一种刺五加标准汤剂质量控制方法与流程

1.本发明涉及中药材质量控制技术领域，尤其涉及一种刺五加标准汤剂质量控制方法。


背景技术：

2.刺五加为五加科植物，它的根、根茎和茎，茎叶、果实均可作药用。又名五加参、刺拐棒，主要分布在我国东北、华北地区，以及朝鲜、日本及俄罗斯等地，在祖国医学中作为药物广泛应用已有悠久的历史。具有益气健脾、补肾安神的功效，用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦。
3.刺五加中的主要活性成分为黄酮类、皂苷类及多糖类化合物，皂苷类化合物含量最高的是紫丁香苷和刺五加苷e。目前，刺五加的检测方法主要为液相色谱法，然而仅采用现有的液相色谱法来检测刺五加汤剂是有缺陷的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种刺五加标准汤剂质量控制方法是十分必要的，更有利于刺五加药材的质量控制。


技术实现要素：

4.本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种刺五加标准汤剂质量控制方法，目的是便于更好的控制刺五加汤剂的质量。
5.基于上述目的，本发明提供了一种刺五加标准汤剂质量控制方法，所述方法是通过对刺五加标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及紫丁香苷含量测定，将标准汤剂含量标准限度为每1g含紫丁香苷为7.5
‑
13.5mg，其中，干浸膏出膏率采用煎煮法测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及紫丁香苷含量测定均采用液相色谱法测定。
6.所述煎煮法是取刺五加饮片加水浸泡25
‑
30分钟，煎煮两次，第一次25
‑
35分钟，第二次18
‑
22分钟，趁热滤过，合并滤液，浓缩，冷冻干燥，即得。
7.所述照薄层色谱法包括如下步骤：
8.a1、取刺五加汤剂经加醇超声处理、过滤、滤液蒸干、残渣加甲醇溶解，得供试品溶液a；
9.a2、取刺五加对照药材经热回流、过滤、滤液蒸干、残渣加甲醇溶解得对照药材溶液a；
10.a3、设置薄层色谱条件：硅胶g薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各10ul；展开剂：三氯甲烷、甲醇及水以体积比6:2:1作为下层溶液；置于紫外光灯下检视。
11.所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法中的热浸法。
12.所述特征图谱及紫丁香苷含量测定采用液相色谱法测定的方法包括分别吸取刺五加对照品溶液b及供试品溶液b注入液相色谱仪，测定即得；其中，采用的色谱条件：色谱柱：c18；流动相：以30％乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱；流速：
0.8
‑
1.2ml/min；柱温：20℃；检测波长：220nm。优选的，流速为1.0ml/min。
13.所述供试品溶液b的制备方法是取刺五加标准汤剂样品，加入125倍量的25
‑
50％甲醇，之后经超声、放冷、称定重量、25
‑
50％甲醇补足减失重量，摇匀，即得。优选的，采用25％甲醇。
14.所述特征图谱采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次的供试品注入液相色谱仪，测定，并对制定的共有特征峰进行相似度的评价。
15.所述特征图谱及紫丁香苷含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次供试品分别于0h、2h、4h、8h、12h、36h进样，测定峰面积，用于测试供试品溶液的稳定性。
16.所述特征图谱及紫丁香苷含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括紫丁香苷对照品溶液c连续进样测定峰面积，用于测试色谱仪的精密度是否良好。
17.所述紫丁香苷含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括称取供试品加入紫丁香苷对照品溶液进行测试紫丁香苷平均加样回收率的步骤。
18.本发明的有益效果：
19.1、本发明通过对刺五加标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及含量测定进行了研究，能够有效控制刺五加标准汤剂的质量。
20.2、刺五加饮片依煎煮法制得刺五加标准汤剂，紫丁香苷平均含量为10.59mg/g，含量范围为9.77
‑
11.77mg/g。平均转移率为77.86％，转移率范围为65.29％～99.72％，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，按均值70％～130％计算，范围为7.41
‑
13.77mg/g,故拟定本标准汤剂含量标准限度为每1g含紫丁香苷为7.5mg～13.5mg。刺五加供试品平均转移率为77.86％，紫丁香苷含量转移率允许范围为54.50％～101.22％。结果表明，15批次标准汤剂中紫丁香苷转移率均在允许范围之内，可为刺五加配方颗粒质量研究提供参考依据。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明15批次标准汤剂tlc图谱；
23.图2为空白溶剂对比图；s1为对照药材；s2为供试品；s3为空白溶剂(25％甲醇)；
24.图3为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；
25.图4为紫丁香苷对照品图谱；
26.图5为刺五加对照药材特征图谱；
27.图6为15批刺五加中药材叠加特征图谱；
28.图7为15批刺五加标准汤剂叠加特征图谱；
29.图8为紫丁香苷标准曲线图。
具体实施方式
30.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照
附图，对本发明进一步详细说明。
31.需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
32.本发明提供了一种刺五加标准汤剂质量控制方法，该质量控制方法是通过对刺五加标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及紫丁香苷含量测定，将标准汤剂含量标准限度为每1g含紫丁香苷为7.5
‑
13.5mg，其中，干浸膏出膏率采用煎煮法测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及紫丁香苷含量测定均采用液相色谱法测定。下面通过具体的实例进行说明。
