh5α菌株，涂布于含有gm 25μg/ml的lb固体平板上，37℃培养24小时后挑选长出来的转化
子，以引物pbbr-f和pbbr-r进行pcr验证，电泳图如图1所示。将条带大小正确的转化子送到苏州金唯智公司进行测序，测序无误后进行质粒提取得到重组质粒pbbr-le0959。
[0031]
2)pet30a-pcoi、pgex-le0959、pbbr-gfp、pgex-gfp、pbbr-moml均按此方法构建表达载体，所需引物序列及相关信息见表1。pcoi基因扩增模板选用荧光假单胞菌2p24，gfp基因扩增模板选用msfgfp质粒载体，moml基因扩增模板选用耐油具柄菌muricauda olearia th120。
[0032]
表1重组表达载体构建引物信息
[0033][0034]
实施例2重组菌及对照菌的获得
[0035]
1)电转化感受态的制备
[0036]
从固体培养皿上挑取产酶溶杆菌oh11单菌落接种于lb液体培养基中28℃过夜培养，以1:50的比例转接于新鲜的50ml lb液体培养基中继续培养至od600为0.6-0.8；冰上放在1小时后6000rpm，4℃离心，收集菌体；用预冷的灭菌的10％甘油溶液悬浮菌体，6000rpm，4℃离心，收集菌体；重复上一步骤2次；用2ml10％甘油溶液悬浮菌体并分装于2ml灭菌的离心管中，每管100μl,用液氮速冻后保存于-80℃备用。荧光假单胞2p24野生型与δpcoi突变体使用同样方法制备感受态细胞。
le0959的β-半乳糖苷酶活性显著低于2p24重组菌pbbr-gfp，同样表明2p24重组菌pbbr-le0959中ahl产量显着低于2p24重组菌pbbr-gfp，因此结果说明le0959基因的表达显著降低了荧光假单胞2p24的ahl信号分子产量。
[0047]
3)δpcoi重组菌pbbr-le0959与pbbr-gfp中ahl信号分子检测
[0048]
接下来我们采用上述报告菌平板检测ahl信号分子的方法检测了le0959基因是否具有降解ahl信号分子的能力，我们选取δpcoi重组菌pbbr-le0959、pbbr-gfp、pbbr-moml与δpcoi突变体作为待测菌株，moml为具有ahl信号降解能力的ahl内酯酶。我们将待检测菌株接种于5ml液体lb试管中，于28℃摇床培养至od
600
为1，然后添加终浓度为100nm n-(3-oxodecanoyl)-l-homoserine lactone(n-3-氧-十二烷酰-l-高丝氨酸内酯，3-oxo-c12-hsl)，分别在添加信号后0h、3h、6h取5μl点于制备好的报告菌平板上，28℃孵育12h后观察报告菌平板变色情况。实验结果如图3c所示，δpcoi重组菌pbbr-moml随着时间的增加，蓝色晕圈逐渐变小，表明反应体系中ahl信号分子残留量逐渐减少，6h后几乎无ahl信号分子残留，而δpcoi突变体、δpcoi重组菌pbbr-le0959与pbbr-gfp随着时间减少，三者之间蓝色晕圈大小无显著性差异，表明le0959基因不具备降解ahl信号分子的能力。
[0049]
实施例4pull down实验检测
[0050]
1)重组菌和对照菌的诱导
[0051]
从固体培养皿上挑取单菌落重组菌pet30a-pcoi、pgex-le0959和对照菌pgex-gfp接种于液体lb培养基中37℃过夜摇晃培养，然后1:100转接入新鲜的200ml液体lb培养基中，培养至od
600
为0.4-0.6后加入终溶度为2mmol的iptg诱导，置于15℃培养12h，6000rpm，10min离心收集菌体，用1
×
pbs清洗菌体，8ml1
×
pbs重悬后转入10ml离心管中，加入80μl pmsf，置于冰上进行超声破碎菌体，20％功率间隔4s工作2s，破碎10min；12000rpm，10min离心取上清，用于gst pull-down实验。
[0052]
2)gst pull-down实验检测
[0053]
将待检测的蛋白溶液按等比例混合(比例可根据蛋白量调整)于2ml离心管中，加入处理过(用含有1％triton x-100的1
×
pbs溶液处理)的50μl gst琼脂珠悬浮液，4℃ 360度旋转孵育4-12h，然后4℃，500g，5min离心去上清，用1.5ml预冷的含有1％triton x-100的1
×
pbs溶液悬浮清洗gst琼脂珠，不可吸打，小心混匀，重复清洗3遍，直接加入5
×
loading buffer沸水处理5min，12000rpm,2min离心取上清用于western检测；
[0054]
使用购于全式金公司2％的蛋白电泳胶，150伏电泳30min，取胶，浸泡于转膜液(tris 5.8g,，gly 2.9g,，m-oh 200ml，加水至1000ml)中，剪取与胶同样大小的pvdf膜和滤纸，滤纸浸泡于转膜液中，pvdf膜浸泡于甲醇中；转膜，按顺序放置滤纸，pvdf膜，胶，滤纸，电压20v,转膜25min；封闭，配置封闭液:用20ml tbst溶液溶解1g脱脂奶粉配成5％的牛奶溶液，将膜浸没于封闭液中缓慢摇荡lh；孵育一抗，配制5％的牛奶(tbst溶解)，1:5000稀释抗体，将稀释好的抗体和膜一起孵育1h；洗涤，用tbst洗三次，每次10min；孵育二抗，配制5％的牛奶(tbst溶解)，用hrp标记的二抗，1:5000稀释抗体，稀释后加入牛奶中，与膜孵育1h；冼涤，用tbst洗三次，每次10min；显色，运用增强化学发光法(ecl)显色。ecl显色原理:鲁米诺在免疫测定中既用作标记物，也作为过氧化物酶的底物，ecl底物含h2o2和鲁米诺，在hrp(辣根过氧化物酶)作用下发出荧光，实验结果如图4所示，淬灭蛋白le0959与群体感应信号合成蛋白pcoi直接相互作用。
[0055]
综上结果表明，本发明公开的新型群体感应淬灭蛋白le0959能与群体感应信号合成蛋白直接相互作用，从而抑制信号分子的合成，该淬灭蛋白与淬灭方式为以群体感应系统为靶点的新型疗法提供新思路新技术。