33.刺五加标准汤剂的制备方法(煎煮法)：取刺五加饮片100g，置煎煮容器中，加水适量(至没过药材约4～5cm)，浸泡30分钟，煎煮两次，第一次30分钟，第二次20分钟，趁热滤过，合并滤液，低温减压浓缩，冷冻干燥，即得。
34.干浸膏出膏率测试
35.取15批次刺五加饮片，按以上制备方法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为4.79％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为3.5％～6.2％。
36.表1：出膏率
[0037][0038]
上述结果表明，15批次标准汤剂干浸膏出膏率为4.48％～5.05％，均符合拟定限度范围。
[0039]
性状：根据15批次标准汤剂的实物性状特征，描述为黄色至黄棕色的粉末；气微香，味微辛。
[0040]
薄层鉴别方法：本发明的产品为单味饮片刺五加的干燥提取物，参考《中国药典》
刺五加“薄层鉴别”项下的方法，用刺五加对照药材作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：
[0041]
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
[0042]
供试品溶液制备：取本品0.5g，加70％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0043]
对照药材溶液取刺五加对照药材2.5g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0044]
薄层色谱条件：薄层板：硅胶g薄层板；点样量：供试品溶液与对照药材溶液各10ul；展开剂：三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水(6∶2∶1)的下层溶液；检视：置紫外光灯(365nm)下检视。
[0045]
结果：分别在三种温湿度条件下试验，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。15批次标准汤剂tlc图谱(见图1)。
[0046]
浸出物测定：取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果见(表2)
[0047]
表2：浸出物测定结果
[0048][0049][0050]
上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为33.06％，参考标准允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于23％。15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。
[0051]
特征图谱测试：试验方法
[0052]
色谱条件：色谱柱：c18(4.6
×
250mm，5μm)；流动相：以30％乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：20℃；检测波长：220nm。
[0053]
表3
[0054][0055]
参照物溶液的制备：取刺五加对照药材1g，加25％甲醇25ml，超声30min，滤过，取续滤液，即得。取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加25％甲醇制成每1ml含60ug的溶液。
[0056]
供试品溶液的制备：取刺五加标准汤剂样品约0.2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失重量，摇匀，即得。
[0057]
测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0058]
专属性考察：取供试品用溶剂25％甲醇10ul,按以上色谱条件进行测定，试验表明：空白溶剂无干扰(见图2)。
[0059]
方法学考察：
[0060]
提取方法的考察：分别以超声30min及回流30min不同的提取方法制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，超声30min与回流30min的主峰个数一致，主峰总峰面积数据rsd小于3％，两组数据未有显著性差异(见表4)，故选择样品提取方式为操作更简捷的超声30分钟。
[0061]
表4不同提取方法对比
[0062][0063]
提取时间的考察：分别以不同的超声时间制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，三种超声时间，主峰个数一致，主峰总峰高rsd值小于3.0％，超声时间对供试品的主峰总面积影响不明显(见表5)，但是综合考虑含量的影响因素，超声30min的含量较高，故确定供试品超声时间为超声30分钟。
[0064]
表5不同提取时间对比
[0065][0066]
提取溶剂的考察:分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，主峰个数25％甲醇最多，四个样品的数据之间的rsd大于3％，提取溶剂为25％甲醇时，主峰总峰面积最大(见表6)，95％乙醇提取的样品含量数值明显偏低，四个数值之间的rsd大于3％，几个数值之间存在显著差异。故确定以25％甲醇为提取溶剂。
[0067]
表6不同提取溶剂对比
[0068][0069]
提取溶剂用量选择：分别以不同溶剂用量制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，提取溶剂量为50ml时，单位主峰总峰面积最大(见表7)，但与25ml的数据没有显著性差异，其中25ml的溶剂用量，含量最好，故确定供试品溶剂用量为25ml。
[0070]
表7不同溶剂用量对比
[0071][0072]
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取刺五加标准汤剂样品约0.2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
[0073]
特征图谱分析方法验证
[0074]
重复性试验：取同批样品(批号：210601)约0.2g，共6份，按上述方法进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有6个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的6个共有特征峰进行相似度的评价，相似度均＞0.9(见表7)，表明该方法重现性良好。
[0075]
表7重复性试验特征图谱相似度评价结果
[0076] s1s2s3s4s5s6s1111111s2111111s3111111s4111111s5111111s6111111
[0077]
精密度试验：取下紫丁香苷对照品溶液，连续进样6针，并按上述试验方法测定其峰面积，计算紫丁香苷峰面积的rsd值为1.17％，表明仪器精密度良好(见表8)。
[0078]
表8精密度试验
[0079][0080]
稳定性试验：取一批样品约0.2g，按“8.1”项下试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、36h进样，测定其峰面积，计算紫丁香苷峰面积的rsd值为0.61％，试验表明供试品溶液在36小时内较稳定(见表9)。
[0081]
表9稳定性试验
[0082][0083]
标准汤剂特征图谱表征分析
[0084]
标准汤剂特征图谱测定
[0085]
照上述拟定的特征图谱分析方法，测定15批刺五加标准汤剂及其制备使用的15批次药材特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有6个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中与紫丁香苷对照品参照物相对应的峰为峰3，共有峰特征图谱见(图4～7)。
[0086]
特征色谱图相似度评价：采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的6个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批刺五加饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上(见表10)，表明本标准汤剂质量相对稳定。以紫丁香苷参照物峰相对应的峰为s峰，计算共有峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围见(表11、表12)。
[0087]
表10：15批标准汤剂特征图谱相似度评价结果
[0088]
[0089][0090]
表11：15批标准汤剂共有峰相对保留时间
[0091][0092]
表12：15批标准汤剂共有峰相对保留时间范围
[0093][0094][0095]
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，且符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批中试
样品的特征图谱进行相似度评价，标定了6个共有特征峰，其中峰3为紫丁香苷参照物特征峰，以紫丁香苷参照物相对应的峰为s峰，计算其他特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.73、0.80、1.15、1.17、1.53。考虑试验操作误差，两峰相对保留时间允许范围为
±
10％。
[0096]
含量测定：根据药典刺五加浸膏的检测方法，刺五加水提液的主要成分未紫丁香苷，故以紫丁香苷作为含量指标成份。
[0097]
试验方法如上述特征图谱测试中的液相色谱法。
[0098]
色谱条件：色谱柱：c18(4.6
×
250mm，5μm)；以30％乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟0.8ml；柱温为20℃；检测波长为220nm。
[0099]
含量测定方法学验证
[0100]
重复性试验：取同批标准汤剂样品约0.2g，共6份，按上述9.1试验方法进行测定，计算样品中紫丁香苷含量的平均值为11.2642mg/g，rsd值为1.22％，试验表明该方法重现性良好(见表13)。
[0101]
表13重复性试验
[0102][0103]
线性与范围试验取紫丁香苷对照品溶液(浓度为0.06643mg/ml)，分别吸取1ul，2ul，5ul，10ul，20ul，按“9.1.1”项下色谱条件进行测定。以紫丁香苷峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：y＝5e 06x 21460r2＝0.9999，可知紫丁香苷在0.06643ug～1.3286ug范围内与其峰面积具有良好的线性关系(见表14、图8)。
[0104]
表14紫丁香苷线性关系考察结果
[0105][0106]
加样回收率试验精密称取样品(紫丁香苷含量为11.2662mg/g)约0.1g，共6份，各加入已知浓度的紫丁香苷对照品溶液(0.204mg/ml)5ml，按以上9.1试验方法进行测定，计算紫丁香苷平均加样回收率为104.29％，rsd为0.95％，表明该法回收率良好(见表15)。
[0107]
表15加样回收率试验结果
[0108][0109]
药材含量测定刺五加药材经产地初加工成约1cm段片，经净制后加工成刺五加饮片，净制过程中未经水洗、烘烤，至通过筛选，其紫丁香苷含量不会发生变化；因此刺五加饮片特征色谱图及紫丁香苷含量参考其药材数据。
[0110]
照上述拟定的含量分析方法，测定15批刺五加标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片紫丁香苷含量，结果见(表16～17)。
[0111]
表16：15批刺五加饮片紫丁香苷测定结果
[0112][0113]
表17：15批刺五加标准汤剂紫丁香苷测定结果
[0114][0115]
含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算紫丁香苷含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。刺五加标准汤剂由刺五加饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其紫丁香苷含量转移率见表(18)。
[0116]
表18：15批刺五加标准汤剂紫丁香苷含量转移率
[0117][0118]
由以上数据可知，刺五加饮片依方案煎煮制得刺五加标准汤剂，紫丁香苷平均含量为10.59mg/g，含量范围为9.77
‑
11.77mg/g。平均转移率为77.86％，转移率范围为65.29％～99.72％，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，按均值70％～130％计算，范围为7.41
‑
13.77mg/g,故拟定本标准汤剂含量标准限度为每1g含紫丁香苷为7.5mg～13.5mg。本品平均转移率为77.86％，紫丁香苷含量转移率允许范围为54.50％～101.22％。结果表明，15批次标准汤剂中紫丁香苷转移率均在允许范围之内，可为刺五加配方颗粒质量研究提供参考依据。
[0119]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0120]
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。